医院制剂质量标准起草说明模版.docx

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医院制剂质量标准起草说明模版

3.6.4微生物限度

3.6.4.1方法验证材料与依据

3.6.4.11供试品：

参榆灌肠液

规格：

XXX

生产企业：

江苏省XXX医院

批号:

111212111214111215

3.6.4.1.2培养基：

1．营养琼脂培养基批号：

110512厂家：

XXX

2．玫瑰红钠琼脂培养基批号：

1105172厂家：

XXX

3．营养肉汤培养基批号：

110126厂家：

XXX

4．胆盐乳糖培养基批号：

110408厂家：

XXX

5．MUG培养基批号：

110203厂家：

XXX

3.6.4.1.3稀释剂:

pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液500ml/瓶,

批号：

2011032801

（如缓冲液为市场购买，需写明生产企业）

3.6.4.1.4菌种：

菌种名称

编号

来源

传代次数

大肠埃希菌

（Escherichiacoli）

CMCC（B）44102

南京市药检所

第3代

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）

CMCC（B）26003

南京市药检所

第3代

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）

CMCC（B）10104

南京市药检所

第3代

枯草芽孢杆菌

（Bacillussubtilis）

CMCC（B）63501

南京市药检所

第3代

白色念珠菌

（Candidaalbicans）

CMCC（F）98001

南京市药检所

第3代

黑曲霉

（Aspergillusniger）

CMCC（F）98003

南京市药检所

第3代

3.6.4.1.5验证依据：

《中国药典》2010年版二部附录XIJ微生物限度检查法方法验证。

3.6.4.2验证实验操作

根据《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法方法，采用常规法（如常规法回收率未达70%，需采用培养基稀释法重新进行验证；如培养基稀释法回收率仍未达70%，可采用薄膜过滤法再次进行验证）对细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。

控制菌检查方法采用常规法（若阳性未生长采用培养基稀释法或薄膜过滤法），从而建立该样品的微生物限度检查方法。

3.6.4.2.1菌液制备方法：

1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,置350C培养24小时，分别取上述培养物1ml加9ml0.9％的无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，置250C培养48小时，取上述培养物1ml加9ml0.9％的无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

3.接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,置250C培养7天，加入5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％的无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，并吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％的无菌氯化钠制成每1ml含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。

3.6.4.2.2供试液制备：

取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混均,作为1：

10供试液。

3.6.4.3菌落计数方法的验证

3.6.4.3.1平皿法：

（常规法）

①试验组：

取1：

10供试液1ml，分别加入10个平皿中，再依次加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种菌的菌悬液1ml（含50～100cfu），每株菌平行制备2个平皿，立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置350C培养48小时和250C培养72小时。

②菌液组：

分别取上述稀释的菌液1ml注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

③供试品对照组：

取1：

10供试液1ml分别注入4个平皿中，立刻注入营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基制备2个平皿，分别置350C培养48小时和250C培养72小时。

以测定供试品的本底菌数。

上述方法平行实验3次

④结果见表1

表1.参榆灌肠液细菌.霉菌和酵母菌回收率的测定（平皿法）

菌种类型

试验

次数

试验组

菌液组

供试品

对照组

回收率（%）

试验组

大肠

埃希菌

1

47

49

0

95.9

2

65

62

0

100

3

61

56

0

100

金黄色

葡萄球菌

1

36

33

0

100

2

44

45

0

97.8

3

45

41

0

100

枯草芽孢

杆菌

1

38

42

0

90.5

2

47

50

0

94.0

3

62

67

0

92.5

白色念珠菌

1

45

48

0

83.3

2

35

39

0

89.7

3

50

55

0

90.9

黑曲霉

1

34

38

0

89.5

2

27

31

0

87.1

3

28

29

0

96.6

试验组菌回收率（%）＝

由表1可见参榆灌肠液用平皿菌落计数法，三次平行试验大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌落回收都达到了70%，说明常规平皿法用于参榆灌肠液计数结果是准确的。

备注：

如采用常规平皿法菌落回收率都达到70%，则细菌、霉菌和酵母菌的计数方法验证即可完成，但如常规法一种或几种菌回收率三次均低于70%，需采用培养基稀释法重新进行试验，具体操作如下：

若细菌回收率低于70%则细菌数计数采用培养基稀释法，霉菌回收率低于70%则霉菌酵母菌计数采用培养基稀释法，二者均低于70%则同时采用培养基稀释法。

验证资料中需体现常规法及培养基稀释法两种验证方法及结果。

3.6.4.3.2平皿法：

（培养基稀释法）

①试验组：

取1：

10供试液0.2ml及各试验用菌液1ml分别注入平皿中，每种试验菌平行制备10个平皿，立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，细菌350C培养48小时，霉菌及酵母菌250C培养72小时。

②菌液组：

分别取上述稀释的菌液1ml注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

③供试品对照组：

取1：

10供试液0.2ml分别注入20个平皿中，立刻倾注营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基制备10个平皿，分别置350C培养48小时和250C培养72小时。

以测定供试品的本底菌数。

上述方法平行实验3次

④结果见表2

表2.参榆灌肠液细菌.霉菌和酵母菌回收率的测定（培养基稀释法）

菌种类型

试验

次数

试验组

菌液组

供试品

对照组

回收率（%）

试验组

大肠

埃希菌

1

47

49

0

95.9

2

65

62

0

100

3

61

56

0

100

金黄色

葡萄球菌

1

36

33

0

100

2

44

45

0

97.8

3

45

41

0

100

枯草芽孢

杆菌

1

38

42

0

90.5

2

47

50

0

94.0

3

62

67

0

92.5

白色念珠菌

1

45

48

0

83.3

2

35

39

0

89.7

3

50

55

0

90.9

黑曲霉

1

34

38

0

89.5

2

27

31

0

87.1

3

28

29

0

96.6

试验组菌回收率（%）＝

由表2可见参榆灌肠液用培养基稀释法，三次平行试验大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌落回收都达到了70%，说明培养基稀释法用于参榆灌肠液计数结果是准确的。

备注：

如培养基稀释法回收率仍低于70%，采用薄膜过滤法再次进行试验。

验证资料中需体现常规法、培养基稀释法及薄膜过滤法三种验证方法及结果。

具体操作如下：

3.6.4.3.3薄膜过滤法：

供试液制备：

取1：

10供试液10ml放入离心管中，将离心管放入离心机，500转/min离心3分钟，取上清液。

（注：

仅细菌计数可用低速离心，霉菌及酵母菌计数不可采用。

）

①试验组：

取1：

10上述供试液1ml加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml稀释过滤，用400ml（备注：

具体用量依样品抑菌作用强弱而定，在试验中需设计不同的冲洗量进行冲洗，根据回收率的情况选择不同的冲洗量）pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100ml，在最后一次冲洗液中分别加入试验用菌液1ml，过滤后无菌方法取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂或玫瑰红钠琼脂平板上，细菌350C培养48小时，霉菌及酵母菌250C培养72小时。

②菌液组：

分别取上述稀释的菌液1ml注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

③供试品对照组：

取1：

10供试液1ml采用上述薄膜过滤法冲洗过滤，分别置350C培养48小时和250C培养72小时。

以测定供试品的本底菌数。

上述方法平行实验3次

④结果见表3

表3.参榆灌肠液细菌.霉菌和酵母菌回收率的测定（薄膜过滤法）

菌种类型

试验

次数

试验组

菌液组

供试品

对照组

回收率

试验组

大肠

埃希菌

1

47

49

0

95.9

2

65

62

0

100

3

61

56

0

100

金黄色

葡萄球菌

1

36

33

0

100

2

44

45

0

97.8

3

45

41

0

100

枯草芽孢

杆菌

1

38

42

0

90.5

2

47

50

0

94.0

3

62

67

0

92.5

白色念珠菌

1

45

48

0

83.3

2

35

39

0

89.7

3

50

55

0

90.9

黑曲霉

1

34

38

0

89.5

2

27

31

0

87.1

3

28

29

0

96.6

试验组菌回收率（%）＝

由表3可见参榆灌肠液用薄膜过滤法，三次平行试验大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌落回收都达到了70%，说明薄膜过滤法用于参榆灌肠液计数结果是准确的。

3.6.4.4控制菌（大肠埃希菌）检查方法的验证

3.6.4.4.1直接接种法

（1）试验组：

取1：

10的供试液10ml，接种至100ml的胆盐乳糖增菌培养基内，加入49cfu大肠埃希菌,350C培养24小时，可见培养基混浊，有气体产生。

取上述培养物0.2ml接种至5mlMUG培养基的试管内，培养5小时、24小时，在366nm紫外线下观察，可见荧光反应，滴加靛基质试液，液面呈玫瑰红色.

（2）阴性菌对照组：

取1：

10的供试液10ml，接种至100ml的胆盐乳糖增菌培养基内，加入33cfu金黄色葡萄球菌,350C培养24小时，培养基无混浊与气体产生。

取上述培养液0.2ml接种至5mlMUG培养基的试管内，培养5小时、24小时，在366nm紫外线下观察，无荧光反应，滴加靛基质试液，液面均呈试剂本色。

上述方法试验组检出了大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌。

说明用100ml胆盐乳糖增菌培养基可以进行参榆灌肠液大肠埃希菌检查。

备注：

试验中若100ml阳性对照未生长，则加大胆盐乳糖增菌培养基用量，分别作200ml、300ml，方法同以上方法。

3.6.4.4.2薄膜过滤法

若直接接种法加大培养基用量阳性对照仍无法检出，则采用薄膜过滤法：

（1）试验组：

取1：

10的供试液10ml，用离心机低速离心500r/min离心3分钟，取上清液定容至10ml，加入pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100ml薄膜过滤，用400ml（备注：

具体用量依样品抑菌作用强弱而定，在试验中需设计不同的冲洗量进行冲洗，根据回收率的情况选择不同的冲洗量）pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100ml，过滤后无菌方法取出滤膜，接种至100ml的胆盐乳糖增菌培养基内，加入49cfu大肠埃希菌,350C培养24小时，可见培养基混浊，有气体产生。

取上述培养物0.2ml接种至5mlMUG培养基的试管内，培养5小时、24小时，在366nm紫外线下观察，可见荧光反应，滴加靛基质试液，液面呈玫瑰红色.

（2）阴性菌对照组：

取1：

10的供试液10ml，用离心机低速离心500r/min离心3分钟，取上清液定容至10ml，加入pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100ml薄膜过滤，用400ml（注：

具体用量依样品抑菌作用强弱而定）pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100ml，过滤后无菌方法取出滤膜，接种至100ml的胆盐乳糖增菌培养基内，加入33cfu金黄色葡萄球菌,350C培养24小时，培养基无混浊与气体产生。

取上述培养液0.2ml接种至5mlMUG培养基的试管内，培养5小时、24小时，在366nm紫外线下观察，无荧光反应，滴加靛基质试液，液面均呈试剂本色。

上述方法试验组检出了大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌，说明用100ml胆盐乳糖增菌培养基可以进行参榆灌肠液大肠埃希菌检查。

备注：

如制剂中含生药，需增加大肠菌群检查验证试验；如制剂中含动物药，需增加沙门菌检查验证方法；如制剂为外用药，需增加金黄色葡萄球菌、铜绿杆菌检查验证方法，每个品种具体要求见《中国药典》2010年版附录。

其他控制菌检查常规法、培养基稀释法、薄膜过滤法方法同上述大肠埃希菌检查方法，需使用相应增菌及分离培养基。

如金黄色葡萄球菌使用营养肉汤增菌，甘露醇氯化钠琼脂分离等。

结论：

参榆灌肠液按《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法方法验证试验：

取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1：

10供试液。

细菌、霉菌及酵母菌数测定：

可用常规平皿法（或培养基稀释法、薄膜过滤法）；大肠埃希菌检查可用100ml胆盐乳糖增菌培养基进行增菌培养（或其他量的培养基、薄膜过滤法）,依法检查。

金黄色葡萄球菌采用。

。

。

。

。

。

。

。

依法检查，铜绿假单胞菌采用。

。

。

。

。

。

。

。

。

依法检查。

（备注：

上文中黑体斜体部分文字仅为验证过程中指导之用）