浅论RNAi沉默PRL1基因对肺癌细胞侵袭能力的影响.docx
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浅论RNAi沉默PRL1基因对肺癌细胞侵袭能力的影响
浅论RNAi沉默PRL1基因对肺癌细胞侵袭能力的影响
【摘要】 目的：
探讨RNA干扰（RNAinterference，RNAi）沉默促肝细胞再生磷酸酶1（phosphataseofregeneratinglivercell1，PRL1）基因对肺癌细胞侵袭力的影响。
方法：
应用PRL1基因小干扰RNA转染处理肺癌A549细胞后，分别采用实时定量RTPCR和蛋白质印迹检测PRL1基因mRNA和蛋白水平，分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。
结果：
与对照组比较，siRNA转染组PRL1mRNA和蛋白水平明显下调，且呈浓度和时间依赖性。
体外试验发现，PRL1siRNA可有效抑制肺癌细胞集落生长和侵袭能力，且与浓度相关。
结论：
PRL1基因在肺癌侵袭中起着重要的作用，采用PRL1siRNA转染可抑制肺癌细胞侵袭。
【关键词】肺肿瘤；促肝细胞再生磷酸酶1；侵袭；RNA干扰；小干扰RNA
［Abstract］Objective:
Tostudytheeffectsandmechanismofphosphataseofregeneratinglivercell1smallinterferingRNAoninvasionofhumanlungcancer：
AfterlungcancercelllineA549weretransfectedbyPRL1siRNA,themRNAandproteinofPRL1weredeterminedbyrealtimeRTPCRandwesternblotassay,anchorageindependentgrowthwasexminedbyclonformationinsoftagar,andinvasionabilitywasevaluatedbyboydenchambermodel.Results：
ThesiRNAcoulddownregulatethelevelofmRNAandproteinofPRL1inadoseandtimedependentmanner.SuppressionofofPRL1expressioncaninhibitinvasionabilityandanchorageindependentgrowthindosedependentmanners.Conclusion：
PRL1genemightplayanimportantroleindevelopmentofhumanlungcancer,anddownregulationbyPRL1siRNAcouldinhibitinvasionofhumanlungcancercell.
［Keywords］lungcarcinoma；phosphataseofregeneratinglivercell1；invasion；RNAinterference；smallinterferingRNA
蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase,PTP）在蛋白磷酸化和去磷酸化平衡中起着重要的作用。
促肝再生磷酸酶（phosphataseofregeneratingliver,PRLs）是PTP酶家族重要成员之一，该基因家族包括PRL1，PRL2，PRL3三个成员,它们分别定位在6q12,1p35,染色体上,彼此之间的同源性高达76%～85%［1，2］。
许多实验研究发现，PRLs分子能导致细胞的恶性转化并且增强肿瘤细胞的增殖、移动、浸润和转移能力［3-10］。
但目前对PRL1基因在肺癌细胞侵袭中的研究甚少。
本研究借助于RNA干扰技术，以合成的PRL1基因小干扰RNA转染处理肺癌A549细胞，观察了PRL1siRNA转染对癌细胞侵袭力的影响。
1材料与方法
材料
人肺癌A549细胞，购自上海生命科学院。
PRL1siRNA序列，由美国Dharmacon公司合成。
PRL1抗体购自SantaCruz公司。
Trizol，RNase抑制剂，逆转录酶SSRTⅡ，Taq酶和转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。
方法
细胞培养及转染处理
肺癌A549细胞在含10％胎牛血清的RBMI1640培养液、37℃、5％CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。
转染前1天，将×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1ml/孔，培养过夜。
次日进行转染。
基本操作按说明书进行。
细胞分组：
空白对照组：
未经任何处理的肺癌细胞；空载对照组：
即脂质体对照组；错配对照组；siRNA组：
10％胎牛血清的RBMI1640中含不同浓度的已用脂质体包埋的siRNA。
转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行以下试验。
肺癌细胞PRL1基因检测
mRNA水平
采用荧光实时定量RTPCR检测。
收集细胞，以Trizol抽提细胞总RNA,取总RNA1μg，以OligodT为引物逆转录合成cDNA第一链，以此cDNA链2μl为模板进行PCR扩增，步骤参照说明书进行。
PRL1定量PCR引物：
上游5′ATGGCTCGAATGAACCGCCCAG3′；下游5′TTATTGAATGCAACAGTTGTTT3′。
以3磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）为内参。
PCR反应条件为：
95℃，预变性3min，95℃，30s；52℃，45s；72℃，45s。
35个循环后，72℃再延伸7min。
蛋白水平
采用蛋白质印迹方法检测。
提取对照组和各实验组细胞总蛋白，蛋白定量后进行常规蛋白质印迹检测。
利用KodakDigitalScience1DImageAnalysisSoftware（图1，图2）。
PLR1siRNA转染对癌细胞软琼脂集落形成的影响
软琼脂集落形成试验结果显示，肺癌A549细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落，而经PRL1siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少（）。
PRL1siRNA转染对肺癌细胞侵袭的影响
Boyden小室上室细胞穿过膜上matrigel到膜的下室面，其数量反映了细胞侵袭能力的大小。
收集转染48h的细胞，采用Boyden小室模型检测癌细胞侵袭情况。
结果发现，与对照组比较，siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降，且与浓度相关（）。
3讨论
RNAi是近年来发现的一种调节mRNA的生物学现象，能使基因的mRNA被相应的双链RNA分子剔除，其效果要远强于正义和反义RNA［13］。
RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。
而siRNA是指RNAi过程中在细胞内产生的长约21～25核苷酸（nt）的小双链RNA分子，是RNAi作用机制的重要中间效应分子。
而且已有人工化学合成的siRNA，具有明显的剔除相应基因mRNA的效果［10,13-16］。
由于siRNA具有高效剔除基因表达的工具，已被广大科学工作者用作研究基因功能和基因治疗的工具。
在PRLs家族中，PRL1是第1个被发现的基因，它是在鼠的3T3成纤维细胞中作为肝再生早期反应的基因被发现的。
研究发现，转染了PRL1的小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞增殖明显增强［3］，提示PRL1基因可促进某些癌细胞增殖。
但PRL1在肺癌细胞中作用尚不清楚。
为了解PRL1基因在肺癌细胞侵袭中的作用，本研究根据PRL1基因mRNA特点，设计siRNA序列，并用化学方法合成siRNA，转染肺癌A549细胞后，分别采用荧光实时定量RTPCR和蛋白质印迹方法检测PRL1基因mRNA和蛋白水平，结果发现，转染组细胞PRL1基因mRNA和蛋白水平明显下降，提示PRL1siRNA转染成功。
接着，我们从体外观察了PRL1基因siRNA转染对肺癌A549细胞侵袭的影响。
正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多需黏附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为锚着依赖性。
肿瘤细胞可以锚着不依赖性状态生长。
肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少与恶性程度呈正相关。
软琼脂集落培养试验结果显示，经PRL1siRNA转染处理的肺癌细胞软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性。
Boyden小室模型或Transwell是检测癌细胞侵袭试验的经典模型，已被广泛应用于探讨癌细胞侵袭的相关研究中。
本研究将经PRL1siRNA转染处理的肺癌549细胞置于Boyden小室模型中，结果显示，转染组肺癌细胞穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性，提示PRL1下调可抑制肺癌细胞的侵袭能力。
本研究提示，PRL1基因在肺癌细胞侵袭中起着重要的作用，以siRNA转染下调可明显抑制肺癌细胞的侵袭能力，其内在机制尚需进一步深入研究。
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