选修三同步导学12 基因工程的基本操作程序理解+掌握+应用.docx
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选修三同步导学12基因工程的基本操作程序理解+掌握+应用
1．2
基因工程的基本操作程序
1．获取目的基因的常用方法有：
从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因。
2．基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
3．一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。
4．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。
5．培育转基因动物时，受体细胞一般是受精卵，目的基因的导入方法常用显微注射技术。
6．检测目的基因是否导入和转录，常用分子杂交技术；检测是否翻译，常用抗原—抗体杂交技术。
目的基因的获取
[自读教材·夯基础]
1．目的基因
（1）主要是指编码蛋白质的基因。
（2）也可以是一些具有调控作用的因子。
2．获取方法
（1）从基因文库中获取：
①基因文库的含义：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
②
（2）利用PCR技术扩增目的基因：
①原理：
DNA复制。
②前提条件：
有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
③条件：
DNA模板、引物、热稳定DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
④扩增过程：
：
模板DNA受热解旋为单链
↓
：
冷却后，引物结合到互补DNA链上
↓
：
在热稳定DNA聚合酶作用下，从引物起始进行互补链的合成
（3）
1．探讨基因文库、基因组文库、cDNA文库之间的关系。
提示：
基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库只含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库。
2．从酶的角度分析PCR技术扩增DNA与DNA体内复制的不同点。
提示：
①PCR技术扩增DNA不需要解旋酶；②PCR技术需要的DNA聚合酶应具有热稳定性。
[跟随名师·解疑难]
1．提取目的基因方法的比较
方
法
基因文库的构建
PCR技术扩增
人工合成
基因组文库
部分基因文
库（如cDNA
文库）
过
程
供体细胞中的DNA
限制酶
连接
导入
受体细胞
↓
外源DNA
扩增，产生
特定性状
分离
目的基因
目的基因的
mRNA
反转录
单链DNA
合成
双链DNA
插入
载体
导入
受体菌群
（cDNA文库）
分离
目的基因
目的基因
DNA
高温
解链
单链DNA
与引物结
合、DNA
聚合酶
大量目
的基因
蛋白质的氨
基酸序列
推测
mRNA的核
苷酸序列
推测
基因的核
苷酸序列
化学
合成
目的基因
优
点
操作简单
专一性强
可在短时间内大量扩增目的基因
专一性强，可产生自然界中不存在的新基因
缺
点
工作量大、盲目性大、专一性差
操作过程较麻烦，技术要求过高
需要严格控制温度，技术要求高
适用范围小
2．PCR技术与生物体内DNA复制的比较
DNA复制
PCR技术
区别
解旋方式
解旋酶催化
DNA在高温作用下变性解旋
场所
细胞内（主要在细胞核内）
细胞外（主要在PCR扩增仪内）
酶
DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等
耐热的DNA聚合酶（Taq聚合酶）
温度条件
细胞内温和条件
需控制温度，在较高温度下进行
合成的对象
DNA分子
DNA片段或基因
联系
①模板：
均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成
②原料：
均为四种脱氧核苷酸
③酶：
均需要DNA聚合酶进行催化
④引物：
均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
[特别提醒]
（1）基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达。
（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。
（3）热稳定DNA聚合酶（Taq聚合酶）能在高温下保持其活性，是PCR技术关键的工具之一。
基因表达载体的构建和目的基因的导入
[自读教材·夯基础]
1．基因表达载体的构建
（1）目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传和表达。
（2）组成：
2．将目的基因导入受体细胞
（1）导入植物细胞的方法：
②基因枪法：
常用于单子叶植物。
③花粉管通道法：
目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
（2）导入动物细胞：
①方法：
显微注射技术。
②常用受体细胞：
受精卵。
（3）导入微生物细胞：
①原核生物特点：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
②方法：
感受态细胞法，即用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（这种细胞称为感受态细胞）。
1．思考基因表达载体的构建需要哪些工具酶。
提示：
限制酶、DNA连接酶。
2．结合教材P13资料卡分析，用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？
试分析原因。
提示：
需要。
因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。
3．为什么动物的体细胞不能作为受体细胞？
提示：
动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。
[跟随名师·解疑难]
1．基因表达载体的构建过程
将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子（重组质粒）。
构建过程如图所示：
2．将目的基因导入受体细胞的方法比较
受体细胞
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
以农杆菌转化法为例：
将目的基因插入Ti质粒的T DNA上
↓
转入农杆菌中
↓
导入植物细胞
↓
整合到受体细胞的DNA上
提纯含目的基
因的表达载体
↓
显微注射
↓
受精卵发育
↓
具有新性
状的个体
Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
[特别提醒]
（1）完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，连接产物有目的基因—目的基因，目的基因—运载体和运载体—运载体三种。
（2）将基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌的常用方法是Ca2＋处理法。
Ca2＋（或CaCl2溶液）对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。
目的基因的检测与鉴定
[自读教材·夯基础]
1．分子水平的检测（连线）
2．个体水平的鉴定
（1）抗虫或抗病的接种实验。
（2）对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较。
1．检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：
用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
2．DNA分子杂交的原理是什么？
有哪些应用？
提示：
碱基互补配对原则。
可用于亲子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关系确定等。
[跟随名师·解疑难]
目的基因的检测与鉴定归纳
目的基因的获取方法
[例1] 为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。
下图是获取植酸酶基因的流程。
据图回答：
（1）图中基因组文库________（填“小于”“等于”或“大于”）cDNA文库。
（2）B过程需要的酶是__________；A、C过程中______（填“可以”或“不可以”）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。
（3）目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中__________和____________________________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是______________________________________。
[思路点拨]
[精讲精析] 分析获取植酸酶基因的流程图可知，图中基因组文库大于cDNA文库。
B过程需要的酶应该是逆转录酶；A、C过程虽然都能获得含目的基因的菌株，但C中无内含子对应的序列，所以不可以使用同一种探针进行筛选。
目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。
[答案]
（1）大于
（2）逆转录酶 不可以
（3）DNA cDNA 耐高温
归纳拓展
真核细胞基因结构
（1）结构
（2）表达：
只有编码区能转录生成RNA，且内含子转录的部分要剪切掉，即转录生成的mRNA只有外显子对应部分。
因此，以mRNA为模板，逆转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。
下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是（ ）
A．cDNA文库中的DNA来源于mRNA的反转录过程
B．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同
C．cDNA文库中的基因都没有启动子
D．一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种
解析：
由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以mRNA反转录成的DNA就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编码区段，和原来的基因结构不相同。
答案：
B
基因表达载体的构建
[例2] 右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampr为青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。
已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。
据图回答：
（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有________________、________________、__________________三种。
（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。
之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有________________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有____________。
（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________，其合成的产物是________。
（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________________。
[思路点拨]
[精讲精析]
（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物：
目的基因—目的基因、目的基因—运载体、运载体—运载体。
（2）在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培养基上生长，只有运载体—运载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。
（3）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可启动转录过程，合成mRNA。
（4）由图示和题目中提供的信息可知，同时运用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。
[答案]
（1）目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物
（2）载体—载体连接物 目的基因—载体连接物、载体—载体连接物
（3）启动子 mRNA
（4）EcoRⅠ和BamHⅠ
易错提醒
（1）切割目的基因和运载体时并非只能用一种酶，但无论用几种酶，一般都用相同种类的酶切割目的基因和运载体。
（2）启动子≠起始密码，终止子≠终止密码。
启动子和终止子位于基因结构的非编码区，起始密码和终止密码位于mRNA上。
目的基因的导入和检测
[例3] 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。
下面是农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：
（1）一般情况下农杆菌不能感染的植物是________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现____________________________________。
具体原理是在农杆菌的Ti质粒存在T DNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到________（部位）内部即可。
（2）根据T DNA这一转移特点，猜测该DNA片段上可能含有控制__________________（酶）合成的基因。
（3）图中c过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是________类化合物。
（4）植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还可采取的方法是______________________。
（至少写出两种）
[思路点拨]
[精讲精析]
（1）一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物，利用其感染性，可实现将目的基因导入植物细胞。
这里需要特别明确的是真正可转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体上的是农杆菌质粒上的T DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能导入成功。
（2）根据T DNA这一转移特点，可以推测出DNA片段上能控制合成DNA连接酶、限制酶才能实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。
（3）植物细胞受伤后可产生酚类化合物，促进农杆菌向植物细胞转移。
（4）植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法。
[答案]
（1）单子叶植物 将目的基因导入到植物细胞 染色体DNA T DNA片段（内部）
（2）DNA连接酶、限制酶
（3）酚 （4）基因枪法、花粉管通道法
归纳拓展
（1）在基因工程的操作中，只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有发生碱基互补配对，其余三步中都涉及碱基互补配对。
（2）在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是用放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。
[随堂基础巩固]
1．基因工程的基本操作程序有：
①使目的基因与运载体相结合；②将目的基因导入受体细胞；③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；④提取目的基因。
正确的操作顺序是（ ）
A．③②④① B．②④①③
C．④①②③D．③④①②
解析：
基因工程的主要操作步骤顺序是：
目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。
答案：
C
2．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（ ）
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A．①②③④B．①②③
C．①②④D．②③
解析：
PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。
反转录法则是以目的基因转录成的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。
①、④均不需要模板。
答案：
D
3．下列关于PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术应用体内DNA双链复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
解析：
PCR技术扩增的目的基因序列不一定是已知的，A错误；PCR技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链的末端碱基配对，其序列不是互补的，C错误。
答案：
D
4．2010年曲阜某蔬菜基地栽种了一种抗虫大白菜，这是运用转基因技术把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因DXT转移到大白菜细胞中培育而成的，在这一过程中要进行基因表达载体的构建。
根据所学知识推断，作为重组载体应具备的结构有（ ）
A．目的基因、启动子
B．目的基因、终止子
C．目的基因、启动子、终止子
D．目的基因、启动子、终止子、标记基因
解析：
基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。
答案：
D
5．（2012·新课标全国卷）根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
（2）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是_________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
（4）反转录作用的模板是________，产物是________。
若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
（5）基因工程中除质粒外，________________和________________也可作为运载体。
（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是____________________________________。
解析：
（1）DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种——黏性末端和平末端。
（2）为了保证目的基因与运载体相连，用另一种限制酶切割后形成的黏性末端必须与EcoRⅠ切割形成的黏性末端相同。
（3）DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两类。
（4）反转录的模板是mRNA，产物是DNA。
大量扩增反转录产物常采用PCR技术。
（5）在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
（6）经Ca2＋处理后的大肠杆菌才能够吸收周围环境中的DNA分子。
答案：
（1）黏性末端 平末端
（2）切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同 （3）E·coli T4 （4）mRNA（或RNA） cDNA（或DNA） PCR （5）噬菌体 动植物病毒 （6）未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱
[课时跟踪训练]
（满分50分 时间25分钟）
一、选择题（每小题2分，共20分）
1．下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制酶和DNA连接酶都能识别特定的碱基序列，是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原具有生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
解析：
目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；基因工程中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶，前者能识别特定的碱基序列；大肠杆菌为原核生物，不含有内质网和高尔基体等细胞器，不能对蛋白质进行加工，其合成的胰岛素原无生物活性；载体中的抗性基因为标记基因，其作用是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。
答案：
A
2．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。
下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（ ）
A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
解析：
基因的表达即控制蛋白质的合成，只有合成了相应的蛋白质才能证明目的基因完成了在受体细胞中的表达。
答案：
D
3．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，无需进行碱基互补配对的步骤是（ ）
A．人工合成目的基因
B．基因表达载体的构建
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的检测与鉴定
解析：
将目的基因导入受体细胞时，不存在DNA复制或转录等过程，故该过程不需进行碱基互补配对。
答案：
C
4．下列关于基因表达载体的叙述，不正确的是（ ）
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心
B．其上的启动子和终止子都是有特殊结构的DNA片段
C．一般用抗生素抗性基因作为标记基因
D．虽然基因工程中的受体细胞有所不同，但构建的基因表达载体都是一样的
解析：
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，目的基因导入受体细胞的方法不同，所以，表达载体的构建也有所差别。
答案：
D
5．右图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是（ ）
A．荧光蛋白基因
B．启动子
C．限制酶
D．DNA连接酶
解析：
一个完整的基因表达载体应包括启动子、终止子、目的基因和标记基因。
答案：
B
6．下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述中，不正确的是（ ）
A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少
B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态
C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度
D．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液
解析：
将基因表达载体导入微生物细胞时，需在一定条件（如适宜的温度、pH等）下，将基因表达载体和感受态的微生物细胞混合培养，在培养过程中，可能会影响pH的变化，因此要加入缓冲液，以保持适宜的pH。
答案：
D
7．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a，通过基因工程的方法将a转到马铃薯植株中，经检测，在成熟茎细胞的间隙中发现了Amy。
这一过程涉及（ ）
A．目的基因来自细菌，可以不需要载体，由细菌侵染受体细胞而导入
B．基因a导入成功后，将抑制细胞原有代谢，开辟新的代谢途径
C．RNA以自身为模板自我复制
D．DNA以其一条链为模板合成mRNA
解析：
成熟茎细胞间隙中发现Amy，说明目的基因在受体细胞内已成功表达，所以涉及转录过程（即D过程）；RNA的自我复制仅限于在一部分RNA病毒中发生；目的基因导入受体细胞都必须通过载体；目的基因导入受体细胞后在原有细胞代谢的基础上开辟新的代谢途径，不抑制细胞原有的代谢。
答案：
D
8．以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是（ ）
A．甲方法可建立该细菌的基因组文库
B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库
C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料
D．乙方法需要逆转录酶参与
解析：
甲方法是从细菌的DNA中直接提取，故可以建立该细菌的基因组文库；乙方法是由信使RNA逆转录的目的基因，故可以建立该细菌的cDNA文库。
乙方法需要逆转录酶和脱氧核苷酸为原料。
答案：
C
9．右图表示细胞膜上乙酰胆碱（一种神经递质）受体基因的克隆技术操作过程，下列相关分析中正确的是（ ）
A．获得该mRNA的最佳材料是受精卵
B．构建基因表达载体最可能使用的载体是大肠杆菌
C．完成过程①②必不可少的酶分别是逆转录酶、DNA聚合酶
D．探针筛选的目的是淘汰被感染的细菌，获得未被感染的细菌
解析：
该受体基因在神经细胞中表达，获得该mR
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