医疗药品药用植物组织培养实验指导.docx
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医疗药品药用植物组织培养实验指导
甘肃农业大学农学院
药用植物组织培养实验指导
柳福智编
农学院中草药栽培与鉴定教研室
2007年8月
前言
药用植物组织培养实验是根据中草药栽培与鉴定专业的培养要求，为学生开设的一门实验课程。
药用植物组织培养实验的任务是使学生加深对药用植物组织培养基本理论的理解，掌握药用植物组织培养实验的基本操作技能，学习药用植物组织培养实验的基本知识，养成严格、认真和实事求是的科学态度，提高观察、分析和解决问题的能力，为将来参加工作打下良好的基础。
编者
2007年8月
学生实验守则
1、实验前认真预习，领会实验原理，明确本次实验的目的和要求，了解实验步骤和注意事项。
2、实验时要严格按照规范操作进行，仔细观察实验现象，认真记录有关数据。
3、要认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁。
4、学生进入实验室必须严格遵守实验室规则，服从带教老师的指导。
5、爱护实验室的仪器设备，不准将实验室的仪器设备私自带出室外。
6、严格遵守操作规程及实验时应注意的事项，在使用不熟悉其性能的仪器和药品之前，应查阅有关资料或请教指导教师，不要随意进行实验，以免损坏仪器，浪费试剂，使实验失败，更重要的是预防发生意外事故。
7、实验过程中应注意防火灾、防爆炸、防腐蚀、防污染工作，牢固树立“安全第一”意识。
8、实验结束后，一切仪器试剂应放回原处，玻璃仪器要清洗干净，一些有毒、有腐蚀性的废液应倒入废液缸内。
9、实验台面要擦试干净，由值日生负责安全卫生工作，包括清理实验室，检查水、电的开关，清除垃圾和污物，关好门窗后方可离开实验室。
药用植物组织培养实验报告一般包括以下内容和要求：
（1）实验名称、实验日期。
（2）实验目的写明通过本实验要达到的训练目的。
（3）实验原理用文字表述本实验的基本原理。
（4）操作步骤简明扼要叙述实验的操作步骤。
（5）实验数据的处理及结果。
（6）问题及讨论应对实验中观察到的现象及实验结果进行分析和讨论，如果实验失败，要寻找失败原因，总结经验教训，以提高自己的基本操作技能。
实验一组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌.............
实验二母液的制备及培养基的配制、灭菌...............
实验三药用植物茎尖培养............................
实验四药用植物的花药培养.........................
实验五试管苗的移栽...............................
实验一组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌
一、目的要求：
1．通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。
2．通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。
二、实验内容
了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。
植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。
三、实验原理
实验仪器的清洗、消毒和灭菌是组织培养成功的关键所在，是外植体免受污染的前提。
由于灭菌剂的种类不同，所以选择消毒剂既要考虑良好的消毒、杀菌作用，同时易被蒸馏水冲洗掉。
四、实验仪器与材料：
高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、双筒解剖镜、酸度测定仪、空调机、控温仪、百分之一与万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及镊子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、浓硫酸等。
五、方法和步骤：
首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铬酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铬酸洗液可反复使用，直到溶液呈青褐色为止。
此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。
每人清洗部分玻璃器皿，方法：
清水洗净→泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。
然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：
采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。
带有石蜡或胶布的器皿：
先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。
对器皿和用具进行高压灭菌，即用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持15~20分钟。
解剖刀、手术剪、解剖针、镊子等用具在接种前还要用百分之七十的酒精棉球擦一下，再用酒精灯的火焰灭菌，冷却后即可应用。
六、作业：
试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？
实验二母液的制备及培养基的配制、灭菌
一、目的要求：
通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。
二、实验内容
学习母液和培养基的配制，灭菌的方法。
三、实验原理
植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择一个符合试验材料需要的适宜培养基。
大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。
四、实验仪器与材料
高压灭菌锅、冰箱、普通及精密天平、电炉、铝锅、玻璃器皿（烧杯、量微、容量瓶、移液管、试剂瓶、三角瓶、漏斗），化学试剂（CaCl2·2H2O，KNO3，MgSO4·7H2O，
NH4NO3，KH2PO4，Na2—EDTA，FeSO4·7H2O，MgSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，H3BO3，KI，NaMoO4·2H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，若干种生长调节物质及天然复合物，HCL,NaOH,酒精），以及称量纸、药匙、玻璃棒、精密度纸，瓶盖用纸，线绳或橡皮筋、铅笔、标签纸。
五、方法和步骤
1、母液的配制
母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素和铁盐等。
配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO2-4,Ca2+,Mg2+和PO3-4一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。
配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。
现以Murashige和Skoog（1962）培养基为例叙述如下：
根据各种药品的特点，母液可配成4种。
母液Ⅰ：
把大量元素按培养基配方的20倍浓度混合在一起。
KNO338克
NH4NO333克
MgSO4/7H2O7.4克
KH2PO43.4克
CaCl2/2H2O8.8克
加水定容至1000毫升，配1升培养基时，吸收50毫升，注意CaCl2应待其它度剂彻底溶解后再加入，否则易出现沉淀。
母液Ⅱ：
把硼、锌、锰、铜、钴、钼等微量元素，接培养基配方浓度的1000倍浓缩配制在一起。
MnSO4*4H2O22.3g
ZnSO4*7H2O8.6g
H3BO36.2g
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野生药用植物驯化实验指导
甘肃农业大学农学院
野生药用植物驯化实验指导
陈垣编
农学院中草药系
2007年8月
前言
本实验指导是《野生药用植物驯化》课程的配套实验教材，根据本系多年的野生药用植物驯化经验经反复修改、充实编撰而成，其内容包括：
野生药用植物种子休眠特性的测定、野生药用植物资源调查、野生药用植物种子采集、田间覆盖试验、营养繁殖试验、高原野生药用植物引种观察等，除常规驯化栽培实验外还注意结合高难度名贵稀缺药用植物驯化技术，以提高学生实际应用技能，注意突出对学生独立工作能力的训练和培养。
本实验指导适用于中草药栽培与鉴定专业本科生实验教学，亦可作为农林等其他有关专业学生及教师的参考用书。
编者
2007年8月
学生实习守则
一、学生实验期间不得准无故缺席、迟到、早退。
二、完成每次实验任务后，及时认真撰写实验报告。
三、严禁实验报告相互抄袭，一经发现按当次实验成绩为零计算，并从新撰写实验报告。
四、按各次实验成绩和综合实验成绩计算实验成绩，实验成绩占综合考评成绩的20%。
五、实验操作要认真细致、数据真实。
六、防止实验设备损坏、因粗心或操作不当造成设备损坏要赔偿。
七、每次实验结束，检查实验室设备关闭，整理放归原处，清洁实验室，指导教师许可后方可离开。
实验报告的基本内容和要求
实验报告的基本内容
按照实验指导书各次实验作业内容撰写实验报告。
实验报告格式：
实验题目
实验小组学生姓名（空格间隔）（班级）
（甘肃农业大学农学院）
一、目的意义
二、材料与方法
包括材料与资料数据来源、试验方法。
三、结果
四、讨论与结论
参考文献
作者姓名，论文题目，期刊，卷（期），年份：
页码
实验一野生药用植物种子休眠特性的测定...............................................
实验二野生药用植物资源调查..................................................................
实验三野生药用植物种子采集及贮藏......................................................
实验四田间覆盖试验...............................................................................
实验五营养繁殖试验...............................................................................
实验六高原野生药用植物引种观察........................................................
实验一野生药用植物种子休眠特性的测定
一、实验目的
了解植物种子的休眠特性。
掌握打破种子休眠的方法。
二、实验内容
测量植物种子的休眠特性、打破种子的休眠。
三、实验原理
（一）休眠机理
种子休眠是种子的一种生理现象，是植物长期适应气候变化的结果。
它对维持植物的生命，繁衍后代具有深远意义，但对于种子繁殖栽培来说，它无疑给我们造成了很大麻烦和困难。
种子休眠的原因主要有以下几种。
1复被结构的限制
复被结构是指胚的外围结构，包括果皮、外果皮、外稃、内稃、颖片、种皮、外胚乳、胚乳等。
其中种皮是因复被结构限制而引起种子休眠的主要结构。
复被结构引起的种子休眠主要是由于其不透性限制或机械阻碍作用而造成的。
1.1复被结构的不透性限制
不透性限制从四个方面影响种子萌发。
1）阻止水分吸收：
不透水的种子也叫硬实。
这类种子的种皮极为坚硬，或者很厚。
由于不能吸水，种子内原生质处于凝胶状态，呼吸强度很低，物质转化也很缓慢，从而造成种子不能萌发。
2）阻止气体交换：
不能进行气体交换，种子就得不到足够的氧气进行呼吸作用。
同时，种子内产生的二氧化碳气体也不能及时排出，致使种子内二氧化碳不断积累，这样就会造成种子代谢障碍，从而影响种子发芽。
3）阻止胚内抑制剂逸出：
种子胚中含有一定量的发芽抑制剂，复被结构有明显阻碍胚中抑制剂逸出的作用，从而使胚中抑制剂过多而不能萌发。
4）阻碍光线到达胚部：
有些光敏感种子，由于复被结构的滤光器作用，能改变进入胚的红光的比例，从而决定光敏素是否活化，并最终决定种子是否休眠。
1.2复被结构的机械阻碍作用
有的种子因种皮坚硬，膨胀的胚不能冲破种皮而使种子处于不能发芽状态。
2胚未成熟
胚未成熟主要有两种情况，一是胚未发育完全，一是胚虽发育完全但未完成生理后熟。
这两种情况下，种子都不能正常发芽。
2.1胚未发育完全
有的种子虽然已经脱离母体，从外形上看似已成熟，但胚尚未发育完全，需要在贮藏期间继续生长，待胚发育完全后，种子才能萌发。
2.2胚尚未完成生理后熟
有的种子在成熟时胚已发育完全，但在适宜条件下也不能萌发，需要经过一段时间，在胚部发生一系列生理生化反应后才能萌发。
3萌发抑制剂存在
萌发抑制剂的种类很多，有挥发油、生物碱、有机酸、酚、醛等。
其存在部位也不确定，可能存在于复被结构中，也可能存在于胚中，或者两者中都存在。
4综合休眠
综合休眠就是兼有种皮障碍和胚体休眠的种子。
这类种子萌发时，既需要克服复被结构（种皮）阻碍，又要克服胚的生理休眠，所以其发芽相当困难。
（二）打破休眠的方法
1解除复被结构障碍
1.1物理处理
用手工或机械方法去除或刮破复被结构（主要是种皮），使种子可以吸收水分，进行气体交换。
切割种皮时应注意不要伤害到胚。
1.2化学处理
酸处理：
把种子放在浓硫酸或硝酸种浸泡30min，然后用水冲洗干净，或酸处理后再划痕。
酸处理可使坚硬的种皮软化，容易透气透水。
碱处理：
用一定浓度的碱溶液浸泡种子，可使颖苞外的大部分蜡质脱落，从而增加透性，打破种子休眠。
2解除化学抑制因素
2.1植物激素处理
某些植物激素，如赤霉素、乙烯利、激动素等有促进种子发芽的作用。
用适当浓度的植物激素处理种子可以使休眠种子中存在的化学抑制剂钝化或失效。
2.2其它化学药剂处理
除了植物激素外，其他一些化学物质也可以打破种子休眠或促进非休眠种子萌发。
这些物质包括酸碱、无机盐类、有机物、氰化物及其它呼吸抑制剂，某些植物的次生代谢物质、麻醉剂和氧化剂等等。
3打破胚休眠
3.1低温湿沙层积处理
低温湿沙层积处理对于打破种子休眠有综合性效果，它不但可以使胚完成后熟，还可以破除化学抑制因素，并使种皮透性改善。
对于打破种子休眠而言，这是一种非常简单有效的方法。
3.2光照处理
有些种子经湿沙层积处理后仍不发芽，则可能是需要一定的光照刺激才能萌发。
可采用把种子浸泡在水中并用15～25瓦白色荧光灯或红色灯泡在15～25cm距离处照射24h处理。
4打破综合休眠
综合休眠是几种因素同时作用引起的，因此，要打破综合休眠就要综合使用几种方法同时处理种子，从而打破其休眠。
四、实验仪器与材料
仪器：
研钵、培养皿、镊子、生物显微镜
材料：
赤霉素、滤纸、细沙、甘草种子、秦艽种子
五、实验方法与步骤
1．准备培养皿滤纸和种子。
2．将甘草种子与2倍细沙混合，在研钵中研磨至种皮磨损。
3．用0、20、40、60mg/L的赤霉素浓度浸泡秦艽种子12小时。
放培养皿中发芽，每个培养皿放100粒种子，每个处理3次重复。
4．将研磨和未研磨的甘草种子放培养皿中发芽，每个培养皿放100粒种子，3次重复。
5．统计发芽率。
六、作业
以发芽率为结果，撰写实验报告。
实验二野生药用植物资源调查
一、实验目的
掌握野生植物资源调查的方法。
二、实验内容
调查学院内及周边地带的野生药用植物资源。
三、实验原理
中药资源调查是以植物科学（包括植物分类学、植物资源学、植物生态学和植物地理学等）、动物学、动物生态学、矿物药材学为基本理论指导，通过周密的调查研究，了解某一地区中药资源的种类、用途、贮藏、生态条件、地理分布、利用现状、资源消长变化及更新能力，以及社会生产条件等，挖掘新资源，揭示中药资源利用工作中存在的问题。
中药资源调查是在制定区域中药资源开发利用和保护管理计划的第一手资料。
中药资源评价是在调查研究的基础上，通过对中药资源的现状和利用现状的综合分析，对区域中药资源的开发和利用潜力及现状进行科学的评判，进而为制定区域中药资源的持续开发利用和保护管理计划提供理论依据。
中药资源调查的基本方法包括现场调查、路线调查、访问调查和野外调查取样技术等，概括起来就是点、线、面、访问相结合的综合调查方法。
（一）现场调查
现场调查是中药资源调查工作的主要内容，分为踏查和详查两种方式。
踏查也称概查，是对调查地区或区域进行全面概括了解的过程，目的在于对调查地区中药资源的范围、边界、气候、地形、土壤，以及中药资源种类和分布的一般规律进行全面了解。
踏查应配合分析各种有关地图资料进行。
如植被分布图、土壤分布图、土地利用图和地形图，甚至遥感图象资料等，这样可达到事半功倍的效果。
踏查，从调查全局来讲是认识整个调查地区，选择重点取样区域的过程；从调查局部来讲是认识取样区域，选择具体调查样地的过程。
踏查应由有关专业人员与熟悉当地情况的生产技术人员共同进行，以便更好地了解情况，少走弯路。
可见踏查是贯穿整个调查过程的方法。
详查是在踏查研究的基础上，在具体调查区域和样地上完成中药资源种类和贮量调查的最终步骤，是中药资源调查的主要工作内容。
（二）路线调查
中药资源的调查是遵循一定的调查路线有规律地进行的，并在有代表性的区域内选择调查样地，进行中药资源种类及贮量的详查。
中药资源的分布及其种群数量受区域生态环境的影响，特别是地形的变化，而植被类型是中药资源分布的重要参考依据。
因为不同的植物类型分布有不同的中药资源种类或资源量不同，因此，选择调查路线的基本原则是能够垂直穿插所有的地形和植被类型，不能穿插的特殊地区应给予补查。
决定调查路线必须进行慎重的研究。
因为中药资源种类分布的调查和资源贮量的详查基本上是在调查路线上，通过选择有代表性的样地进行取样获得的。
调查路线对调查区域的覆盖及代表性，直接影响调查结果的客观性和准确性。
踏查、访问和各种参考图件资料，如地形图、植被分布图等，是正确确定调查路线的必要保证。
路线的布局方法分为路线间隔法和区域控制法两种。
1.路线间隔法路线间隔法是中药资源路线调查的基本方法，是在调查区域内按路线选择的原则，布置若干条基本平行的调查路线。
这种方法采用的基本条件是地形和植被变化比较规则、中药资源的分布规律比较明显，穿插部位有道路可行。
调查路线之间的距离，因调查地形和植被的复杂程度、中药资源分布的均匀程度以及调查精度的要求而决定（表2-1）。
表2-1常用不同精度调查路线间距参考数据
调查精度
（比例尺）
中比例尺（万）
大比例尺（万）
超大比例尺（万）
1：
251：
201：
10
1：
51：
2.51：
1
1：
0.51：
0.251：
0.1
路线间距
（km）
7~85~62~3
1~1.50.50.2
0.10.050.02
2.区域控制法当调查地区地形复杂，植被类型多样，中药资源分布不均匀，无法从整个调查区域按一定间距布置调查路线时，可按地形划分区域，分别按选择调查路线的原则，采用路线间隔法，进行路线调查。
在调查路线上，选择具有代表性的地段作为样地，并做一定数量的样方，记录中药资源种类的各种数量要素，主要包括密度、盖度、高度、生物量、利用部位生物量、植被类型、地形条件和土壤条件等，为定性和定量分析调查地区中药资源贮量及其变化规律准备数据资料。
代表性样地的选择既要反映中药资源分布的普遍意义，又要反映其集中分布的特点。
在调查路线上，应按一定的距离，随时记录中药资源种类的分布情况和多度情况，并采集植物标本和需要做实验分析的样品。
路线调查按在地图上布置好的调查路线进行，在野外首先找到路线的位置，对好方位，沿路线前进，借助汽车里程表，记录前进距离，当路线有所修改时，在地图上应及时注明。
（三）、访问调查
访问调查是向调查地区有经验的干部、生产技术人员、采集者和集贸市场及收购部门等，进行口头调查或书面调查。
这是调查工作中不可忽视的重要手段，许多有关中药资源利用现状的资料，是通过访问调查，收集有关部门的资料获得的。
访问调查应贯穿调查工作的始终。
同时，也可以集中一批问题，组织调查会和个别访问，作为一个独立的阶段，安排在路线调查和现场调查时穿插进行。
访问调查应有详细的提纲，事先提供给被调查人，以便有所准备，提高访问调查的质量。
无论采用座谈会或个别访谈的方式，都要认真做好记录，并及时整理出调查专题材料。
对被调查人员的身份、经历、工作单位等也应做好记载，以便今后核实有关内容。
并对一些名称上不明确或不认识的植物采到证据标本。
四、实验仪器与材料
仪器：
卷尺、游标卡尺、放大镜、GPS、标本夹、吸水纸、标本号牌、野外记录本和各种采集刀、铲具、样方调查用表格、野外记录本、铅笔等等。
材料：
校园植物的野生药用植物。
五、实验方法与步骤
（一）准备工作阶段
收集和分析有关资料、准备调查工具、明确调查范围、调查内容和调查方法，制定调查计划的过程。
（二）调查工作阶段
调查工作阶段是通过对中药资源的种类、分布、贮量等实际调查，掌握中药资源自然状况第一手资料的过程。
本实验在校园内部及附近调查野生药用植物的种类及数量。
（三）总结工作阶段
总结工作属于业内工作，主要工作内容是系统整理调查所得到的各种原始资料，采集的各类标本和样品等。
资料应按专题分类装订成册，编出目录。
并进一步分析研究各种调查资料，进行数字统计，绘制成各种成果图件，对调查地区中药资源现状、开发利用中存在的问题，以及开发利用的潜力和保护管理等，做出科学的评价，并提出意见和建议。
六、作业
撰写中药资源调查报告。
实验三野生药用植物种子采集及贮藏
一、实验目的
掌握野生药用植物种子采集方法。
掌握药用植物种子的贮存方法。
二、实验内容
采集并贮藏野生药用植物种子。
三、实验原理
种子必须在适当成熟、具有发芽能力时适时采收，由于野生药用植物种子多具有落粒性，故必须强调适时采收。
种子成熟包括形态成熟和生理成熟。
生理成熟就是种子发育到一定大小，种子内部干物质积累到一定数量，种胚已具有发芽能力。
形态成熟就是种子中营养物质停止了积累，含水量减少，种皮坚硬致密，种仁饱满，具有成熟时的颜色。
一般情况下，种子的成熟过程是经过生理成熟再到形态成熟，但也有些种子形态成熟在先而生理成熟在后。
当果实达到形态成熟时，种胚发育没有完成，种子采收后，经过贮藏和处理，种胚再继续发育成熟。
也有一些种子如泡桐、杨树，它们的形态成熟与生理成熟几乎是一致的。
真正的成熟种子包括生理成熟和形态成熟两个方面。
种子成熟后种子中干物质停止积累，含水量降低，硬度和透明度提高，种皮的颜色由浅变深，呈现出品种的固有色泽。
实际采种时，还要考虑到果皮颜色的变化。
一些果实成熟时其形态特征也不同，浆果、核果类（多汁果）果皮软化，变色。
如南酸枣、杏、木瓜成熟时，果皮由绿色变为黄色，龙葵、土麦冬、女贞、樟树成熟时，果实变为黑色。
干果类（蒴果、荚果、翅果、坚果等）果皮由绿色变为褐色，由软变硬。
其中，蒴果和荚果果皮自然裂开，如浙贝母、四叶参、泡桐、甘草、黄芪等。
球果类果皮一般都是由青绿色变成黄褐色，大多数种类的球果鳞片
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