酶联免疫吸附实验ELISA基本原理.docx
《酶联免疫吸附实验ELISA基本原理.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶联免疫吸附实验ELISA基本原理.docx（22页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
酶联免疫吸附实验ELISA基本原理
酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理
信息来源：
本站原创 更新时间：
2004-12-210:
30:
00
基本原理
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
方法类型和操作步骤
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：
使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。
洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：
使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：
夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
（二）双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。
这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。
单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。
当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。
钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
（三）间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：
其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。
其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：
与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。
洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
（4）加底物显色：
颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
（四）竞争法
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。
操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。
如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。
如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。
参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。
洗涤。
（3）加底物显色：
参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。
参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。
待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
（五）捕获法测IgM抗体
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。
因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。
操作步骤如下：
（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。
洗涤。
（2）加入稀释的血清标本：
保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。
洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：
它只与固相上的特异性IgM结合。
洗涤。
（4）加入针对特异性的酶标抗体：
使之与结合在固相上的抗原反应结合。
洗涤。
（5）加底物显色：
如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
（六）应用亲和素和生物素的ELISA
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。
分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。
现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。
生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。
用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。
亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。
由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。
因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。
可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。
这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。
另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
ELISA普遍用作非放射性同位素的成键化验.在这种方法中,通常标准配体是固定的,通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键.通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体,而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量.第二种抗体能识别抗体的末端,在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应,从而使溶液显色.
ELISA的试剂
信息来源：
本站原创 更新时间：
2004-12-210:
30:
00
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。
前文（2.2）已述，ELISA中有三个必要
的试剂：
免疫吸附剂、结合物和酶的底物。
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定
中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。
3.1 免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2~8℃）干燥的条件下一般可保存6个月。
有些
不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。
以下简述固相载体和包
被过程。
3.1.1 固相载体
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。
可作ELISA中载
体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋
白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。
聚
苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA载体的形状主要有三种：
微量滴定板、小珠和小试管。
以微量滴定板最为常
用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。
为便
于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板
相同。
ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出
结果。
现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保
温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。
聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是
对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接
法测抗体时空白值较大。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各
孔之间、同一板各孔之间性能相近。
聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差
别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。
常用的检查方法为：
以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每
孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分
别测每孔溶液的吸光度。
控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。
计算全部读数的
平均值。
所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。
作为ELISA固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板
薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。
聚氯乙烯对蛋
白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可应用如下的试验：
用其他免疫学测定
方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后，在不同的固相载体
上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较结果。
在哪一种载体上阳性结果与阴性结
果差别最大，这种载体就是这一ELISA测定项目的最合适的固相载体。
在ELISA中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠，表面经磨砂处理后吸附
面积大大增加。
ELISA板孔的吸附面积约为200mm2，小珠均为1000mm2，将近ELISA板
孔的5倍。
吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。
再者，球型小珠的表面弧
度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态，因此珠式
ELISA的反应往往更为灵敏。
小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底，使用特殊的洗涤器，
使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。
但由于磨砂工艺的难
度较大，小珠的均一性较差。
小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。
板式及珠
式ELISA的标本量一般为100-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增
加有助于试验敏感性的提高。
小试管还可以当作比色杯，最后直接放入分光光度计中比
色。
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。
其优点是表面
积极大，反应在悬液中进行，其速率与液相反应近似。
以含铁的磁性微粒作为ELISA固相
载体，反应后用磁铁的吸引进行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。
3.1.2 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被（coating）。
换言之，包被即是抗原或抗体结合到固
相载体表面的过程。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分
子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。
这种物理吸附是非特异性
的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同
的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表
面。
IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露
于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。
蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方
法包被。
当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原
决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，
即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。
此间接结
合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。
间接包被的抗原经固相
抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采
用捕获包被法（见2.2.4），试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。
间接包
被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。
不易吸附在聚苯乙烯载体
上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。
例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包
被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。
可将聚苯乙烯板先经紫外线照射
（例如30W紫外灯，75cm照射12小时），以增加其吸附性能。
固相载体先用碱性蛋白
质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。
也可用亲和素生物素系
统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、
牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA
板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。
抗心
磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
3.1.3 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三
大类。
天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。
如
HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白
成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。
重组抗原
是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。
重组抗原的
优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。
以大肠杆菌
为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA，在反应中可出现假阳性，
因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。
重组抗原的另一特点是能
用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。
例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不
能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。
目前检测抗HCVELISA中所用包被
抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。
在传染病诊断中，不少重组抗原
如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。
合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分
子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
多肽抗原一般只含有一个抗原决
定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。
多肽抗原
的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固
相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与
其相应的抗体。
一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受
检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。
另外，某些微生物发生变异时往往发
生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。
3.1.4 包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的
腹水或培养液。
如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗
体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。
抗血清不能直接
用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。
一般经硫酸铵盐
析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。
如需用高亲和力的抗体包被以提
高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。
腹水中
单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适
当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。
应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对
一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材
料的性质而选定。
抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用
pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。
通常在ELISA板孔中加入
包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。
包被
的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的
浓度协调选定。
一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
3.1.6 封闭
封闭（blocking）是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。
抗原或抗体
包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相
关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。
封闭的手
续与包被相类似。
最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血
清或1%明胶作为封闭剂的。
脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可
以高浓度使用（5%）。
高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶
粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。
并非所有的ELISA固相均需
封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。
一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活
性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。
特别是用单抗腹水直接包被时，
因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。
但在间接法测定中，封闭一般是不可少的（见2.2.2）。
包被好的ELISA板干燥后放入密
封袋或锡袋中，在低温可保存数月。
3.2 结合物
结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。
良好的结合物应该是
既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。
结合物中酶与抗体（或抗
原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶
或游离的抗体（或抗原）。
此外，结合物尚要有良好的稳定性。
3.2.1 酶
用于ELISA的酶应符合以下要求：
纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳
定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。
最好
在受检标本中不存在相同的酶。
另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产
物易于测定等。
在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）和碱性磷
酸酶（alkalinephosohatase,AP）。
在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化
酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。
HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分
子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一
种卟啉蛋白质。
主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉
环，在403nm波长处有最高吸收峰。
HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，德文，意为纯度
数）表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥?
.0。
HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。
值
得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ外，更应注意酶的活力。
高纯度的酶如保存不
当，活力也会降低。
酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物
量的测定进行试验。
国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。
常用的AP有两个来源，分别
从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。
不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取
的AP分子量为80000，酶作用的最适合pH为8.0；用小牛肠膜中提取的AP分子量为
100000，最适pH为9.6。
在ELISA中，AP系统的敏感度一般高于HRP系统，空白值也较
低，但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低。
3.2.2 抗原和抗体
制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干
扰。
最好用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀
释度进行反应，实验结果本底浅淡。
如用F（ab'）2进行标记，则更可避免标本中RF的干扰。
在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。
3.2.3 结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
（1）戊二醛交联法：
戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过
它而联结。
碱性磷酸一般用此法进行标记。
交联方法一步法、两步法两种。
在一步法中戊
二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。
它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）
和重复性好等优点。
缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结
合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。
在两步法中，
先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。
也可先
将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。
两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:
1的比
例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较
一步法低。
（2）过碘酸盐氧化法：
本法只适用于含糖量较高的酶。
辣根过氧化物酶的标记常用
此法。
反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基
形成Schiff氏碱而结合。
酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：
酶/抗体=1-2/1。
此
法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批
实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。
理论上，结合物中混有
的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并
不影响最终的显色。
但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减
少了结合到固相上的酶标抗体的量。
因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体
后用于检测，效果更好。
纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。
硫酸铵盐
析法最
升级会员 