分析方法验证指导程序.docx

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分析方法验证指导程序

目的：

建立分析方法学验证的指导程序，用以证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，保证验证工作能够有计划、按步骤的进行，同时使与质量检验有关的活动符合GMP的要求。

范围：

适用于本公司所有的分析方法的验证的活动。

职责：

QC：

负责起草分析方法验证的验证方案、报告；负责按批准的验证方案执行验证；负责检验仪器运行和保养。

QA：

负责确定分析方法的验证条件、标准、限度及检验方法；负责验证方案、报告的审核；QA负责人负责方案、报告的批准。

1相关定义

1.1分析方法：

法是为完成检验项目而设定和建立的测试方法，它详细描述了完成分析检验的每一步骤。

一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、供试品溶液与对照品溶液的制备，测定，计算公式及检测限度等。

1.2方法验证：

方法验证就是根据检验项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的实验来验证所采用的分析方法是否符合检验项目的要求。

在建立产品质量标准时，分析方法需经验证。

1.3方法确认：

在应用已验证的药典方法和其他法定方法前，应在当前的实验室条件下进行方法确认来证明方法在该实验室的适用性。

2验证的适用范围

2.1产品的物料、中间产品、中间过程控制和产品的理化分析方法的验证和确认；

2.2清洁验证方法的验证。

3需要验证的分析项目

根据检验项目的设定目的和验证内容的不同要求，将需验证的检验项目分为四类：

3.1鉴别试验；鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其它物质。

用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性和耐用性。

3.2杂质的限度检查与定量测定；杂质检查主要用于控制主成分以外的杂质，如无机杂质，有机杂质等。

杂质检查分为限度检查和定量测定两部分。

用于限度检查的分析方法验证侧重专属性、检测限和耐用性。

用于定量测定的分析方法验证强调专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限和耐用性。

3.3含量测定；含量测定对准确度要求较高，因此所采用的分析方法要求具有一定的专属性、准确度和线性等。

3.5除此之外还有一些物理项目的检测如粒径分布、旋光度、熔点和硬度，其要求与其它检验项目有所不同，通常在进行分析方法验证应有不同的要求。

3.6《中国药典》2010版关于不同的检验项目需要验证不同的内容：

项目

内容

鉴别试验

杂质测定

含量测定

定量

限度

准确度

－

+

－

+

精密度

重复性

－

+

－

+

中间精密度

－

+①

－

+①

专属性②

+

+

+

+

检测限（LOD）

－

－③

+

－

定量限（LOQ）

－

+

－

－

线性

－

+

－

+

范围

－

+

－

+

耐用性

+

+

+

+

①已有重现性验证，不需验证中间精密度；

②如一种方法不够专属，可由其它分析方法予以补充。

③视具体情况予以验证。

4验证内容

4.1准确度

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。

一般用回收率表示。

准确度应在规定的范围内测试。

4.1.1验证方法

准确度是定量测定的必要条件，因此含量测定、杂质定量测定均需验证准确度。

具体方法如下：

4.1.1.1含量测定：

可以用已知纯度的对照品或供试品进行测定。

也可以用本法所得结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较。

如该分析方法已经测试并求出精密度、线性和专属性，在准确度也可推算的情况下，准确度可向制可不必再做。

4.1.1.2杂质的定量测定：

可以向样品中加入已知量杂质进行测定。

如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典方法或经过验证的方法。

在不能测得杂质或降解产物的响应因子或不能测得对原料药的相对响应因子的情况下，可用原料药的响应因子。

应明确单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（％）或面积比（％）。

例如：

测定含量的准确度,按标示量的80%,100%和120%配制三个浓度的溶液，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。

根据测定结果与配制浓度计算出平均回收率以及相对标准偏差。

4.1.2数据要求：

在规定的范围内，至少用9个测定结果进行评价。

例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。

应报告已知加入量的回收率（％）或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或置信区间。

4.2精密度

精密度系指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。

精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

精密度与准确度的不同在于。

精密度测定了一系列重复性的被分析物之间的接近程度，但它不能表达与已建立的真值之间的符合程度，后者由准确度来测定。

通过一系列的测定值，可以得到良好的精密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定与真实值相符，在这种状况下，需要修改方法以消除偏差。

4.2.1验证方法

精密度可从重复性、中间精密度、重现性三个层次考察。

4.2.1.1重复性：

在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。

在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价。

例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定3次，或将相当于100％的浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价。

4.2.1.2中间精密度：

在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。

为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。

变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。

4.2.1.3重现性：

在不同实验室之间由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。

法定标准采用的分析方法或在不同实验室之间进行方法转移时，应进行重现性试验。

例如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性结果。

协同检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中，应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输。

4.2.2数据要求：

均应报告标准差、相对标准偏差（变异系数）和置信区间。

4.3专属性

专属性系指在其他成分（如：

杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。

通常,鉴别反应、杂质检查、含量测定均应考察其专属性。

如一种方法不够专属，可由其它分析方法予以补充。

4.3.1验证方法

4.3.1.1鉴别试验：

用于确认被测成分符合其特征。

专属性要求证明其能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。

含被测成分的供试品呈正反应，而不含被测成分的供试品以及结构相似或组分中的有关化合物，应均呈负反应。

对于药品，辅料不得干扰其有效成分的鉴别。

4.3.1.2含量测定和杂质测定：

色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明诸成分在图中的位置，色谱法的分离度应符合要求。

在杂质可获得的情况下，对于含量测定，可向试样中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。

对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质与共存物质能得到分离和检出，并具有适当的准确度与精密度。

在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一个已验证的方法或药典方法比较结果。

或对试样用强光照射，高温，高湿，酸（碱）水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降解途径。

对于含量测定应对比二法测定的结果。

杂质检查应比对破坏前后检出的杂质个数。

必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测进行峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。

4.4检测限（DL）

检测限系指试样中的被分析物能够被检测出的最低量。

鉴别试验和杂质测定，均应通过测试确定方法的检测限。

4.4.1验证方法

4.4.1.1非仪器分析目视法：

用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

4.4.1.2信噪比法：

用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

一般以信噪比为3：

1或2：

1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

4.4.1.3除信噪比法外，还可根据响应因子的标准偏差和斜率计算出检测限。

LOD=

式中：

为响应值的标准差；

S为校正曲线的斜率，S=m。

斜率S可以通过样品的校正曲线来估算。

的值可以由以下途径估算。

例如：

根据空白的标准差（通过几份空白样品的分析，然后计算其响应值的标准差，测出分析背景响应值的大小），根据校正曲线（通过对含有检测限范围内被分析物样品的分析来研究其标准曲线，回归线的剩余标准差或回归线的y轴截距标准差都可以作为标准差）。

4.4.2数据要求：

应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。

4.5定量限（QL）

定量限系指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。

杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定方法的定量限。

4.5.1验证方法

4.5.1.1常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比为10：

1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

4.5.1.2除信噪比法外，还可根据响应因子的标准偏差和斜率计算出定量限。

LOD=

式中：

为响应值的标准差（通过空白样品测背景响应值或Y轴截距）；

S为校正曲线的斜率（通过样品的校正曲线求得），S=m。

斜率S可以通过样品的校正曲线来估算。

的值可以由以下途径估算。

例如：

根据空白的标准差（通过几份空白样品的分析，然后计算其响应值的标准差，测出分析背景响应值的大小），根据校正曲线（通过对含有定量限范围内被分析物样品的分析来研究其标准曲线，回归线的剩余标准差或回归线的y轴截距标准差都可以作为标准差）。

4.6线性

线性系指在设计的测定范围内，检测结果与试样中被测物的浓度直接呈正比关系的程度。

线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量测定和含量测定均需验证线性。

4.6.1验证方法

应在设计的测定范围内测定线性关系。

可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5个浓度的供试样品。

每一个浓度的样品3份，以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。

必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。

4.6.2数据要求：

应列出回归方程、相关系数和线性图。

4.7范围

范围系指能够达到一定的精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。

含量测定需涵盖的最低浓度范围至少为标示量的80-120%（ICH），推荐包含50%-150%的浓度。

杂质的定量测定，范围应根据初步实测，拟订为规定限度的±20%。

如果含量测定与杂质检查同时进行，用百分归一化法，则范围应为杂质规定限度的-20%至含量限度（或上限）的+20%。

推荐包含LOQ－规定限度的＋20%。

4.8耐用性

耐用性系指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。

开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。

经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。

如果通过耐用性研究发现分析方法对某个或某些测试条件敏感或要求苛刻，建议在方法中予以写明。

4.8.1典型影响耐用性的变动因素包括：

被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等。

4.8.2液相色谱法（HPLC）中的典型的变动因素包括：

流动相的组成和pH值、不同品牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。

4.8.3气相色谱法（GC）中的典型影响耐用性的变动因素包括：

不同品牌或不同批号的同类型色谱柱、固定相、不同类型的载体、柱温、进样口和检测器温度等。

4.8.4在评估HPLC含量方法耐用性中部分需考虑的因素及变化范围，实际变化范围可依据使用条件设计。

HPLC中的变动因素

变化范围

流动相的组成

有机相的±5%，例如：

方法规定流动相缓冲溶液与乙腈的比例为50:

50,那么允许使用45:

55至55:

45范围的比例。

流动相的pH值

±0.5,如果已知pH值为关键影响因素,变化范围应更小。

色谱柱

如可能，推荐使用同一品牌的填料可由不同供应商填充的色谱柱。

可通过回顾实验分析次数或方法研究确定色谱柱的质量。

柱温

±5℃

4.8.5溶液的稳定性研究

溶液的稳定性研究用来证明根据相应方法制备的样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。

如果方法中没有规定有效期，样品溶液和标准品溶液需进行稳定性研究。

样品溶液和标准品溶液依据方法进行配制和分析。

在室温或其他条件下（如冰箱2-8℃）条件下储存适当的时间。

每个间隔点，用新鲜配制的标准品溶液做对照，测定储存的样品溶液和标准品溶液。

测定结果与初始结果进行比较，符合接受标准便可确认样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在规定储存时间是稳定的。

5验证接受标准

验证结果原则上必须满足下列标准，可以依据具体情况适当调整。

5.1鉴别试验（HPLC,TLC,GC）

验证内容

接受标准

专属性

色谱峰/斑点分离

5.2鉴别试验（IR/UV）

验证内容

接受标准

专属性

与标准物质响应相同，能清晰的与相似物质区分

5.3含量（HPLC,GC,UV）

验证内容

接受标准

精密度/重复性

RSD≤1.0%，n≥6

中间精密度

RSD≤2.0%，n≥4

专属性

色谱法：

色谱峰分离；

UV：

UV特征光谱；

IR：

空白片的影响≤3.0%。

专属性峰纯度

（必要时）

色谱峰基线分离，无干扰

UV：

UV特征光谱

IR：

空白片的影响≤3.0%。

证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。

详见准确度。

线性

--相关系数

--截距④

--响应因子RSD

r≥0.998

≤2.0%⑤

≤2.0%⑤

范围

至少标示量（100%溶液）的80-120%

准确度

--平均回收率

--回收率的RSD

98.0-102.0%（n=9，3个浓度，每个浓度三份样品）

≤2.0%（n≥9，至少3个浓度，每个浓度测3次）

稳定性

-样品溶液

-对照溶液

规定时间内变化≤2.0%

耐用性

系统适用性实验通过

5.4杂质的定量测定（副产品/降解产物，对映结构体）

验证内容

接受标准

精密度/重复性

n≥6

限度＜0.1%：

RSD≤30%

0.1≤限度＜0.2%：

RSD≤20%

0.2≤限度＜0.5%：

RSD≤10%

0.5≤限度＜5%：

RSD≤5.0%

限度≥5%：

RSD≤2.5%

验证内容

接受标准

中间精密度

限度＜0.1%：

RSD≤40%

0.1≤限度＜0.2%：

RSD≤30%

0.2≤限度＜0.5%：

RSD≤15%

0.5≤限度＜5%：

RSD≤7.5%

限度≥5%：

RSD≤4.0%

专属性

峰纯度（必要时）

色谱峰基线分离，无干扰

证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。

线性

--相关系数

--截距④

--响应因子RSD

r≥0.998

≤2.0%⑥

限度＜0.5%：

RSD≤10%⑥

0.5≤限度<5%：

RSD≤5.0%⑥

限度≥5%：

RSD≤2.5%⑥

范围

报告限/LOD到标准的120%。

检测限

信噪比≥3:

1；RSD≤20%，n≥5

定量限

信噪比≥10:

1；RSD≤10%，n≥5

准确度

--平均回收率

--回收率的RSD

（n=9，3个浓度，三份样品）

限度＜0.5%：

80-120%

0.5%≤限度<5%：

90-110%

限度≥5%：

95-105%

（n=9，3个浓度，每个浓度测3次）

限度＜0.5%：

RSD≤10%

0.5%≤限度＜5%：

RSD≤5.0%

限度≥5%：

RSD≤2.5%

稳定性

-样品溶液

-对照溶液

限度＜0.5%：

变化值≤20%

0.5%≤限度≤5%：

变化值≤10%

限度≥5%：

变化值≤5%

没有新的色谱峰出现。

储存期变化≤5%

④截距的绝对值；

⑤指回归线的y值对应于标示量（x=100%）时的浓度；

⑥指回归线的y值对应于允许限度（杂质的标准）时的浓度。

5.5在FDA质量控制实验室检查指南“15.方法验证”中指出：

许多含量和杂质的方法采用高效液相色谱法，对于这些方法的精密度的要求希望小于或等于系统适应性试验的相对标准偏差。

美国药典<621>色谱法中对系统适应性试验的RSD有如下规定：

“对用于含量测定的标准溶液或其他标准溶液重复进样分析，比较其结果来确认精密度是否符合要求。

连续进样5次，除在方法中已明确规定外，其峰面积测量值的RSD应不大于2.0%。

如果5针的RSD大于2.0%，可连续进样6次，其峰面积测量值的RSD应不大于2.0%”。

6方法确认

6.1适用范围

适用于药典方法和其他已验证的法定标准。

因为药典方法和其他法定标准被认为是验证过的分析方法，不需要验证，但需要通过方法确认来证明方法在该实验室条件下的适应性。

不适用于实验室日常测试操作步骤不需要进行方法确认，例如（包括但不限于）干燥失重，炽灼残渣，各种湿法化学步骤如酸值和简单的仪器方法如PH计，除非有特殊要求。

6.2确认方式

对于方法确认，通常采用如下两种方式：

6.2.1由两名检验人员分别独立对同一批产品进行检验（如可能，使用不同的仪器），比较两人的检验结果来证明方法在本实验室（人员、分析仪器、试剂等）的适用性。

6.2.2根据验证目的和评估结果选择相关项目进行确认，如下所示：

检验项目

准确度

精密度

专属性

检测限

定量限

线性

范围

耐用性

HPLC鉴别

﹣

﹣

±

﹣

﹣

﹣

﹣

﹣

HPLC有关物质

﹣

±

﹢

﹣

﹢

﹣

﹣

﹣

HPLC含量测定

﹣

±

±

﹣

﹣

﹣

﹣

﹣

备注：

“﹢”代表该项目内容需要确认，“﹣”代表该项目内容不需要确认。

“±”代表该项目内容根据实际情况评估确认。

7分析方法的再验证

7.1产品的生产工艺/处方变更后；

7.2产品的质量标准变更后；

7.3原检验方法进行了修订或检验条件发生了变更；例如：

HPLC法的流动相种类发生了改变、样品准备方法有所变动、检测的仪器或软件平台改变等。

8验证注意事项

8.1验证开始前应检查与确认下列事项

8.1.1所有涉及的仪器已完成验证（安装、运行、性能确认）并在校验有效期内；

8.1.2所有涉及的对照品（标准品）在有效期内；

8.1.3所有涉及的容器、试剂应符合试验要求；6.1.4验证操作人员已经过培训，能够完成验证工作。

8.2验证过程应详细记录,包括色谱条件，样品、对照品、所用试剂的来源，含量，称量值，稀释过程，简要操作方法，仪器型号，计算公式及结果，必要的数据统计等。

8.3对操作过程中出现的任何偏差应予以记录或调查，同时需填写OOS处理和调查记录或相应的偏差调查记录，交QC、QA负责人审核签字。

8.4分析方法验证中的所有图谱，包括系统适用性的图谱，都应该在检测完毕后立即打印，并作为分析方法验证报告的附件一同保存。

检测的所有信息，包括使用的仪器的型号，都应该在图谱中显示。

9制定依据

9.1ICHQ2A《分析方法的验证》、ICHQ2B《分析方法的验证：

方法学》；

9.2《中国药典（2010版）》附录XIXA药品质量标准分析方法验证指导原则；

9.3《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（附录：

确认与验证）；

9.4《FDA质量控制实验室检查指南》“15.方法验证”。

10变更历史

前版文件编号

/生效日期

现版文件编号

/生效日期

变更内容

N/A

SMPQA-BF014-00

2009.12.09

N/A

SMPQA-BF014-00

2009.12.09

SMPQA-BF014-01

1.依据新版药典和GMP的要求对文件内容作了修订；

2.增加了验证接受标准和方法确认内容；

3.依据公司实际情况，删除了“微生物限度检查的验证要求”和“内毒素检测的验证要求”等项内容。