发育期大鼠反复痫性发作后远期学习记忆障碍及海马神经元可塑性的研究.docx
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发育期大鼠反复痫性发作后远期学习记忆障碍及海马神经元可塑性的研究
发育期大鼠反复痫性发作后远期学习记忆障碍及海马神经元可塑性的研究
作者：
罗平香,唐洪丽
单位：
东南大学临床医学院儿科学教研室，江苏南京210009
【摘要】目的探讨发育期大鼠反复痫性发作对大鼠成年后学习记忆及海马神经元可塑性的影响。
方法生后10dSD大鼠32只，随机分为实验组16只和对照组16只。
实验组用戊四氮（PTZ）反复腹腔注射5d，制成反复痫性发作模型，对照组腹腔注射等量生理盐水。
在生后第60天用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆功能，用RTPCR方法检测大鼠海马神经元可塑性标志物神经生长相关蛋白43（GAP43）mRNA的表达变化。
结果与对照组比较,实验组在Morris水迷宫测试中平均逃避潜伏期明显延长（P<0.05）,原平台所在象限的游泳时间明显缩短（P<0.05）;海马组织GAP43mRNA的表达显著增多（P<0.05）。
结论发育期大鼠反复痫性发作可引起远期学习记忆损害及海马神经元激活和突触重建等神经元可塑性改变，而GAP43表达增多可能是学习记忆功能和可塑性变化的分子机制。
【关键词】癫痫;发育;学习记忆;神经生长相关蛋白43;可塑性
LongtermeffectsonlearningandmemoryandhippocamusneuroplasticityinimmatureratsfollowingrecurrentseizuresLUOPingxiang,TANGHongli（DepartmentofPediatrics,SchoolofClinicaldicine,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China）bstract:
ObjectiveToexploretheeffectsofrecurrentseizuresinimmatureratsonlearningandmemoryandhippocamusneuroplasticitywhentheanimalswereinadulthood.MethodsRatsatpostnatalday10（n=32）weredividedintoexperimentalgroup（n=16）andcontrolgroup（n=16）.Ratsintheexperimentalgroupweretreatedwithpentylenetetrazol（PTZ）dailybyintraperitonealinjectionfor5consecutivedaystoinducerecurrentseizureandratsinthecontrolgroupwereinjectedwithnormalsalinefor5consecutivedays.Allratsatpostnatalday60weretestedforspatiallearningandmemorybyMorriswatermazetask.TheexpressionsofGAP43mRNA,themarkerforneuroplasticityinhippocampusweredetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction.ResultsIntheexperimentalgroup,themeanescapelatencyofsearchingtheplatformsignificantlyprolonged（P<0.05）andswimmingtimeintheoriginalplatformregionsignificantlyshortened（P<0.05）inMorriswatermaze.TheexpressionofGAP43mRNAinhippocampusintheexperimentalgroupwassignificantlyincreasedthanthatinthecontrolgroup（P<0.05）.ConclusionThesefindingsindicatethatrecurrentseizureinimmatureratshavelongtermdetrimentaleffectsonlearningandmemoryandchangesofhippocamusplasticity,suchassynapticreoganizationandtheactionofneuron.GAP43increasingmaybethemolecularmechanismsforlearningandmemoryandhippocamusneuroplasticity.
Keywords:
epilepsy;development;learningandmemory;neuronalgrowthassociatedprotein43;neuroplasticity
（ModernMedicalJournal,2009,37:
333336）
对成年动物的研究发现,反复痫性发作可引起海马神经元坏死、代偿性苔藓纤维发芽，导致突触重组,形成异常通路，造成学习、记忆和行为的长期缺陷[1]。
未成熟脑处于不断生长发育、功能逐步完善的动态变化之中，与成熟脑有很大的区别，目前对于发育鼠的研究国内外报道尚少。
本研究以戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ）诱导生后10d大鼠建立反复痫性发作模型，追踪至大鼠成年后用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆功能，用RTPCR方法检测大鼠海马组织神经元可塑性标志物神经生长相关蛋白（neuronalgrowthassociatedprotein,GAP43）mRNA的表达变化，探讨发育期大鼠反复痫性发作可否引起远期学习记忆损害及海马神经元激活和突触重建等神经元可塑性的改变，并探讨可能的分子机制。
1材料与方法
1.1材料及仪器
PTZ（美国Sigma公司）;GAP43、GADPH引物由上海生物工程公司合成，序列如下：
GAP43上游引物5′ATGATGCTCCCGTTGCTGAT3′,下游引物5′GCACATCGGCTTGTTTAGGC3′，产物片段长度276bp;GADPH上游引物5′CGGGAAGCTTGTCATCAATGG3′，下游引物5′GGCAGTGATGGCATGGACTG3′，产物片段长度358bp;RNA提取试剂Trizol（美国Invitrogen公司）;逆转录试剂盒（美国Promega公司）;Taq酶（日本TaKaRa公司）;大鼠Morris水迷宫（中国药科大学）。
1.2动物分组及模型制备
生后10d健康清洁级SD大鼠32只（由东南大学医学院实验动物中心提供,12h光亮/黑暗条件,22～25℃环境温度,由母鼠喂养，每窝崽数不超过10只）,随机分为PTZ模型组16只和生理盐水对照组16只。
参照文献[2]提供的方法，模型组首次腹腔注射惊厥阈下剂量PTZ40mg•kg-1，10min后注射20mg•kg-1，以后每10min注射10mg•kg-1，直至出现4级以上的惊厥发作（发作的严重程度按照Lado幼鼠癫痫发作分级标准[3]：
0级，无发作;1级，机械性咀嚼;2级，连续性点头;3级，单侧前肢阵挛;3.5级，前肢交替阵挛;4级，双侧前肢阵挛、后退;5级，双侧前肢阵挛、后退、摔倒;6级，狂奔嘶叫;7级，强直发作），如此反复注射5d。
对照组给予腹腔注射等量的生理盐水。
1.3Morris水迷宫测试
大鼠进入成年（第60天）后，对模型组16只和对照组16只行Morris水迷宫测试，连续5d，以评价其空间学习和记忆能力。
程序包括：
（1）定位航行实验:
用于检测大鼠对水迷宫的学习和记忆能力。
历时4d,每天8次,将大鼠从4个入水点面向池壁放入水中,记录大鼠从入水到爬上平台所需的时间（逃避潜伏期）。
如果大鼠在120s内不能找到平台，就将其引至平台，将逃避潜伏期记为120s。
每次放大鼠入水前都要将其放在平台上停留30s，使其熟悉水迷宫周围的标志物，以便记忆平台的位置。
每次训练间隔60s，取8次的平均值进行统计。
（2）空间探索实验:
用于检测大鼠学会寻找平台后对平台空间位置的记忆能力。
定位航行实验结束后撤除平台,然后将大鼠任选一入水点放入水中,测其120s内在原放有平台的象限内停留的时间。
1.4用RTPCR检测海马组织GAP43mRNA的表达
完成Morris水迷宫测试后，直接断头取双侧海马,生理盐水冲洗后，置-80℃冰箱中保存。
采用Trizol一步法提取总RNA,按试剂盒说明书进行操作。
PCR扩增条件：
94℃预变性5min;94℃变性45s，55℃（以引物序列后退火温度为主）复性45s，72℃延伸1min，这样反复循环35次;72℃延伸10min。
反应结束后，取反应液10μl进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。
用ImageMasterVDS图像分析处理系统扫描，以GAP43/GAPDH吸光度比值作为GAP43mRNA的相对表达水平。
1.5统计学处理
用SPSS11.5软件进行处理,数据用x-±s表示,组间均数的比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1Morris水迷宫实验结果
2.1.1定位航行实验结果随着大鼠学习次数增加,两组大鼠寻找平台的潜伏期逐渐缩短。
与对照组比较,模型组大鼠平均逃避潜伏期明显延长（P<0.05）。
见表1。
表1两组大鼠逃避潜伏期的比较（
2.1.2空间探索实验结果模型组大鼠120s内在原放有平台的象限内停留的时间为（35.63±5.17）s，而对照组为（52.59±6.98）s，两组比较有显著性差异（t=2.543,P<0.05）。
2.2海马组织GAP43mRNA的表达
模型组GAP43mRNA的相对吸光度值为0.628±0.103，与对照组（0.306±0.087）比较差异有统计学意义（t=2.701,P<0.05），见图1。
M.Marker;1.对照组;2.模型组
图1大鼠生后第65天海马GAP43mRNA表达
3讨论
大量临床研究表明，在伴有海马硬化性颞叶癫痫的成人患者中有相当高的比例可追问到儿童早期有反复痫性发作史，因此，幼年早期有过痫性发作对个体生长发育有何长远影响，一直是备受关注的问题。
近年来发育脑癫痫点燃模型研究发现，发育脑反复点燃后海马神经元并无明显损伤，发育鼠经历比成熟鼠更长的惊厥发作,神经元脱失却明显低于成熟鼠,提示发育鼠脑内可能存在保护机制[4]。
但这种保护机制并不是绝对的。
本实验结果显示,在Morris水迷宫测试中,与对照组比较,模型组大鼠平均逃避潜伏期显著延长,原平台所在象限的游泳时间明显缩短，可见发育期大鼠反复痫性发作可引起远期学习记忆损害。
GAP43是神经元特异性胞膜磷酸蛋白，广泛分布在神经元中，特别在生长、分化、再生的轴突末端含量极高，在神经纤维的生长、发育、轴突再生以及突触功能的维持方面起着重要作用，是当今研究脑损伤修复和神经可塑性的一种首选标志物[5]。
研究已证实大体有两种类型突触可塑性变化与GAP43的表达相关:
（1）突触形态结构变化可导致GAP43表达的升高;
（2）由长时程增强（longtermpotentiation,LTP）和长时程抑制（longtermdepression,LTD）所引发的突触效能的变化,可影响GAP43的磷酸化状态和其mRNA的表达[6]。
动物过度表达高水平的外源基因编码GAP43会导致异常的突触联系形成。
将GAP43基因整合到非神经细胞中可以诱导形成神经突起样伪足。
癫痫动物模型研究发现，在伴随动物点燃后海马苔藓纤维出芽的同时，GAP43有明显的表达增高。
病理研究发现，癫痫患者神经元坏死后随之将有神经元异常的侧枝出芽及反应性突触再生，此时，GAP43的表达也明显增加。
转基因鼠研究发现GAP43过量表达可引起神经元异常重组的自发形成。
在注射海人酸致大鼠痫性发作后2个月，在齿状回内分子层可出现较强的GAP43染色，与用Timm染色在内分子层检出的苔藓纤维出芽有关[7]。
本研究用RTPCR检测海马神经可塑性标志物GAP43，结果显示模型组大鼠GAP43mRNA表达明显高于对照组，提示海马有苔藓纤维出芽和新突触的形成，说明发育期大鼠反复痫性发作后可引起远期海马突触重组及神经元可塑性的改变。
本实验结果说明，未成熟脑经过反复痫性发作后导致远期海马神经元激活和突触重建等海马神经元可塑性改变，而GAP43可能是这种可塑性变化的分子基础。
学习记忆是一个复杂的过程，癫痫对学习记忆功能损害的确切机制还不清楚。
神经系统的突触可塑性是学习记忆功能的基础，大量研究证明，改变突触可塑性形成机制可影响学习和记忆，且在学习记忆的相关脑区可见突触重塑[8]。
本实验发育期大鼠反复痫性发作后引起认知功能障碍可能与海马神经元之间形成异常的突触联系，建立病理性神经环路等神经元可塑性的改变有关。
模型组大鼠学习记忆功能损害的同时，海马组织GAP43过度表达，猜测GAP43可能通过改变突触形态结构的可塑性以及由LTP和LTD所引发的突触效能的可塑性,来参与体内学习记忆过程中的一系列环节,它们对于突触可塑性的作用是一个综合、复杂的过程,其内在机制仍有待进一步深入研究。
研究突触可塑性的分子机制,对揭示学习和记忆的神经基础有重要意义。
总之，本实验结果提示发育期大鼠反复痫性发作后可导致远期学习记忆损害及海马神经元激活和突触重建等神经可塑性改变，提醒人们应该关注早期脑发育中反复痫性发作的长期结果。
婴幼儿时期大脑处于不断生长发育、功能逐步完善的动态变化之中，神经元可塑性较大，是各种脑损伤康复治疗的最佳时期。
但海马齿状回神经元的再生过程和机制尚不清楚，目前认为受众多因素的调节和影响。
本实验结果提示GAP43可能参与了神经元再生过程的调节，可能是学习记忆功能和可塑性变化的分子机制，为婴幼儿时期痫性发作脑损伤后康复治疗提供了新的思路。
而GAP43具体的表达调控机制，有待更深入的研究。
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申明：
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