Transwell实验 超详细.docx

Transwell实验 超详细.docx

《Transwell实验 超详细.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Transwell实验 超详细.docx（12页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

Transwell实验超详细

Transwell侵袭实验总结

第一节概念

这里想明白两个概念,一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模子.

关于Transwell这个词该若何解释,查了许多材料也未见精确的注解,我以为可以这么懂得吧,trans这个词根有转移.转运.穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上懂得,这是一类有通透性的杯状的装配,依据Corning公司的Transwell解释书中的介绍,可以以为这是一种膜滤器（Membranefilters）,也可以为是一种有通透性的支架（permeablesupports）.

更精确地说,Transwell应当是一种实验技巧,这项技巧的重要材料是Transwell小室（Transwellchamber,Transwellinsert）,其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,不合厂家对Transwell会有不合的定名,而不合型号也可有不合外形,不合大小,依据实验须要,可有不合选择.

但无论是何种外形,其症结部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与通俗的孔板是一样.这层膜带有微孔,孔径大小有0.1－12.0µm,依据不合须要可用不合材料,一般经常运用的是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）.

下图是一个Transwell装配的纵切面

将Transwell小室放入造就板中,小室内称上室,造就板内称下室,上室内盛装上层造就液,下室内盛装基层造就液,高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔.

我们将细胞种在上室内,因为聚碳酸酯膜有通透性,基层造就液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研讨基层造就液中的成分对细胞发展.活动等的影响.

运用不合孔径和经由不合处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共造就.细胞趋化.细胞迁徙.细胞侵袭等多种方面的研讨.

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择,当然不合细胞其体积不合,具体选择时要斟酌到细胞大小.这里重要谈几种大家经常运用的实验：

（1）共造就系统：

小于3.0um孔径前提下,细胞不会迁徙经由过程,是以,若研讨不涉及细胞活动才能,不须要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0µm以下孔径.经常运用0.4.3.0µm.我们实验室用的是0.4µm.

将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的影响.

（2）趋化性实验

可用5.0.8.0.12.0µm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反应下室成分对上室细胞的趋化才能.

①细胞B对细胞A的趋化感化：

将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研讨细胞B排泄或代谢产生的物资对细胞A的趋化感化.

②趋化因子对细胞的趋化感化：

将细胞种于上室,下室参加某种趋化因子,可研讨该趋化因子对细胞的趋化感化.

（3）肿瘤细胞迁徙实验

经常运用8.0.12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁徙才能.

（4）肿瘤细胞侵袭实验

经常运用8.0.12.0µm膜,道理与肿瘤细胞迁徙实验相似.

上室种肿瘤细胞,下室参加FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向养分成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁徙实验不合的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模拟体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要排泄基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解,方可经由过程聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭才能.

用于研讨肿瘤细胞侵袭才能的肿瘤细胞侵袭模子有如下几种（引自司徒镇强《细胞造就》）：

2.1体内癌细胞侵袭模子

2.1.1皮下移植侵袭模子

2.1.2肌肉内移植侵袭模子

2.1.3腹腔内移植侵袭模子

2.1.4小鼠肾包膜下移植侵袭模子

2.1.5鼠睾丸包膜下移植侵袭模子

2.1.6小鼠耳廓皮下移植侵袭模子

2.1.7鼠爪垫皮下移植侵袭模子

2.1.8视网内界膜侵袭模子

2.2体外癌细胞侵袭模子

2.2.1体外静止器官造就法

2.2.1.1半固体造就基单细胞器官造就法

2.2.1.2液体造就基单细胞器官造就法

2.2.2半体外半体内器官造就法

2.2.3单层细胞器官造就法

2.2.4瘤细胞球体器官造就法

2.2.4.1静止球体器官造就法

2.2.4.2扭转动摇球体器官造就法

2.2.5单层细胞侵袭实验模子

2.2.6Transwell侵袭小室测定法

可见,Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等号,Transwell有多种运用,侵袭实验也有多种办法.所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技巧运用于肿瘤细胞侵袭研讨的一种实验.因为其简略易行.反复性好,因而得到了越来越普遍的运用,但不克不及以为研讨肿瘤侵袭只有Transwell一种办法.

第二节Transwell侵袭实验

我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁徙实验,其他方面的Transwell运用我不太清晰,是以这里重要谈谈Transwell侵袭实验.

1.实验用品：

①Transwell小室：

多种厂家可供给,论坛里经常运用的是Costar.Corning.BD临盆的小室,我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,尚有Boydenchamber.Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert.

这些厂家供给的小室,有的已铺好基质胶,买来就可以用,很便利,但也比较贵,我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的,质量很好,但是异常贵,24孔板配套的小室,每个价钱约130元,不推举给大家.BD也有已包被好的,价钱不清晰.Coster和Corning公司临盆的小室,是论坛里比较经常运用的,似乎是要本身铺胶,但据说每个小室成本只有40阁下,应当比较合适中国国情.

下面是一些战友供给的价钱,具体建议大家接洽代理商咨询.linanping1979战友供给的价钱：

coster的24孔板的transwell的价钱是456元RMB,8µm,用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy战友供给的价钱：

Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的.梅林战友供给的BD价钱：

240RMB一块（6.5um,24孔,12instert）,似乎是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy供给的价钱是：

corningcatNo.3422.6.5mmtranswellwith8.0umprorepolycarbonatemembraneinsert,Qty48,950人平易近币不到.平均每个20元不到.

Transwell小室按照公司的请求,都是一次性运用的.不过其实洗洗泡泡照样可以反复用的.我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶,再用胰酶和75%酒精泡,可以把膜洗得很清洁,用前用紫外里外都照30min.sword01战友供给的处理办法：

用棉签轻轻擦去胶和不和细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,不和6h,微波,低火10min×2.

因为我买的是铺好胶的,所以没买Matrigel,二次运用的小室只用来做不须要铺胶的迁徙实验.以前的ChemiconECM550系列,膜很壮实,擦不坏,可以反复用许多次,但如今的膜已经改用一种很薄很脆的材料,一般只能反复用一次,真黑啊！

许多战友说Costar和Corning也是可以反复用的,大家可以尝尝.

本身没见过,有兴致的可以本身研讨一下.

别的,依据论坛战友供给的信息,osmonic公司有专用的膜出售,鼎国生物代理.Transwell小室用事后,可把本来的膜切下,贴上osmonic公司的膜,如许又可以用了,不过我没用过,有兴致的可以尝尝.maojianwen战友的运用办法：

trasnwell小室做一次后,将本来的膜去掉落,从新泡酸,泡酒精,运用前照紫外,然后用密斯用指甲油（留意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上,剪掉落过剩的边沿.再照紫外.

②上层造就液：

上层造就液采取无血清造就基,为保持渗入渗出压,需参加0.05%0.2%BSA.

③细胞：

值得留意的是,有侵袭才能的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP2的表达.假如不清晰细胞MMPs的表达情形,就盲目进行Transwell侵袭实验,可能会造成不须要的糟蹋,一次Transwell侵袭实验花钱少则数百,多则数千,其实不是笔小数量,照样当心为妙.

别的,为了让实验成果更显著,可先撤血清让细胞饥饿12－24h,再进行实验.

④基质胶：

经常运用的是人工重构基底膜材料Matrigel,重要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原,临盆厂家有BD.美国CollaborativeRsearch公司等.CaoY战友的帖这么说的：

Matrigel是BD公司临盆的,是一种细胞外基质,4度时是液体,在37度会逐渐凝固成胶状,不成逆.同样的器械在sigma叫ECM.zhangyong1036战友供给的价钱：

BD公司的matrigel1500阁下.

假如购置的小室是已经铺好基质胶的,那么Matrigel就不须要购置了.

⑤基层造就液：

基层经常运用含5%－10%FBS的造就基,具体浓度依据细胞侵袭力而定,侵袭力衰的细胞可恰当进步FBS浓度.基层也可用趋化因子,有战友将纤维粘连蛋白参加基层造就液作为趋化因子,但小我以为,FBS仍是最合适的.

⑥细胞造就板：

经常运用于Transwell侵袭实验的细胞造就板有6孔板.12孔板.24孔板等,以24孔最经常运用.细胞造就板没什么特别请求,通俗的细胞造就板就可以.但要留意,细胞造就板应当与购置的Transwell小室相配套.

⑦此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin,FN,Sigma有售）,如许做的目标是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.许多战友以为这不是必须的,并且我也是不涂的,细胞照样贴壁很好.假如贴壁不好的话可以尝尝看.linanping1979战友以为,假如造就时光很长（>24h）,细胞照样会掉落到下室里面去,所以有前提的话,最好照样在膜基层涂上FN.

别的,值得一提的是,膜基层涂上FN还有必定的趋化感化.

2．步调

2.1Transwell小室制备

2.1.1无基质胶Transwell小室制备

①包被基底膜：

用50mg/LMatrigel1:

8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干.假如须要鄙人室面铺FN的话,可将200ul枪头的尖端剪掉落,汲取FN平均涂抹在小室的下面.用胶原（collagen）的话,一班配成0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上.

②水化基底膜：

吸出造就板中残存液体,每孔参加50ul含10g/LBSA的无血清造就液,37℃,30min.

尚有tianjin_glioma战友供给的办法：

在上室的聚碳酸酯膜上参加稀释后的Matrigel（3.9ug/ul）6080µl（留意体积不成太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好）,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶.

2.1.2有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列解释书请求,将小室放入造就板中,在上室参加300µl预温的无血清造就基,室温下静置15－30min,使基质胶再水化.再吸去残剩造就液.

2.2制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.

②消化细胞,终止消化后离心弃去造就液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清造就基重悬.调剂细胞密度至1－10×105,小我以为不要超出5×105.

具体实验时采取密度要本身探索,因为不合细胞,其侵袭才能是不合的.小我经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,假如最后用计数法统计成果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时光点,所有的细胞都已穿过,是以起码也要包管在收样的时刻,上室内还要有必定量的细胞消失.

小我以为,对比组和处理尽量不要离开计数,因为细胞数量标差别会轻微影响实验成果.假如须要对细胞预处理而不克不及不离开计数,那么计数必定要多反复几回,力图精确,尽量包管对比组和处理组细胞密度一致.

2.3接种细胞

①取细胞悬液100－200µl参加Transwell小室,不合公司的.不合大小的Transwell小室对细胞悬液量有不合请求,请参考解释书.24孔板小室一般200µl.

②24孔板下室一般参加500µl含FBS或趋化因子的造就基,不合的造就板加的量有不合请求,具体请参考解释书.这里要特别留意的是,基层造就液和小室间常会有气泡产生,一旦产朝气泡,基层造就液的趋化感化就削弱甚至消掉了,在种板的时刻要特别留意,一旦消失气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进造就板.

③造就细胞：

通例造就12－48h（重要依癌细胞侵袭才能而定）.时光点的选择除了要斟酌到细胞细胞侵袭力外,处理身分对细胞数量标影响也不成疏忽.

以我的课题为例,我运用的药物不但会克制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有显著克制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50.用这个浓度处理细胞,24h内对细胞增殖并没有显著克制,但24h后,克制造用就开端消失了.所以,用这个浓度来做Transwell,处理时光也必须限制在24h内,不然一旦药物克制了细胞增殖或者引诱出凋亡,使处理组细胞数量少于对比组,那么就难以确定穿过膜的细胞比对比组少,毕竟是因为侵袭被克制引起,照样处理后细胞数量本身就比对比组少而引起的了.

时光过长不成以,同样,过短也不成,因为细胞内会有必定量的MMPs储存,短时光内可能侵袭才能不会有太大转变.同时从药物被接收进去,进而施展感化,影响MMPs表达,到最后释放到造就基中,还须要一个进程.时光点的选择可尽量长点,也可选择多个时光点研讨时光依附效应,但前提是这个时光规模内细胞数量不克不及有显著变更.

别的,我看到细胞在小室内的形态不是正常造就贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会集合成团,所以看到细胞不正常贴壁也没紧要张,是正常现象

在造就进程中,膜下会逐渐有少量吝啬泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我碰到过造就一段时光后,膜下消失了大气泡,亏得实时发明,不然效果将异常轻微.是以,小我建议,最好接种细胞后1－2h把造就板从造就箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生.

2.4成果统计

检测穿过的细胞数有两种办法：

2.4.1直接计数法

2.4.1.1“贴壁”细胞计数

这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉落到下室里面去.如下图：

经由过程给细胞染色,可在镜下计数细胞

①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

②染色：

经常运用的染色办法有结晶紫染色.台肦蓝染色.Giemsa染色.苏木精染色.伊红染色等.

小我推举采取0.1%结晶紫染色,这种办法有如下优势：

（1）.不须要固定细胞,直接染色即可.

（2）.配制简略便利.（3）.染色后可以用33%醋酸脱色,将结晶紫完整洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值,间接反应细胞数.小我以为这是结晶紫染色最大的优势地点.因为,固然经由精确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以精确掌握,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,乃至细胞成堆,这种情形下就难以计数了,这种情形下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.运用结晶紫染色要留意,染色前要将膜风干,不然可能会染不上.

③细胞计数：

我们运用的是LeicaDC300F正置显微镜进行不雅察和摄影,把Transwell小室反过来底朝上就可清晰看到小室底膜高低室侧附着的细胞.也有许多人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保管,但是如许做小室就成了一次性的了,不免难免有点糟蹋.

取若干个视野计数细胞个数.论坛里一般采取3－5个视野,也有人用10个,都是随机拔取,小我以为如许选择的视野带有很大的有时性,也会掺进工资影响,特别是计数视野较少的时刻.我拔取16个视野,不是随机选择,而是有固定的地位.我们运用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.

如图,蓝色部分暗示膜的大小,白色圆形暗示视野的大小,绿色方形则暗示摄影时所能拍下的视野的中间部分.如许,每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数,如许得到成果是比较客不雅和精确的.

2.4.1.2“非贴壁”细胞计数

因为某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不克不及附着在膜上,而是掉落进下室.如下图：

2.4.2间接计数法

间接计数法重要用于穿细致胞过多,而无法经由过程计数获得精确的细胞数所采取的办法,与经常运用的MTT实验是同样的道理.

2.4.2.1MTT法

①用棉签擦去基质胶和上室内的细胞

②24孔板中参加500µl含0.5mg/mlMTT的完整造就基,将小室置于个中,使膜浸没在造就基中,37℃4h后掏出.

③24孔板中参加500µlDMSO,将小室置于个中,使膜浸没在DMSO中,振荡10min,使甲臜充分消融.掏出小室,24孔板于酶标仪上测OD值.

2.4.2.2荧光试剂检测

这类办法一般是与Transwell小室一路出售的,其道理与MTT法相似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值.Chemicon的ECM554即属于这类.

2.4.2.3结晶紫检测

上文已说过,这里不再赘述,道理与MTT法也是相似的.但结晶紫染色还有个长处,就是染色和脱色的进程其实不影响膜上细胞,在脱色后还可从新染色.

这是用正置显微镜拍摄的图,结晶紫染色,进行细胞计数.

第三节Transwell的其他运用的实验步调

1．Transwell肿瘤细胞迁徙实验

进程与Transwell侵袭实验根本一致,不合的只是不须要铺Matrigel.小我以为,因为没有基质胶的阻拦,细胞穿过膜的速度较侵袭实验显著加速,所以细胞量要更大.我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁徙实验的密度是1×106.别的,基层造就液的FBS浓度也可恰当下调,我做侵袭实验的浓度是5%,迁徙实验的浓度是2.5%.

2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞造就步调

做了一段时光的原代细胞造就,把经验拿出来跟大家分享一下吧,请有关战友配合商量：

（1）将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管掏出,置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV（Sigma）,100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（GibcoBRL）.无Ca2＋.Mg2＋,无血清的MEM.

（2）用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞.

（3）离心后立刻用新颖的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5％胎牛血清.100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的LHC8medium（Biofluids）冲洗一次.

（4）冲洗事后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活气,若存活率大于90％,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12mmSNAPWELL,Costar）,以37°C5％CO295%空气含5%胎牛血清（GibcoBRL）and100U/ml青霉素and100ug/ml链霉素的LHC8medium孵育6~10天.

（5）孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电心理实验.

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中心,发展时常彼此慎密衔接成单层细胞片

3.metastasis战友的TranswellB16细胞的体外迁徙实验

我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁徙实验,具体是这么做的：

起首把Transwell倒置,在Transwell的PVPF膜（0.8um）的下概况涂一层fibronectin（10ug/ml,50ul）,37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600ul的造就基（含10%血清）的24孔板内,后在Transwell的闺阁参加细胞（100ul,用含0.1%血清的造就基稀释好本身所需密度）,放入造就箱,1218小时后,掏出Transwell,用棉签擦去PVPF膜接近闺阁那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下不雅察细胞,记数.

4．mci战友的内皮细胞HMEC1迁徙实验

1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于造就箱中均衡1小时后,上室参加100µl用serumfreeMCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不合浓度的药物,下室参加0.6mlserumfree的MCDB131培液及20%FCS刺激迁徙,同时设置响应阴性及阳性对比,置于CO2造就箱中感化8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉落上层未迁徙细胞,显微镜（Olympus,DP50,Japan）.下不雅察并摄影,最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD值.克制率盘算公式为：

克制率（%）=[（OD值给药组OD值无刺激阴性对比）/（OD值不加药阳性对比OD值无刺激阴性对比）]×100%.