第九节疏水作用色谱.docx

第九节疏水作用色谱.docx

《第九节疏水作用色谱.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第九节疏水作用色谱.docx（16页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

第九节疏水作用色谱

第九节疏水作用色谱

疏水作用色谱（HydrophobicinteractionchromatographyHIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相,以含盐的水溶液作为流动相,利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。

关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。

此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（HighperformancehydrophobicinteractionchromatographyHP-HIC）。

由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品.目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面,成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。

一、疏水作用色谱基本原理

（一）疏水作用

疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础.

根据热力学定律，当某个过程的自由能变化（△G）为负值时,该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。

而根据热力学公式

△G=△H一T△S（6。

9—1）

式中，△G是由该过程的烩变（△H），熵变（△S）和热力学温度（T）决定的.当疏水性溶质分子在水中分散时,会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小（△S<0），致使△G为正值，在热力学上不利.在疏水作用发生时，疏水性溶质分子相互靠近，疏水表面积减少，相当一部分水分子从有序结构回到溶液相中导致熵值增加（△S〉0），引入了负的△G，从而在热力学上有利。

因此非极性分子间的疏水作用不同于其他的化学键，而是由自由能驱动的疏水分子相互聚集以减少其在水相中表面积的特殊作用。

（二）生物分子的疏水性

对于小分子物质,根据其极性的人小可以分为亲水性分子和疏水性分子，一般来说亲水性的小分子是很难与HIC介质发生作用的.但对于疏水作用色谱的主要对象生物大分子如蛋白质而言，其亲水性或疏水性是相对的，即使是亲水性分子也会有局部疏水的区域，从而可能与HIC介质发生疏水作用，因此能够根据其疏水性的相对强弱不同进行分离。

以蛋白质为例，球状蛋白质在形成高级结构时，总体趋势是将疏水性氨基酸残基包裹在蛋白质分子内部而将亲水性氨基酸残基分布在分子表面。

但实际上真正能完全包裹在分子内部的氨基酸侧链仅仅占总氨基酸侧链数的20％左右，其余均部分或完全暴露在分子表面。

蛋白质表面的疏水性是由暴露在表面的疏水性氨基酸的数量和种类,以及部分肽链骨架的疏水性所决定的。

因而可以认为蛋白质分子表面含有很多分散在亲水区域内的疏水区（疏水补丁），它们在HIC过程中起着重要的作用。

然而研究表明不同的球状蛋白质的疏水表面占分子表面的比例差异并不大，但即使是疏水表面比例非常接近的蛋白质,其在HIC中的色谱行为却可能有很大的差别。

造成这一现象的原因是蛋白质分子表面的不规则性，即使是球状蛋白质，其分子表面也远非平滑球面，而是粗糙而复杂的,由于空间位阻的关系,有些疏水补丁是无法与HIC介质发生作用的,因此蛋白质在HIC中的色谱行为不仅取决于分子表面疏水区的大小和疏水性的强弱，还取决于其疏水区在分子表面的分布。

（二）生物分子与疏水作用色谱介质间的作用

HIC介质是在特定的基质如琼脂糖上连接疏水配基如烷基或芳香基团组成的。

HIC介质与具有疏水性的生物分子间的作用被认为与疏水性分子在水溶液体系中的自发聚集一样，是由熵增和白由能的变化所驱动的。

盐类在疏水作用中起着非常重要的作用,高浓度盐的存在能与水分子发生强烈作用，导致可以在疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进了疏水性分子与色谱介质的疏水配基之间发生结合。

因此在HIC过程中，在样品吸附阶段采用高盐浓度的溶液，使得目标分子结合在色谱柱中,而在洗脱阶段,采用降低洗脱剂中盐浓度的方式使溶质与色谱介质间的疏水作用减弱，从而从色谱柱中解吸而被洗脱下来.对于以芳香基团作为疏水配基的色谱介质来说，还存在潜在的发生π-π作用的可能当待分离物质表面具有芳香基时，就会表现出疏水作用和π-π作用的混合分离模式.

较大的生物分子与色谱介质发生结合时的情况是比较复杂的,一般来说每个分子被吸附的过程都会有一个以上的配基参与，换句话说，分子在色谱介质上发生的结合是多点结合。

经研究发现吸附过程是多步反应过程，其中的限速步骤并非酶与色谱介质接触的过程,而是酶在色谱介质表面发生缓慢的构象改变和重新定向的步骤。

（四）疏水作用色谱与反相色谱的区别

从理论上看，HIC和RPC是两种密切相关的液相色谱技术，它们都是基于生物分子表面的疏水区域与色谱介质上的疏水配基（烷基或芳香基）之间的疏水相互作用，然而在分子水平的色谱机理以及实践层面上这两种技术是有所不同的。

RPC介质上疏水配基的取代程度大大高于HIC介质。

RPC介质可以认为是连续的疏水相,其配基如C4~C18烷基的取代程度通常在数百微摩/rnL凝胶;而HIC介质上配基如C2~C8烷基或简单芳香基的取代程度通常在10~50mmol/mL凝胶范围内，可以看作是不连续的疏水相，在与生物分子结合时由一个或数个配基参与。

那么很显然，疏水溶质与RPC介质间的作用力要比HIC介质强得多，需要使用有机溶剂梯度等剧烈的洗脱条件才能将溶质从色谱柱中洗脱下来，对于球状蛋白质，在这样剧烈的洗脱条件下往往会发生变性,因此RPC更适合在水—有机溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分子蛋白质的分离纯化。

而HIC过程的洗脱条件要温和得多，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目的，因此HIC既利用了蛋白质的疏水性质,又能够在更为极性和低变性的环境中进行，因而在蛋白质的纯化中有着更为广泛的应用。

尽管这两种技术都是利用生物分子的疏水性质进行分离,但由于在吸附的分子机理上存在差异，它们对于同一组样品的选择性往往是不同的.例如，有人研究用疏水色谱柱TSKGelPhenyl—5—PW和反相色谱柱SynChropak对12种常见蛋白质进行色谱,对选择性作了比较，如表6.9—1所示，各种蛋白质被洗脱的顺序全然不同。

表6。

9-112种蛋白质在疏水色谱柱和反相色谱柱中的选择性比较

①疏水作用色谱：

色谱柱尺寸55mm×200mm，流动相A为含1。

0mol/LNaSO4的1mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7。

0），流动相B为10mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7。

0），梯度为20min内0~100%B，流速为1mL/min.

②反相色谱：

色谱柱尺寸4.6mm×50mm，流动相A为0。

1%TFA水溶液（pH2。

0），流动相B为含0。

1%TFA的60％异丙醉溶液，梯度为20min内0~100%B，流速为1mL/min。

（五）影响疏水作用色谱过程的参数

影响疏水作用色谱过程的因素来自于固定相类型、流动相组成和色谱条件。

1。

固定相

固定相条件，包括采用基质的类型、配基的种类和取代程度都会影响对样品的分离效果,这也是色谱时合理选择色谱介质的依据。

疏水配基的种类直接决定着目标分子在色谱时的选择性,是选择疏水作用色谱介质时首先要考虑的问题。

常见的配基包括烷基和芳香基两大类，其中烷基配基与溶质间显示出单纯的疏水作用,而芳香族配基往往由于和溶质间存在π-π作用而呈现出混合模式的分离行为。

对于烷基配基，烷基的链长决定着色谱介质疏水性的强弱，同时还影响着色谱介质的结合容量。

在其他条件相同的情况下，HIC介质对蛋白质的结合容量随着烷基链长的增加而增加。

在配基种类确定的情况下，取代程度的高低决定着HIC介质的结合容量和疏水作用强度。

在色谱介质上配基取代程度较低时，随着取代程度的增加。

色谱介质对蛋白质的结合容量会增加，这是由于配基数量的增加使得蛋白质在色谱介质表面的结合位点增多，从而单位体积的色谱介质能够吸附更多的溶质分子。

但是当取代程度达到一定数值后，结合容量就会趋于稳定,此时进一步提高取代程度并不能再增加结合容量.这是由于空间位阻决定了单位色谱介质表面只能结合特定数量的蛋白质，因此当这些表面饱和后结合容量就不再随取代程度而变化了。

但是需注意的是取代程度的进一步上升将会使得与每个蛋白质发生作用的配基数量增加，从而使蛋白质更为牢固地结合于色谱介质上而难以洗脱。

基质同样会对色谱结果产生影响，具有相同配基种类和取代程度但不同基质的吸附剂会具有不同的选择性。

通常HIC介质所采用的是高度亲水性的基质.

2。

流动相

流动相条件对HIC的影响主要表现在所用盐的种类和浓度、流动相的pH，以及其他添加剂的影响。

HIC过程是在高盐浓度下实现样品的吸附，而后在低盐浓度下完成洗脱过程。

显然，流动相中盐的种类和浓度是HIC中至关重要的参数。

不同的离子，特别是阴离子在HIC中的作用是不同的。

有些离子存在于溶液中时会促进蛋白质发生沉淀，它们能够增加疏水作用;而另一些离子的存在却会促进蛋白质的溶解,称为促溶盐类，它们的存在会破坏疏水作用.Hofmeister系列指出了不同离子对疏水作用的影响（表6。

9-2），表中左边的离子能够促进疏水作用，因而经常在HIC中使用，而右边的离子属于促溶离子,它们能破坏疏水作用，有时在对色谱介质进行清洗时可以用来洗脱一些结合特别牢固的杂质。

表6.9—2不同离子对疏水作用强弱产生影响的Hofmeister系列

在所用盐的种类已经确定的情况下，盐浓度的高低会影响到溶质分子与色谱介质的结合强度及色谱介质的结合容量。

盐浓度的升高能促进疏水作用,因此HIC通常都是在高盐浓度下加样并完成吸附，而通过降低洗脱剂中盐浓度的方法进行洗脱。

除此之外，色谱过程的起始盐浓度的高低还会影响色谱介质对蛋白质的结合容量。

流动相的pH对色谱行为的影响比较复杂.多数情况下pH升高会使得疏水作用减弱，而降低pH则增强此作用力，但是对于一些等电点较高的蛋白质，在高的pH下却能够牢固地结合在HIC介质上.

流动相中的其他添加剂主要指能够减弱疏水作用的醇类、去污剂、促溶盐类等，它们的存在能有效地将溶质分子从HIC介质上洗脱下来，同时它们还会影响分离过程的选择性。

但是它们的存在一般会破坏蛋白质等生物大分子的本间结构，使后者丧失部分或全部活性，所以在HIC过程中尽量避免使用此类试剂。

3.色谱条件

除了固定相和流动相之外，色谱过程中的一些其他条件，例如温度、流速等也会影响到色谱结果.其中温度对HIC的影响比较复杂，根据疏水性溶质在水相中相互作用的理论，一方面疏水作用随温度的升高而增强，但另一方面温度的升高会对蛋白质的构象状态和在水中的溶解性等产生影响，从而表现为复杂的特征,由于温度对疏水作用的明显影响,在执行一个特定的色谱任务时应当维持恒定的温度.流速对HIC的影响与其他色谱技术类似，然而由于HIC的分离对象主要是蛋白质这类大分子。

对流速的敏感性相对较低,因此流速的选择主要考虑分离时间和色谱介质类型等因素.

二、疏水作用色谱介质

（一）疏水作用色谱介质的基本结构

HIC介质的结构与其他吸附技术所用的吸附剂类似，由作为骨架的基质和参与疏水作用的配基.

许多类型的基质都可以用来合成HIC介质,但是使用最为广泛的是琼脂糖、硅胶和有机聚合物等.琼脂糖凝胶是很早就被采用的一种基质,至今仍被大范围地使用,其优点是亲水性强，表面经基密度非常大,衍生化后可以产生取代程度和结合容量较大的HIC介质，并且其大孔结构可以容纳体积很大的分子，适合于大分子蛋白质的分离,而且pH稳定性良好。

硅胶的特点是硬度大,够承受很高的流速和压力，有良好的机械稳定性，能适合于在HP-HIC系统中使用。

但是其表面可供衍生的基团少,pH稳定性也差（pH2～8范围内稳定）,因此其应用受到了限制。

但随后诞生了聚合物包裹技术，在硅胶或其他有机聚合物表面包裹一层带有可衍生基团的高分子材料，从而克服了硅胶基质的上述缺点，使其具备良好的色谱性能而被广泛地使用。

HIC介质所用的疏水配基分为烷基和芳香基,与反相色谱介质相比,其烷基通常在C8以下，而很少使用疏水性更强的具有更长碳链的烷基，芳香基则多为苯基.图6.9—1显示了几种经常使用的疏水配基连接至基质的情况。

图6.9—1偶联至基质的常见配基类型

方框内部分为疏配基；斜杠部分代表基质；剩余部分是将配基连接至基质的基团

将疏水配基偶联至基质的方法视基质的表面基团而定,其中最有代表性的是羟基，琼脂糖基团带有大量的羟基、而硅胶及其他聚合物基质也会因表面包裹修饰后带上羟基.将疏水配基连接至羟基通常是使用带有环氧化物基团的配基分子与羟基发生成醚反应而形成稳定的共价键,环氧化物基团反应后开环形成配基与基质之间的连接部分。

式中R——疏水配基;M-—基质。

通过调节两种反应物的比例可以方便地控制所得疏水作用色谱介质的配基密度。

（二）常见疏水作用色谱介质的种类

表6.9-3列出了部分已经商品化的HIC介质（包括部分色谱柱）的类型及特性。

表6.9—3部分商品化的HIC介质和色谱柱的类型及特性

三、疏水作用色谱实验技术

（一）疏水作用色谱介质的选择和色谱柱的准备

由于HIC介质的基质类型、疏水配基类型和取代程度都会影响到色谱行为,因此在选择疏水作用色谱介质种类时对这些因素都需要进行考虑。

基质的类型会影响疏水作用色谱介质的选择性,但这种对选择性的影响往往是难以预测的,因此确定疏水作用色谱介质时带有经验性。

然而色谱过程中需要采用的流速和承受的压力在选择基质种类时必须予以考虑，若操作过程在HPLC系统中进行，则应当选用机械强度较大的刚性基质。

此外，若待分离物质是分子量很大的蛋白质，并且样品量也较大，则应当选择大孔型基质，如琼脂糖凝胶，这样能够获得较高的结合容量;若待分离物质为较小的分子，或者样品量很小，但对于分辨率的要求较高，则可以考虑选用孔径较小的基质甚至非孔型基质，以便获得较高的柱效和良好的分辨率。

疏水配基类型和取代程度实际上决定了色谱介质的疏水性强弱和结合容量的高低，配基（烷基）链越长，取代程度越高，则疏水性越强;反之，链长越短，取代程度低，则疏水性越弱。

在HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4~C8,苯基的疏水性大致与戊基相当，不过由于可能与溶质发生π-π相互作用,它与戊基有着不同的选择性，寡聚乙二醇固定相的疏水性界于丁基与苯基之间.

选用何种疏水程度的色谱介质，最终依据是目标分子的疏水性强弱，总体趋势是在分离疏水性弱的分子时选用疏水性强的色谱介质，分离疏水性强的分子时选用疏水性弱的色谱介质.如果目标分子疏水性很弱，在分离时需要确保有足够强的疏水作用使其能够与色谱介质发生结合,提高结合时流动相的盐浓度是增加疏水作用的方法之一，但如果色谱介质本身疏水性不够强,单方面提高盐浓度将是事倍功半，并且疏水作用色谱时盐的消耗量很大，盐浓度的高低直接关系到分离过程的成本，另外含高浓度盐类的废水在排放时涉及环保问题，因此在可能的情况下，人们更愿意采用盐浓度较低的流动相，此时选用配基链长更长，取代程度更高因而有着更强疏水性的固定相将是十分有效的手段。

反之，如果日标分子疏水性很强,则应当考虑该分子是否会与色谱介质结合得过于牢固而难以洗脱，一般的考察方法是用不含盐的缓冲液作为流动相，看是否能够将目标分子从色谱柱中洗脱,对于特别难以洗脱的物质，原则上通过往流动相中加入非极性溶剂可以达到洗脱目的，但是对于蛋白质等生物分子，有机溶剂的添加很容易造成其失活，因此在这种情况下,人们更愿意选用疏水性较弱的色谱介质以减弱溶质与色谱介质的结合强度。

由于在第一次进行色谱时，样品中目标分子的疏水性并不能确定，因此在选择色谱介质前可以进行一次预备实验对色谱介质进行筛选。

具体的方法一般是选出疏水性强弱存在明显差异的几种色谱介质填充成很小规模的色谱柱，以含有1mol/L硫酸铵的缓冲液作为流动相A，不含盐的缓冲液作为流动相B，采用盐浓度下降的线性梯度进行洗脱，观察目标分子与固定相结合及被洗脱的情况来确定合适的色谱介质.

在色谱柱的选择方面，由于疏水作用色谱属于吸附色谱技术，一般采用较粗而短的色谱柱，其中柱长的选择一定程度上取决于所需的分辨率,而柱内径的大小与分离样品的规模有关.

（二）样品的准备

与其他色谱技术相比,HIC在样品准备方面的要求比较低，一般来说，往色谱柱中加样前无需改变样品的缓冲液体系，所需采取的措施是往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与流动相A中基本一致，并根据需要调节样品溶液的pH使其满足吸附条件。

往样品中添加盐时既可以以固体形式加入,也可以以浓缩盐储液形式加入，前一种方式有时会因为局部盐浓度过大导致出现沉淀,因此后一种加盐方式更为人们所常用.需要注意的是，有时为了确保目标分子发生吸附，需要很高的盐浓度条件，但在此盐浓度下部分样品组分会发生沉淀,为了解决此矛盾，可以采取样品如溶液中盐浓度适当低于流动相A中盐浓度的方式.加样前色谱柱先用流动相A充分平衡，加样时虽然样品中盐浓度较低，但样品进入盐浓度较高的色谱柱后还是能有效发生吸附.

与其他吸附色谱技术类似，HIC的样品体积主要受到样品中组分浓度和色谱介质的结合容量的影响.对于稀释样品无需浓缩可以直接加样。

但如果遇到上述样品溶液盐浓度低于流动相A的情况时一次加样体积不能太大，否则无法确保样品有效吸附，此时如果样品体积较大。

可以采用将样品分做若干份进行加样的方式，加完一份样品后用一定体积的流动相A通过色谱柱，重新提高柱中盐浓度，使组分完成吸附，再进行下一份样品的加样，如此循环直到样品添加完毕。

对于所有色谱实验，黏度过大的样品均会导致色谱结果不理想，遇到这种情况，同样可以通过稀释的方法降低样品猫度。

另外在加样前样品中如有颗粒状物质，必须通过过滤或离心的方法除去.

（三）色谱条件的确定和优化

确定色谱条件的目标是在目标分子达到所需纯度的基础上，获得尽可能高的回收率，同时力求缩短分离所需时间、降低分离成本等.在HIC中，色谱条件主要包括流动相A、流动相B、洗脱方式、色谱柱的柱长、流速、温度等。

流动相A是色谱的起始条件，在绝大多数情况下，人们采用使目标分子结合至色谱柱而疏水性较弱的杂质不被吸附而穿透的方式。

此时需要确定的是流动相A中缓冲液的种类、盐的种类和浓度、pH等条件。

确定缓冲液的种类主要考虑所需采用的pH，缓冲液在此pH附近必须具备强的缓冲能力，此外所用缓冲盐不会对蛋白质的稳定性造成不利影响。

由于流动相中盐浓度主要依靠额外添加的盐类维持，缓冲液中缓冲盐本身的浓度一般不需要很高，通常0.01～0。

05mol/L,仅需具有足够的缓冲能力即可.不同盐类疏水作用的影响在前面已经讨论过，在HIC中最有效并且使用最广泛的盐是（NH4）2SO4和Na2SO4，此外NaCl有时也被使用，不同盐类除了对疏水作用的强度有影响外，在色谱中表现出的选择性也会不尽相同。

所以盐的浓度也随样品中目标分子的疏水性而异，使用（NH4）2SO4作为色谱盐时常用的浓度为0.75～2mol/L，使用NaCl时浓度多在1~4mol/L。

在理想的状态下,所选择的盐的种类和浓度应当能够使得目标分子结合在色谱柱上,而主要的杂质成分不被吸附而穿过色谱柱。

在试探性实验中，1mol/L的（NH4）2SO4是常用的条件，根据洗脱后的出峰情况再对其进行调整。

如果目标分子在洗脱过程的早期就从色谱柱中洗脱，可以适当提高流动相A中盐的浓度,当然也可换用疏水性较强的色谱介质；如果目标分子在洗脱过程中很晚才被洗脱,则可以适当降低流动相A中的欲浓度，或者换用疏水性较弱的色谱介质.流动相A的pH条件对吸附过程至关重要，它直接影响着目标分子在色谱介质上的结合强度及分离过程的选择性。

但是pH对色谱结果的影响并不存在一般规律，因此色谱操作大多是在能够使目标蛋白保持良好稳定性的pH条件下进行的。

如果在这种pH下目标蛋白与色谱介质不能有效结合，或者色谱结果选择性不佳，可以考虑对色谱过程的pH进行优化，即分别在具有不同pH的流动相条件下进行色谱分离，确定分离过程的最佳pH。

当然这个过程也必须考虑到目标蛋白的稳定性，确保色谱分离后目标蛋白有足够高的活性回收率.

当样品被添加至色谱柱，并用1～2个柱体积的流动相A通过色谱柱完成样品的吸附过程后，就要对吸附样品进行洗脱了。

HIC中将样品洗脱的方式主要有3种:

①采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱,随着盐浓度的下降,样品组分与色谱介质间的疏水作用不断减弱从而各组分按疏水性由弱到强的顺序被洗脱，这是HIC中最常用的洗脱方式;②通过往流动相中添加有机溶剂，例如，乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱，极性的降低会大大减弱疏水作用，从而使得一些与色谱介质间存在强疏水作用，较难被洗脱的组分从色谱介质上解吸而被洗脱，这种方式常常与第一种方式结合使用，即洗脱过程中在降低盐浓度的同时逐渐增加有机溶剂的浓度,但由于溶剂的存在往往对生物大分子的稳定性产生不利影响，因此这种洗脱方式仅限于在溶剂中稳定性良好的物质的分离;③往流动相中添加去污剂等试剂进行洗脱，去污剂本身能与色谱介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来，但是去污剂一般会破坏蛋白质的空间结构，并且有的与色谱介质结合过于牢固而难以被清洗下来，对色谱介质的再次使用非常不利，因此这种洗脱方式有较大的局限性，一般在分离膜蛋白时会采用。

对于最为常用的降低盐浓度的洗脱方式，又可分为梯度洗脱和阶段洗脱，其概念在离子交换色谱等节中已有阐述.在进行试探性实验时首选梯度洗脱，并且一般采用简单下降的线性梯度，梯度的终点即流动相B多为不含盐的与流动相A具有相同pH的缓冲液。

一方面，梯度的斜率直接影响着色谱过程的分辨率，斜率较低的梯度能产生好的分辨率，但是另一方面，如果洗脱过程都是从100%的流动相A（或者表示为0%流动相B）过渡到100％的流动相B，斜率降低会使分离所需时间延长.解决这一矛盾的方法有两种，一种是在试探性实验后对梯度进行优化，采用复合梯度，在目标分子的洗脱峰附近降低梯度斜率以获得足够的分辨率，而在其他部分提高梯度斜率以缩短色谱时间，当然这些部分组分间的分辨率会变差,但不会对目标产物产生影响（图6.9—2a）。

另一种优化方法是采用低的梯度斜率,同时根据首次色谱分离时目标分子的出峰位置适当降低流动相A中的盐浓度或增加流动相B中的盐浓度，这样由于梯度的范围变窄，所需时间也会缩短，从而弥补斜率降低对分离时间产生的不利影响.对于特别复杂的样品，还能采用凹形、凸形等更为复杂的梯度形式以达到满意的分辨率。

阶段洗脱的优脱问样有一足的优势在于操作简单，不同批次间重复性良好,因此在大规模分离纯化中较常使用。

在分析型分离时只要流动相条件选择恰当，阶段洗脱同样有一定的优势,可以缩短分离时间，得到浓度较高的分离后产物，同时也能提高分辨率，因为阶段洗脱相当于在每一阶段内部采用斜率为零的梯度进行洗脱（图6。

9-2b）。

图6。

9-2根据试探性实验结果对洗脱进行优化

阴影部分代表目标分子的洗脱峰；直线代表洗脱过程中盐浓度的变化

在HIC过程中温度对色谱结果的影响是显著的，这是由于温度升高会增加疏水作用这在前面已经提到过。

因此从溶质结合至色谱介质的角度看，升高温度是有利的，但是蛋白质等生物大分子在较高温度下会发生变性，所以事实上HIC过程并不主张在升高温度的条件下进行.但是对于特定的分离任务，操作过程的温度需要保持恒