Illumina测序基础知识.docx
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Illumina测序基础知识
第一个要给大家讲的，是它这个flowcell。
Flowcell翻成中文，就叫“流动池”。
我们来看这个图片。
图片当中，我们看到一个象载玻片大小的芯片。
这个芯片里面，是做了8条通道。
在这个通道的内表面，是做了专门的化学修饰。
它的化学修饰，主要是用2种DNA 引物，把它（2种DNA引物）种在玻璃表面。
这两种（DNA引物的）序列是和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补的。
而且这2种引物是通过共价键，连到Flowcell上去。
之所以要用共价键连到Flowcell上去，是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell，只有有共价键连接的这些DNA，才不会被冲掉。
这就是Flowcell。
文库制作
再接下来，讲一下文库、和文库的制作（过程）
所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头，型成的DNA混合物。
文库有2个特点，第1个特点，是当中这一段插入的DNA，它的序列是各种各样的。
第2个特点，它的两头的接头序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。
要做这个文库，首先是把基因组DNA，用超声波打断。
然后打断之后，两头用酶把它补平，再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基。
然后，再用连接酶把这个接头给连上去。
连好了接头的DNA混合物，我们就称为一个“文库”。
英文也称作“library”。
桥式PCR
做好了Library之后，就要做桥式PCR了。
桥式PCR，实际上是把文库种到芯片上去，然后进行扩增，这样的一个过程。
这个过程，首先是把文库加入到芯片上，因为文库两头的DNA序列，和芯片上引物是互补的，所以，就会产生互补杂交。
杂交完了之后，我们在这里面加入dNP和聚合酶。
聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条全新的DNA链来。
新的这条链，和原来的序列是完全互补的。
接下来，我们再加入NaOH碱溶液。
DNA双链在NaOH碱溶液存在下，就解链了。
而且被液流一冲，原来的那个（模板）链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。
而和芯片共价连接的链，就被保留下来。
然后，我们再在液流池里加入中性液体，主要是为了中和这个碱液，在加入中和液之后，整个环境变成中性了。
这时侯，DNA链上的另外一端，就会和玻璃板上的第二种引物，发生互补杂交。
接下来，我们加入酶和dNTP，聚合酶就延着第二个引物，合成出一条新链来；然后，我们再加碱，把2条链解链解开；然后，我们再加中和液，这时侯，DNA链会和新的引物杂交。
再加酶，再加dNTP，又从新引物合成出新的链来。
连续重复这一过程，DNA链的数量，就会以指数方式增长。
制备单链
在桥式PCR完成之后，接下来要做的工作，就是要把合成的双链，变成可以测序的单链。
办法是通过一个化学反应，把其中一个引物上的一个特定的基团给切断掉。
然后，再用碱溶液来洗这个芯片。
这时侯，碱让DNA的双链解链，那根被切断了根的DNA链就被水冲掉了。
留下那根共价键连在（芯片）上面的链。
接下来，再加入中性溶液，然后在这个中性溶液里面加入测序引物。
正式测序
好，接下来正式的测序工作就开始了。
那么，在测序的时侯，加入进去的，最主要是2个东西：
一个是带荧光标记的dNTP。
而这个dNTP，它还有一个特点，它的3’末端是被一个叠氮基堵住的。
然后，再加一个聚合酶，聚合酶就会选择：
哪一个dNTP是和原来位置上的那个碱基是互补的，根据互补性原理，把这个dNTP合成到新的这个DNA链上去。
因为这个dNTP的3’端是被一个叠氮基团堵住了，所以，它一个循环只能延长一个碱基。
然后，它就停在那儿了。
合成完了之后，就用水把多余的dNTP和酶给冲掉。
冲掉之后，就放到显微镜下，去进行激光扫描。
根据发出来的荧光来判断它是哪个碱基。
因为4种dNTP，它每一种dNTP上面标的荧光素都不一样，根据红、黄、蓝、绿，它出来的哪种颜色，那么，就可以倒过来推出来，这个新合成上去的碱基，是哪种碱基。
因为新合成的碱基，是和原来位置（的碱基）是互补的，所以，又推出模板上那个碱基是哪个。
这一个循环完成之后，就加入一些化学试剂，把叠氮基团和旁边标记的荧光基团切掉。
切完了之后，3’端的羟基就暴露出来。
再接下来，加入新的dNTP和新的酶，然后，又延长一个碱基。
新延长完一个碱基之后，把多余的酶和dNTP冲掉，再进行一轮显微的激光扫描，再读一下这个碱基是什么。
不断重复这个过程，可以重复上百次，到几百次，就可以把上百个碱基，甚至更多碱基的序列读出来。
读Index
那么，什么是Index哪？
是因为Illumina的评委会个测序量很大，往往一个样本，用不了那么几亿条DNA。
所以，科学家就想了一个办法。
在文库的接头上做了一些标记，每一个样本，它有一个特定的接头，每个接头里面，它有一段特定的序列。
这段特定的序列，我们就称为Index。
也有人把它叫做Barcode，反正，表达的是一个意思：
这么一段特定的序列，标记了样本的来源。
那么，要读这个Index的序列，先用碱把上面这根测完“Read1”的序列，把上面这根DNA链给解链掉。
解链掉之后，再加入中性液，然后，加入“Read2”这个测序引物。
Read2测序引物结合的位点，正好，就在这个Index序列的旁边。
接下来，就进行第2轮测序，一般来说，是读6到8个碱基。
把这6到8个碱基读下来，我们就可以知道，这某一个具体的一段DNA，它来自于原始的哪个样本。
双端测序
这是Illumina的最核心的另外一个技术，就是双端测序。
那么双端测序，就是说，一根DNA链，除了从正向读一遍，还可以从DNA的负向，再读一遍。
这一下子就把Illumina测序的有效长度加了一倍。
这是非常有实际用途的。
那么这个倒链的过程，是这样，先让这个DNA先合成，合成出来这根互补链。
有了这个互补链之后，用一个化学试剂，在原来这根链的根上切一下。
切一下，原来这根模板链就掉了，剩下那根互补链。
再接下来，就进行第2端的测序。
第2端的测序原理，和第一端的测序原理是一样的。
加上了“Read3”的这个引物，依次往下，一个一个碱基地往下读。
大规模平行测序
那么最重要的事情是什么呢？
一个点，经过几百个循环，就读出了几百个碱基。
但实际上，这个芯片上可以有上亿个点，上亿个“cluster”，也就是“簇”。
那么上亿个“cluster”，每个循环，它都可以读出地么多序列，这是Illumina测序非常强大的原因。
因为是成千上万，准确说是上亿上链都在合成，这个就得到了很大的一个测序数据量。
IlluminaHiSeq测序仪的工作原理。
也就是芯片上发生了这么多变化，HiSeq是如何把这些信息给读出来，并且把扫描出来的荧光信号，又通过怎样一系列的加工，变成可以识别的“A、C、G、T”的碱基序列的。
HiSeq首先是一台高精度的显微光学扫描仪。
然后再配上了一整套的液流系统，和计算机软硬件，再加温控系统，组成这样一台测序仪。
其中最核心，也是结构最复杂的，是它的光学系统。
前一期，我们讲了，Illumina测序仪主要是靠4种dNTP分别带有不同的荧光基团，在被激光照了之后，发出不同颜色的荧光。
再通过对光的颜色的分辩，可以判断出到底是哪个碱基。
光路结构
这里，我们要说明一下：
感光元件CCD，它本身是色盲。
所以，它一定要配合滤光片，才能分辩出颜色来。
那我们先来看一下，HiSeq的光路图。
左边这两个元器件，就是激光器。
一个发出红色激光，另一个发出绿色激光。
其中红色激光主要是激发A和C，这两种碱基上的荧光基团；而绿色激光主要是激发G和T，这两种碱基上的荧光基团。
红色和绿色这两束光，通过一面半透半反镜，组成一道激光。
这道激光打在Flowcell上。
那么请注意，Flowcell就放在这个位置。
在Flowcell里面，结合在DNA上的那个荧光基团在激光的照射下，就发出荧光。
荧光通过3面半透半反镜，和1面全反镜，被分成4条光路，这4道光线，分别通过一道滤光片，这4张滤光片的滤过波长不一样。
这样，这4道光在经过了滤光片之后，就变成了4种颜色不同的光线。
然后，这4条颜色不同的光线，各自照在一面反射镜上，通过反射镜进入到CCD。
这4个CCD就记录到不同颜色的光线。
TDI线扫描
HiSeq的光线扫描是“线扫描”，和传统的相机不一样，传统的相机是面扫描。
HiSeq采取了一种特定的叫“TDI”线扫描方式，TDI是Timedelayintegration的缩写。
在HiSeq上之所以采取TDI扫描方式，因为它有非常明显的优点。
第一个优点，就是它的扫描速度非常快，在HiSeq2500上，从Flowcell的一个Lane的一头扫到另外一头，也就是一个“Swath”的扫描时间，大概只有20秒种不到。
第二个好处，就是它的扫描精度非常高。
在最新的HiSeqV4版试剂上，它的光点密度，大概可以达到每平方毫米90万个点，要扫描清楚这么高密度的光点，扫描仪的扫描精度是可想而知的。
TDI扫描的第三个好处，是这种方式，可以把Flowcell的上表面、和下表面都扫描到。
Flowcell（测序芯片）
接下来，我们再要详细介绍这张Flowcell。
那么，先来看一下，这张flowcell有点象一张载玻片，在这一张片子里面，我们可以看到，它做了8条通道。
每条通道，我们称为一个Lane。
这8个Lane之间，相互是隔绝的。
每个Lane的两端各有一个小孔。
这两个小也孔，就是液流流进、流出的地方。
每个Lane的上表面和下表面，都分别以共价键的方式，种了2种DNA引物。
这两种DNA引物，是与文库接头的两头序列相互补的。
上一期（节目）我们已经说明了这一点。
一个Lane里面，分成2个面，上表面、和下表面。
上表面和下表面，都种了DNA引物，也都是可以产生测序数据的。
在每一条Lane的每一个面，又被分成了3个扫描通道，每个道被称为一个“swath”。
每条Swath是从头到底被连续扫描的。
但是它的数据，在进行数据分析的时侯，是被分割成16个小方块。
这每一个小方块，被称为一个“tile”。
这样一张Flowcell，总共就是768个Tile。
每个Tile在扫描的时侯，会根据4种颜色，产生4张照片。
图像处理
扫描完了之后，就要进行图像处理。
扫描出来的最原始的文件，它的格式是“.tiff”文件。
Tiff文件记录了每个像素点上采集到的光强度。
Tiff文件的优点是它是完全无损，保留了所有的原始信息。
但它也有它的不足之处。
它的不足之处就是它的这个文件太大了。
它的数据量很大，既不便于数据的传输，也不便于数据的存储。
接下来，计算机软件就把图像文件转化成光点文件。
光点文件叫“.BCL”文件。
也就是“Basecalling”的英文缩写。
要把图像文件，转化成BCL文件，就是把4种颜色的4张照片，组合在一起，变成一张有4种颜色的彩色照片。
这其中首先要解决的，是4张照片在空间位置上的匹配问题，因为4张照片是通过4个CCD分别拍下来的，所以，会有一定的空间上的偏差。
软件要通过对4张照片上，亮点相互比对，找到最合适的、匹配的位置。
这里，我们要说明一下，如果被测的文库是碱基不平衡的文库，在这个空间匹配上就会遇到问题。
什么叫碱基平衡呢？
也就是说，在测序过程当中，每个循环，A、C、G、T四种碱基，都是比较均匀在存在的。
最典型是人全基因组文库，这是一个典型的碱基平衡文库。
那什么是碱基不平衡文库呢？
最典型的，就是PCR扩增子产生的文库。
PCR扩增子的特点：
PCR是有特定的起始位点的，一个特定的测序循环中，几乎所有的片段都是同一种碱基，而剩下的3种碱基，就特别少。
这在反映到照片上去的时侯，就变成：
一张照片特别亮，光点很多。
而其它的三张照片就特别暗，上面的光点就很少。
这时侯，要软件做空间上的比对，软件就会觉得困难，因为对于那几张暗的照片，软件很难判断上面的光点，是否与那张亮的照片上的光点真正对得上。
结果，就是判断出来的可靠性变差。
最后，就是测序的数据质量变差，有效数据量也会变少。
要解决这个问题，办法是在测序过程中掺入一些碱基平衡的文库。
例如掺人全基因组文库。
或者也可以掺Illumina提供的标准的PhiX文库，这些都是碱基平衡文库。
它的作用，是在每个循环当中，为每一种颜色的照片，都提供足够多的亮点。
这样，它可以弥补那些不平衡的文库当中缺亮点的问题。
BCL文件
当把4种颜色的光点组成一个文件之后，软件就会生成一个“.BCL”文件。
“.BCL”文件就是光点文件，它对每个光点，记录了以下的内容。
首先一个光点处在哪个Lane里面。
其次，这个光点在这个Lane的哪个Tile里面。
第3，就是这个亮点在这个Tile的X轴和Y轴的座标位置。
第4，是记录了这个光点当中“红、黄、蓝、绿”四种光的对应的光强。
这个图是BCL文件的一个示意图。
实际上，BCL文件是二进制文件，无法拿来直接阅读。
也正是因为BCL文件难于阅读，并且很难改动，所以，BCL文件几乎不存在做假的可能。
在测序过程当中，有许多客户会要求测序公司提供原始的测序数据，如果客户是包Lane、或者包Flowcell的，一般测序公司是可以提供BCL文件的。
客户在拿到BCL文件之后，可以用“BCL2FASTQ”这个软件，把BCL文件转化成FASTQ序列语文件。
以此，客户可以来验证，测序公司提供的数据是否是原始的，是否是真实的。
再说一下最初生成的那个tiff文件。
tiff文件实在太大了，所以，测序仪在测序过程中，只把tiff文件作为中间文件。
最后是把这个tiff文件删掉的。
如果客户想要原始的图像文件，在HiSeqV4之前，可以让测序公司保留“.CIF”文件。
CIF文件是一种彩色图案的向量文件，它的优点是比tiff文件的数据量小很多。
测序公司把CIF文件给客户之后，客户就可以看到原始的图像文件了。
但是，请注意：
在HiSeq升级到V4之后，保留CIF文件的这个选项是被取消掉了。
所以，对于要测V4Lane的客户来说，是拿不到CIF文件了。
碱基识别
接下来，我们讲一下碱基识别。
我们之前讲：
4种dNTP，各标一种荧光基团，红、黄、蓝、绿，四种颜色，根据颜色来判断碱基种类。
这个实际上是一种简化了的说法。
实际情况，要比这个复杂得多。
来看这个图，这是2种荧素的荧光的波长图。
我们会发觉，这两种荧光色，它发出来的发射光，它在波长上是有交叠的。
在X的这个位置，主要是绿色荧光素的贡献，但是蓝色荧光素，也有少许贡献。
而在Y这个波长位置，蓝色荧光素是做了主要贡献，但是绿色荧光素，也有少量供献。
在实际测序过程中，是4种荧光素发出的亮，相互有交叠，相互之间的交系，变得更加复杂。
那么，现在我们要做的事情，是把A、C、G、T，4种荧光素的贡献给拆开。
首先，我们就要确定4种荧光素在4个被测波长处的贡献率。
我们可以看一下，这个表，就是4种荧光素，在4个波长分别有不同的贡献率。
这样就组成一个4X4的贡献率表格。
我们在实际的分析当中，等于解一个4元1次、4联方程。
因为是4个未知数，又是4个方程，所以肯定是可以解出来的。
说解方程，有点复杂。
那么我们来打一个比方。
让大家来理解这个事情。
假设有一家饭店，它有4个熟客：
甲、乙、丙、丁。
它日常又提供4道菜：
猪肉、白菜、黄瓜、花生。
大厨知道：
甲最爱吃猪肉、乙最爱吃白菜、丙最爱吃黄瓜、丁最爱吃花生，每个人来了饭店之后，主要吃自己最爱吃的，也会吃些别的菜，但别的菜都吃得不是太多。
那么这个大厨不到前台，看不到今天来的客人。
如果，这个大厨想要知道今天来的客人是谁，他有什么办法呢？
看今天哪个菜被吃掉得最多。
如果今天的菜被吃掉的最多的是猪肉，那他可以大致地判断，今天是甲来过了；如果他看到今天被吃掉的菜，最多的是白菜，很可能是乙来过了；那么其它的，道理也是一样的。
希望这个例子可以帮大家来理解一下，这4个荧光和4种碱基的判读的关系。
Phasing和Prephasing
接下来，我们再讲一下，Phasing和Prephasing。
在Illumina的测序过程当中，一个簇，大概有5千个到1万个分子。
但是在边合成、边测序的过程当中，每一步酶反应，理想情况下，应该这5千个分子都延长1个碱基。
但实际情况，总有少量分子没有完成延长反应。
也就是说，总有少量的分子会掉队，我们称这种掉队的现象叫“phasing”。
Phasing主要是由于酶活性不足，所引起的。
如图所示，掉队的这个分子，它所发出的荧光信号，和大部队所发出的荧光信号是不一样的。
这个循环的次数越多，掉队的分子就越多。
所以，测序越到后面，它Phasing的分子数就越多。
最后，信号的可靠性就越差。
除了掉队的分子，还会有一部分分子，会跑得超前，也就是在一个循环中，它延长了2个碱基。
在一个循环中延长了2个碱基的最主要的原因，是dNTP上标记的那个叠氮基团（N3）掉了。
我们知道，叠氮基团是非常容易从有机化合物上掉落的。
当叠氮基团掉落之后，dNTP的3’端的羟基就暴露出来了。
当丢失了叠氮基团的dNTP加到（合成链的）3’端之后，它的聚合反应不会终止，而是会继续往前走。
当再加上了一个带叠氮基团的dNTP之后，这个聚合反应才停下来。
这样的后果，就是一个循环，某些分子，会合成了2个碱基。
也就是说比大部队多走了一步。
那么这个多走了一步的碱基，它所发出来的荧光颜色，也是和大部队不一样的。
在Illumina测序过程当中，Phasing和Prephasing是限制测长的最主要原因。
也就是说，随着循环不断进行，越来越多的分子掉队，还有越来越多的分子超前。
然后，它们所产生的噪音，掩盖了大部队的信号的时侯，也就是测序开始测不准的时侯。
在HiSeq测序当中，从第12个循环开始，在计算某个光点是哪种碱基的时侯，就要把Phasing和Prephasing的影响，纳入考虑。
Chastity和Passfilter
为了对光点当中荧光素的纯粹程度进行描述，Illumina公司定义了个标准，叫“chastity”，Chastity的定义，就是浓度最高的那个荧光素的量，去除以“它自己+排名第二的荧光素的量的和”。
大于0.6是一个好碱基。
用更加通俗的话来说，也就是“老大”比“老二”，如果大于、等于“1.5倍”，这就是个“好”碱基。
如果“老大”比“老二”不足“1.5倍”，这就是个“坏碱基”。
Illumina对每个read的质量都要做一个检验，这个检验就叫“passfilter”检验。
检验的标准，是看前25个碱基当中，有几个是“坏碱基”。
如果只有一个、或者没有坏碱基，则Passfilter就通过；如果有超过一个以上的坏碱基，Passfilter就不能通过。
那我们平时说，测序服务保证多少“PFdata”，指的就是PassFilter（PF）的数据。
PassFilter最主要的作用，就是把那些一个光点当中，含了几个cluster的那些点，给去掉。
只剩下那些纯粹的单克隆的read，作为合格的数据，提交给客户。
我们平时说“PF率”，指的就是PassFilter的Reads数，占总的、测到的Reads数的比例。
PF率可以从一个侧面反映测序的质量。
一般来说，如果上样密度过高，PF率就可能会下降。
QualityScore，Q值
一个碱基的QualityScore，也就是这个碱基的质量分数（Q值）。
这个是通过这个碱基被误判的可能性，换算出以10为底的对数，再乘以“-10”得到的这样一个数字。
这个Q值，有点象我们说黄金的纯度，我们说“三九金”，或者说“四九金”，就是指99.9%的纯度的金子，或者是99.99%的纯度的金子。
我们平时说Q30，就是指一个碱基的可靠性达到99.9%。
或者说，它的出错的可能性小于千分之一。
同样道理，我们说Q40，就是指一个碱基的可靠性是99.99%。
或者说，它的出错的可能性是万分之一。
那么，我们经常说Q30比例，所谓的“Q30比例”，就是在全部PF数据当中，达到、或者超过Q30质量标准以上的数据，占所有PF数据的比例，叫Q30比例。
Q30比例，可以表征一个测序过程的质量的好坏。
一个碱基的质量分数，不是以数字方式，直接记录到最后的Fastq文件的。
而是把它的Q值，加上33，再用ASCII码表转换成一个字母，把这个字母录入Fastq文件。
这样做，有2个好处。
如果我记2位数字，那么就占2个字节，现在用一个字母来记录，只占一个字节。
那（数据存储）空间就节省了很多。
第二个好处，用ASCII码字母表，一个碱基，只对应一个字母；如果是用2位数字来记录，就有可能发生移码错误。
而用ASCII码，一个字母来记录，就不太容易发生移码错误。
Fastq文件
在软件做完上述所有的数据处理之后，就会生成一个Fastq文件。
Fastq文件里，主要包含了3部分内容。
第一个部分，是每个Read的目录信息。
也就是这个Read来自于哪台HiSeq、第几个run、第几个Lane、和第几个Tile，以及在这个Tile的X、Y的什么位置。
接下来，就是所测到的碱基的序列。
最后，是这些碱基序列对应的质量分数信息。
这个，就是Fastq文件。
到Fastq文件之后，测序仪所要完成的工作，就完全完成了。
Pacbio是目前读长最长的测序技术公司。
它的读长，最长可以达到2万到3万个碱基，平均可以达到8千多个碱基。
相比于llumina和IonTorrent的几百个碱基的读长来说，有着明显的优势。
PacBio测序过程
PacBio的测序原理，和别的高通量测序的原理，基本上也是一样的。
也是边合成，边测序。
首先，这个聚合酶是固定在测序小孔的玻璃底板上。
这个聚合酶又和DNA模板、测序引物是结合在一起的。
然后加入带4色荧光的dNTP底物，这些dNTP都在其磷酸基团上被标上了荧光基团，四种碱基、各标一种颜色。
当一种与聚合酶正要合成的碱基一致的dNTP被酶抓住的时候，酶就会长时间地抓住这个dNTP,不让这个dNTP漂走。
这时侯，激发光从小孔的底部照进来，打在这个被抓住的dNTP上，就会在较长时间内发出荧光。
仪器根据所拍到的荧光的颜色，就可以来判断，这个碱基是哪种碱基。
一个循环的聚合反应发生完毕之后，焦磷酸基团就从原来的dNTP上掉下来，因为荧光基团是连到这个焦磷酸上的，所以这个荧光基团也就一起掉下来了，在溶液中就会漂走。
接下来，进行第二、第三个循环……，一直进行下去。
一张芯片上有几万个孔，同时进行测序，这样一次就可以得到几亿个碱基的序列。
接下来，分几个要点，来说明这个测序的过程。
化学方法
和Illumina一样，PacBio也采用了4色荧光基团来标记dNTP，但是PacBio的标记和Illumina的标记有所不同，PacBio的荧光基团直接是标在dNTP的3'端的磷酸基团的末端的。
这样标记的好处是：
当一个聚合反应的循环完成的时侯，dNTP上的那两个磷酸基团就掉下，连在这个磷酸基团上的荧光基团也随一块儿掉下来。
它掉下来之后，就在溶液中漂走，不会影响接下来的测序过程了。
测序微孔
然后，我们说一下这个测序小孔的设计。
这个测序小孔叫ZeroModelWaveguide，简称ZMW。
小孔的直径很小，光只能在小孔中传输很短的距离。
这个特点对PacBio的测序很重要。
因为酶是被固定在玻璃底板上的，所以，只有互补的dNTP被酶抓到的时侯，这个dNTP才会较长时间地停留在离玻璃底板很近的位置。
也只有这样，才会被激发光照到，并且发出它的荧光。
PacBio的光学设计中，入射光是几百纳米波长的可见光,光从小孔的底部的玻璃处照到小孔中来。
这个，只有70纳米。
其它游离的dNTP，只会非常短暂地进入小孔，又很快漂走。
所以，这些游离dNTP带来的的噪音（信号），就被抑制在很低的水平。
哑铃状的文库
接下来，我们说一下PacBio的建库。
PacBio的建库是比较特别
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