增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达毕业作品.docx
《增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达毕业作品.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达毕业作品.docx（20页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达毕业作品
毕-设
业-计
（20__届）
增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达
所在学院
专业班级生物技术
学生姓名学号
指导教师职称
完成日期年月
摘要：
绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是在细胞内稳定表达，在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因。
增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）是GFP的一个突变体，发出的荧光强度要比GFP大六倍以上，更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。
本实验旨在构建以EGFP为标记的原核表达载体，观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况，探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性。
根据已知的EGFP序列，设计一对引物FEGFP和REGFP，分别含有NdeI和EcoRI酶切位点，通过PCR从pFGC-EGFP质粒中克隆EGFP编码序列，并将其与pMD19T-Vector连接，以此构建pMD19-EGFP。
将其双酶切后与pET-28a连接，得到重组质粒pET-28a-EGFP。
转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，在诱导的不同时间收集菌体沉淀，并置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。
经IPTG诱导后，细菌培养物在紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。
本实验成功构建了原核表达载体pET-28a-EGFP，为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础。
关键词：
增强型绿色荧光蛋白；重组质粒；大肠杆菌；原核表达
Abstract:
Thegreenfluorescentprotein（GFP）geneisanewreportergenewhichcanbeexpressedinlivingcells,underexcitationoflongUVlightorbluelight,greenfluorescencecanbeemittedwithoutotherexternalsubstrate.Theenhancedgreenfluorescentprotein（EGFP）isamutantofGFP，whichcanemitsixtimehigherfluorescence.Asareportergene,itismoresuitableforstudyinggeneexpressionandregulation,celldifferentiationandproteinlocalizationandtransferinlivingorganisms.ThepurposeofthisstudywastoconstructtheEGFP-labelledprokaryoticexpressionvectoranddetecttheexpressionofEGFPinEscherichiacoli.AccordingtotheopenreadingframeofknownEGFPgene,apairofprimers,whichcontainstworestrictionenzymesitesNdeⅠandEcoRⅠrespectively,wasdesigned.AfragmentofEGFPgenewasobtainedbyPCRamplificationfrompFGC-EGFPplasimd.ThenthePCRproductswerelinkedtopMD19T-VectorsoastoconstructpMD19-EGFP.ItwasdigestedandligatedwithpET-28a,toconstructtherecombinantplasmidpET-28a-EGFP.ThepET-28a-EGFPwastransformedintoE.coilBL21.InducedbyIPTG,thebacterialdepositonwascollectedatdifferenttimeandexcitedbylong-waveultravioletlighttodetecttheexpressionofEGFP.E.coilBL21showedbrightlygreenfluorescentwhenexcitedbylong-waveultravioletlightafterinduction.TheprokaryoticexpressionvectorpET-28a-EGFPwasconstructedsuccessfully.ThisworklaidtheexperimentalfoundationfortheuseofEGFPasareporterandselectivemarker.
Keyword:
EGFP;recombinantplasmid;E.coli;prokaryoticexpression
引言
在水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内存在一类生物发光蛋白——绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）[1]。
它在紫外或蓝色波长范围的光线激发下，依靠钙离子的帮助能够发出绿色荧光，并在活细胞内稳定表达。
GFP的分子量为27kD，由238个氨基酸构成，由11个β片层组成桶状构成疏水中心，第65～67位氨基酸（Ser-Tyr-Gly）形成发光团，是主要发光的位置。
发光的过程中还需要冷光蛋白（Aequorin）的帮助，且这个冷光蛋白与钙离子可产生交互作用，由此产生绿色荧光[2]。
它在395nm处具有最大吸收高峰，在475nm处还有一个肩峰[3]。
作为一种新型的标记分子，GFP具有诸多优点而备受关注：
（1）便于检测：
无需底物和辅助因子提供能源，可被光直接激发；
（2）荧光特性稳定：
对高温（60℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂等大多具有较强抗性，对光漂白有较强的耐受性，（3）对细胞或组织无毒害：
GFP与目的基因融合后对目的基因的表达没有多大的影响，也不会损害宿主细胞；（4）通用性和共用性：
GFP的表达不受宿主范围的限制，也没有细胞种类和部位的限制；（5）分子量小，便于构建载体：
与其他序列一起构建载体之后不至于使载体过大影响转化频率；（6）可进行活细胞定时定位观察：
能够在细胞和生物体内对目标基因的表达产物进行实时示踪，对高等动物或植物进行转基因标记和体内观察；（7）不受假阳性干扰，灵敏度高：
其他生物本身不含有GFP，不会出现假阳性结果，比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率；（8）易于得到突变体：
可通过不同的方法得到GFP的突变体，如荧光强度增加或者颜色改变等；（9）能制成永久标本：
光漂白和福尔马林的固定都不容易破坏GFP的荧光，利用这个特点可以制成标本用于长期保存[4-8]。
正是由于GFP具有上述优点，它在分子生物学和细胞生物学研究中有广阔的应用前景。
不同种的蛋白质N端或C端能与GFP融合，但其天然蛋白的特性又不会受到影响，因此，GFP能用来研究蛋白质在细胞中的定位、转移、相互作用，作为一种“荧光标签”，它可用于研究。
Baulcombe等将马铃薯X病毒和融合蛋白载体PVX-GFP接种菸草（N.clevelandii）1～2d后，在紫外光下可以直接观察到病毒侵染的确切部位[9]。
KÖhler等用拟南芥叶绿体蛋白的recA序列连接GFP，结果表明GFP标记的recA序列存在于叶绿体的基质中[10]。
GFP常常用于构建基因工程的表达载体。
Summers等用GFP作为报告基因构建两种转录型的穿梭报告载体并用于丝状蓝藻的研究[11]。
Gupta等利用GFP构建载体并使其在大肠杆菌重组突变体中的过量表达[12]。
孙丽萍等构建了人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体并转染HEK293T细胞，为进一步深入探索NOD2启动子的始动原因及调控机制奠定基础[13]。
姜伯乐等将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体pLAFR6上，构建报告质粒pLZY，为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌Ⅲ型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料[14]。
何淑雅等将携带人脆性X相关基因1（FragileXrelatedgenel，FXR1）与EGFP的融合并构建表达载体，为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制奠定基础[15]。
张鲲等构建了大肠杆菌双顺反子表达载体，并中研究绿色荧光蛋白的表达水平[16]。
尽管GFP作为报告基因具有许多优点，但天然的GFP仍存在一些缺陷而使其无法更好地应用于科学研究，如发光较弱，耐光性差。
为了解决上述问题，需要对GFP作出一些改进，主要包括以下两个方面：
（1）改变GFP的荧光强度，
（2）改变GFP的颜色。
通过点突变的方法将Ser65→Thr，增强了荧光强度，另外，Phe64→Leu点突变使GFP在哺乳动物细胞37℃的培养条件下能更有效地进行构象折叠。
向GFP引入遗传突变可以获得不同颜色的变种，改变GFP颜色的点突变主要针对其65-67的发光位点及构象上接近发光位点的氨基酸[17-19]。
增强型GFP（enhancedGFP）是其中最具有代表性的一种，它的荧光强度显著提高。
因此更适合作为报告基因来研究基因的表达、信号转导、蛋白运输与定位等。
在蛋白水平检测导入的外源基因是否表达的过程中，我们往往需要通过多次的蛋白纯化和电泳检测的步骤或者通过Western杂交的方法，整个过程耗时长，步骤繁琐，无法迅速得知蛋白是否表达。
本实验可以利用增强型绿色荧光蛋白为标记构建一个可以直观地观察蛋白表达情况的原核表达载体pET-28a-EGFP，试图在大肠杆菌中克隆并高效表达该载体，以利进一步研究其生化特，并进一步探索其作为报告基因的优势，为其在以后的研究奠定基础。
材料与方法
材料
1.1.1菌株与质粒
大肠杆菌DH5α、Top10和BL21菌株均为本实验室保存。
质粒pFGC-EGFP，pET-28a为本实验室保存，质粒pMD19-T购自TaKaRa公司。
1.1.2工具酶及试剂
小量胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒及IPTG均购自上海生物工程公司，限制性内切酶EcoRI、NdeI、SolutionI、DNAmarker均购自TaKaRa公司，其他所用试剂均为国产分析纯。
1.1.3培养基
采用LB培养基，其他试剂及培养基均由本实验室配制。
方法
1.1.4引物设计及合成
根据GenBank中已知的EGFP编码序列，自行设计1对引物FEGFP、REGFP。
上游引物FEGFP：
5＇-CCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3＇，含有NdeI酶切位点，
下游引物REGFP：
5＇-GGAATTCCTAGGATCCCTTGTACAGCT-3＇，含有EcoRI酶切位点。
引物由上海生物工程公司合成。
1.1.5目的基因EGFP编码序列的克隆
以实验室存有的质粒pFGC-EGFP为模板，分别以引物FEGFP、REGFP进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：
10×ExTaqBuffer
2.5μl
dNTPs（2.5mMeach）
2μl
FEGFP
1μl
REGFP
1μl
质粒DNA
1μl
TaKaRaExTaq（5U/μl）
0.5μl
ddH2O
17μl
Total
25μl
反应程序设置如下：
循环次数
温度
时间
1
94℃
3min
34
94℃
1min
55℃
1min
72℃
1min
1
72℃
8min
1
4℃
保存
1.1.6PCR扩增产物的鉴定
称取0.2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50×TAE电泳缓冲液50ml，置于微波炉中加热至琼脂糖完全融化，一般煮沸三次，配制成1%琼脂糖凝胶溶液。
将EB加入锥形瓶中并混匀，之后倒入选定的胶膜中，插入相应的梳子。
过20min后待凝胶完全凝固，小心拔出梳子，将凝胶放入装有50×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳液刚没过胶面（1mm），取5μl待电泳的DNA样品与1μl的6×LoadingBuffer在封口膜上混匀，用移液枪将样品加到梳孔中，以100V电泳20min左右，在紫外灯下观察结果和拍照。
1.1.7目的片段回收
（1）打开水浴锅，将温度设到55-60℃，待温度上升后将ElutionBuffer放在水浴锅里预热。
（2）将空的Eppendorf管置于电子天平上称重，记下重量之后将切下的胶块放入管中再称重量，两者相减，若两者之差小于300mg（针对1%琼脂糖凝胶溶液），再加入300μlBindingBufferⅡ，放入水浴锅10min。
（3）将管内的溶液转移到带有离心柱的收集管内，放置2min，之后10000rpm离心1min，弃去外套管内的废液。
（4）加入500μl的washsolution，10000rpm离心1min，弃去外套管内的废液。
（5）重复上述步骤之后倒掉外套管内的废液后离心10000rpm离心30s，打开盖子，在温室下晾干10min。
（6）将离心柱放入Eppendorf管中，加入40μl的已经预热的ElutionBuffer。
（7）放置2min后，10000rpm离心1min后放置-20℃冰箱中保存。
1.1.8连接
使用pMD19-TVector（TaKaRa，日本）进行连接反应，4℃连接过夜。
反应体系如下：
SolutionⅠ
5μl
回收产物
5μl
pMD19-Tvector
0.5μl
Total
10.5μl
1.1.9大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
（1）取-70℃甘油保存的DH5α菌种20μl，接种于20mlLB液体培养基中，37℃下220-250rpm振荡过夜。
（2）取上述菌液20μl，接种于20mlLB液体培养基中，37℃下220-250rpm振荡2.5-4h，至OD800=0.5-0.6。
取上述菌液1ml于无菌Eppendorf管中，盖上盖，4℃下5000rpm离心5min。
（3）去上清，吸干管底残留的LB培养基，用4℃冰浴预冷的CaCl2（0.1M）溶液400μl重悬菌体，用移液枪混匀。
（4）置于4℃培养箱，冰浴30min。
（5）4℃下4000rpm离心10min，彻底去上清，用200μlCaCl2（0.1M，预冷）重悬菌体，用移液枪轻轻混匀。
（6）置于冰浴2-7h可用于转化。
1.1.10转化
使用自制的大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化。
（1）无菌条件下，取10μl连接产物，加入200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用枪头轻轻混匀（冰上操作）。
（2）4℃冰浴30min。
（3）42℃精确热激90s。
（4）立即转入冰水中冰浴1-2min后，恢复到室温。
（5）加入800μl无抗生物LB培养基，混匀。
（6）将Eppendorf管置于三角瓶中，37℃恒温摇床180rpm振荡培养2h。
（7）室温下5000rpm离心4min，吸去上清900μl，余下100μl液体重悬菌体。
（8）将菌液加入37℃预热的LB固体培养基（40μg/mlCAB），涂布至干。
（9）将培养基倒置于37℃恒温培养箱中，培养12-24h。
1.1.11阳性克隆的筛选与鉴定
（1）无菌条件下，随机挑取4个单菌落分别接种于4个装有1mlLB液体培养基（40μg/mlCAB）的Eppendorf管中。
（2）置于37℃恒温摇床，180rpm振荡培养4h。
（3）进行菌液PCR鉴定，扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
建立PCR反应体系如下：
10×ExTaqBuffer
2.5μl
dNTPs（2.5mMeach）
2μl
FEGFP
1μl
REGFP
1μl
菌液
1μl
TaKaRaExTaq（5U/μl）
0.5μl
ddH2O
17μl
Total
25μl
反应程序如下：
循环次数
温度
时间
1
94℃
3min
34
94℃
1min
55℃
1min
72℃
1min
1
72℃
8min
1
4℃
保存
1.1.12pMD19-EGFP质粒的抽提
（1）打开水浴锅，将ElutionBuffer预热至60℃。
（2）将solutionⅠ放在冰上。
（3）从每管中分别取1ml菌液，12，000rpm离心2min收集菌体，倒尽或吸干培养基。
（4）在菌体沉淀中加入250μlSolutionⅠ，吸打至彻底悬浮菌体。
（5）加入250μlSolutionⅡ，并将Eppendorf管横放在食指上，立即温和颠倒10次至充分混匀。
（6）加入250μlSolutionⅢ，立即温和颠倒混匀10次，方法与（5）一样。
（7）12，000rpm离心10min。
（8）将上清全部小心移入吸附柱，8，000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（9）向吸附柱中加入500μlWashSolution，10，000rpm离心1min。
倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（10）重复步骤8一次。
（11）将空吸附柱和收集管放入离心机，12，000rpm离心2min。
（12）将吸附柱放入干净的1.5mlEppendorf管中，在吸附膜中央加入50μlElutionBuffer，室温静置2min，10，000rpm离心1min，将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存。
1.1.13重组质粒pET-28a-EGFP的构建及鉴定
pMD19-EGFP质粒经NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切反应体系如下：
ddH2O
28μl
10×HBuffer
5μl
NdeⅠ
1μl
EcoRⅠ
1μl
pMD19-EGFP
15μl
Total
50μl
反应条件为37℃水浴6h，将pET-28a质粒经NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切反应体系如下：
ddH2O
23μl
10×HBuffer
5μl
NdeⅠ
1μl
EcoRⅠ
1μl
pET-28a
20μl
Total
50μl
反应条件为37℃水浴6h。
将所有酶切产物置于65°C的水浴锅中30min之后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
紫外灯下切胶回收，在SolutionⅠ作用下，4℃连接过夜，连接体系如下，得到的重组质粒命名为pET-28a-EGFP。
SolutionⅠ
5μl
回收酶切之后的pET-28a（大片段）
1μl
回收酶切之后的pMD19-EGFP（小片段）
4μl
Total
10μl
连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素（40μg/ml）的培养基上挑阳性克隆扩增，鉴定。
扩大培养12h之后用质粒提取试剂盒提取质粒。
再转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，在含有卡那霉素的培养基上挑阳性克隆扩增，经EcoRI、NdeI双酶切鉴定和PCR鉴定，PCR反应体系和反应条件同目的基因EGFP克隆时的扩增条件（重组质粒pET-28a-EGFP的构建见图1）。
图1重组质粒pET-28a-EGFP的构建图
Fig.1 TheconstructionofrecombinantplasmidpET-28a-EGFP
1.1.14转EGFP基因大肠杆菌的获得及原核表达条件的研究
取10μl重组质粒加入大肠杆菌BL21感受态细胞中，将转化菌液涂布含卡那霉素的平板上，37℃培养过夜。
筛选大肠杆菌阳性转化子进行PCR扩增及鉴定。
经1%琼脂糖凝胶电泳检测之后，保存含有EGFP基因的阳性克隆。
将转EGFP基因大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃培养过夜。
过夜培养物接入LB培养液中，37℃振荡培养，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，在诱导0，1，2，3，4，5h后离心收集菌体沉淀，并置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光的表达。
结果与分析
目的基因EGFP编码片段的克隆
以质粒pFGC-EGFP为模板，用引物扩增获得的PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在750bp处有单一的扩增条带（图2），与EGFP编码序列长度相符合，将其命名为EGFP。
图2EGFP编码片段电泳图
1.DL2000Marker2.EGFP基因片段
Fig.2ElectrophoresisanalysisofPCRproductsofEGFPgene
1.DL2000Marker2.FragmentsofEGFPgene
pMD19-EGFP质粒的构建和鉴定
将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶中回收后，与pMD19-T载体以SolutionI4℃连接过夜，转化入大肠杆菌菌株DH5α，在含有羧苄青霉素的培养基上挑取白色菌落通过PCR验证，获得EGFP基因目的条带750bp（图3.1），扩大培养12h之后抽提质粒，通过限制性内切酶NdeI、EcoRI进行双酶切验证，得到750bp的EGFP小片段（图3.2），成功构建pMD19-EGFP质粒。
图3.1PCR鉴定pMD19-EGFP质粒图3.2双酶切鉴定pMD19-EGFP质粒
1.DL2000Marker2,3.EGFP基因片段1.DL2000Marker2.EGFP基因片段
Fig.3.1IdentificationofpMD19-EGFPplasmidbyPCRFig.3.2IdentificationofpMD19-EGFPplasmidby
1.DL2000Marker2,3.FragmentsofEGFPgenerestrictiveenzymedigestion
1.DL2000Marker2.FragmentsofEGFPgene
1.2重组质粒pET-28a-EGFP的构建和鉴定
将pET-28a和pMD19-EGFP质粒同时进行双酶切，分别回收大小片段之后将其连接，构建得到的重组质粒命名pET-28a-EGFP，将其转化至大肠杆菌BL21，经过夜培养后，提取质粒，分别以PCR法和限制性内切酶NdeI、EcoRI进行双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳，发现该片段约750bp，与预期值相符合（图4）。
图4重组质粒pET-28a-EGFP的PCR和双酶切鉴定
1.DL2000Marker2.未酶切重组质粒pET-28a-EGFP
3.EGFP基因片段4.NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组
升级会员 