禽流感病毒检测技术研究进展.docx

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禽流感病毒检测技术研究进展

禽流感病毒检测技术研究进展

［关键词］禽流感病毒；检测技术；

　　禽流行性伤风病毒简称禽流感病毒（AIV），属于正粘病毒科、流感病毒属。

流感病毒依照可溶性抗原不同可分为A、B、C３型，只有A型（AIV）易变异［1］，并可在禽、人、猪、马和海洋哺乳动物中暴发流行，显现轻度呼吸疾病到严峻败血症等。

1878年AIV在意大利第一次暴发，其后在英、法、德等欧洲国家和美国均有流行。

高致病性AIVH5N1于1997年在香港致6人死亡，2003～2004年在亚洲致4人死亡，2003年H7N7在荷兰致１人死亡［2］。

AIV给人类健康已带来严峻要挟，引发全世界的极大关注，AIV检测技术也随之成为人们研究的热点。

现就最近几年来AIV检测技术研究进展作一综述。

　　1病原学检测

　　鸡胚分离培育是检测病禽组织中AIV的一种经典、准确、灵敏的病原学诊断方式，能够作为金标准，特异性和灵敏度均能够达到100%［2］。

　　2血清学检测

　　21病毒中和实验（NT）作为经典方式，病毒中和实验操作繁琐、耗时、费料，临床几乎不用。

　　22血凝（HA）和血凝抑制（HI）实验AIV能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验。

血凝和血凝抑制实验能够鉴定病毒、检测血清中的抗体水平。

用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制实验来确信HA亚型。

　　23神经氨酸酶抑制（NI）实验微量神经氨酸酶（NA）抑制剂抑制NA的活性，并以半抑制浓度IC50鉴定NA亚型。

Hurt等［3］用5mg的抗病毒药物zanamivir成立的荧光NI实验，检测阳性样本H1N一、H1N2，符合率别离为N1955%，N2897%，平均935%（187/200）。

该方式本钱低，适于大规模地应用。

　　24琼脂凝胶扩散实验（AGP）用于检测AIV一起抗原核蛋白或基质蛋白。

由于所有的AIV都具有型特异性一起抗原，用一种AIV的抗原或抗血清就可对所有AIV的抗体或抗原进行鉴定。

免疫双向扩散及免疫电泳中以沉淀线判定能够定性，免疫单辐射扩散实验能够定量。

　　25免疫荧光技术（IFT）将抗原或抗体标记上荧光素，再进行抗原抗体反映。

最先用于流感病毒是鉴定和定位病毒感染细胞中特异性的抗原、核蛋白（NP）或基质蛋白（MP）抗原。

用NP抗原的荧光抗体染色，要紧显现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体要紧显现胞质荧光，核内也可显现部份荧光。

　　26酶联免疫吸附实验（ELISA）运用ELISA原理成立的AIV检测方式较多，如用单克隆抗体介导的、经生物素一亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕捉ELISA检测方式，为进一步研究检测试剂盒提供基础［4］。

AIV抗体胶体金检测试纸条那么是胶体金免疫层析分析法，用纯化病毒与胶体金颗粒偶联，吸附在玻璃纤维上制作而成，不需要其他试剂,一步完成,反映时刻只需要几分钟（5～10min），是一种检测微量AIV抗体快速、简便的方式［5］。

郑其升等［6］用基因工程重组HA蛋白作为抗原成立了检测AIV抗体的间接ELISA方式，能够检测H3、H五、H7、H9亚型血清，特异性高，与传统HI方式比较，符合率为971%（774/807）。

基于重组HA蛋白的间接ELISA方式可望用于AIV的爱惜性抗体水平检测。

　　3单链构型多态性（SSCP）

　　作为检测基因变异的手腕已取得普遍应用，其原理是单个核苷酸的置换引发DNA单链构象改变,在非变性电泳中足以致使泳动率转变。

Quinto等［7］用高通量SSCP与限制性片段长度多性（RFLP）分析法对照，检测了近50株流感病毒的400多个基因片段，符合率为98%。

　　4核酸扩增方式

　　41RTPCR基于MP、NP基因的高度保守区的引物，RTPCR能够鉴定AIV［810］。

Lee等［9］在此基础上针对H1～H15又别离设计了15对HA基因的特异性引物，同时进行15管RTPCR，能够检测H1H15的HA亚型，该法所测80株病毒样品，与血清学方式符合率为100%。

但单管单测，操作繁琐。

Phipps等［11］成立了相对简便的RTPCR的AIV检测法，仅用一对引物扩增出H1～H15的HA2基因，产物由双脱氧核酸链中止法测序分析，盲测12株标准病毒和30株样品病毒，并与HI对照，完全相符。

为提高扩增的灵敏度和特异性，也可采纳巢式或半巢式RTPCR［8］。

　　42多重RTPCR（mRTPCR）mRTRCR是在RTPCR基础之上实现单管多检的相对快速和经济的检测方式。

Malik等［12］成立的mRTPCR方式，检测3种不同的鸟类呼吸道病毒，与单管单检RTPCR方式结果完全相符。

Yamada等［13］成立了包括5对引物的mRTPCR体系，可辨别5种亚型AIV。

BellauPujol等［14］运用多重半巢式RTPCR能够检测包括AIV的12种呼吸道RNA病毒，使检测范围进一步扩展，其203个样本与培育方式及直接免疫荧光法对照，综合灵敏度为98%。

　　43RealtimeRTPCR（RRTPCR）运用特异性的荧光水解探针的RRTPCR方式可使检测时刻缩短为4h［10，15］。

Lee等［10］成立的检测H五、H7亚型AIV的RRTPCR方式，与传统的培育方式比较，并以EID50（50%鸡胚致病指数）为评判指标，呈正相关（r=0972），T查验无显著不同（P>021）。

其重复性实验呈正相关（r=0902），灵敏度H5为1fg或10２RNA拷贝，H7为10-1fg或10RNA拷贝，所测病毒浓度均低于1010EID50，该灵敏度高于培育方式。

　　44依托核酸序列的扩增（NASBA）NASBA是一种快速、等温的RNA扩增技术，整个反映有赖于AMV逆转录酶、T7RNA多聚酶和核酸酶H（RNaseH）一起协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，是以转录为基础，单链核苷酸的持续扩增，其反映产物是单链RNA。

扩增产物与磁珠上的捕捉探针及钌标记的电化学发光寡核苷酸探针杂交后，形成复合物，经NucliSens阅读器直接检测电化学发光强度［1617］。

Collins等［16］检测了亚欧地域H5亚型AIV，同时还辨别出高致病及低致病H5亚型。

Lau等［17］成立的NASBA技术能够检测H1～H15亚型的AIV，并能区分出H5及H7亚型，整个进程从核酸分离、扩增、检测在6h之内，灵敏度与鸡胚培育相当。

　　45环介导的等温扩增（loopmediatedisothermalamplification,LAMP）Poon等［18］介绍了一种新的加倍简便的扩增方式，即环介导的等温扩增,特异性地针对6个独立的结合位点设计两对引物扩增，以看家基因或外源性RNA分子作为阳性对照。

由于反映中产生大量焦磷酸镁，能够肉眼判定结果，无需凝胶电泳。

作者用该方式检测了SARS病毒后，又检测了H1～H3的AIV，与常规方式比较符合率为100%。

　　5基因芯片

　　将RTPCR取得的cDNA固化于芯片，利用核酸探针技术构建的检测流感病毒A、B及其亚型的芯片平台，Cy3、Cy5标记的核酸探针与靶DNA杂交，能够进一步辨别混合体系中扩增产物。

Li等［19］用cDNA芯片及mRTPCR对流感病毒进行检测及分型，结果显示cDNA芯片为基于PCR的诊断技术提供了补充，因为基于PCR的方式，直接从DNA扩增片段大小不足以证明是目的产物。

王秀荣等［20］依据M蛋白进行基因型别鉴定和HA基因亚型鉴定，用Cy5荧光标记，在基因芯片平台上构建检测H五、H7、H9亚型禽流感病毒（AIV）的实验技术模型，检测AIV的cDNA，杂交达到预期结果。

Kessler等［21］考虑到三维芯片潜在的优势（因其增加了几何面积，使反映效率提高，同时动态的流质也使杂交时刻缩短），将芯片技术进一步改良，成立了检测流感病毒A、B的三维芯片平台，通过比较实验，选择了特异性强的随机RTPCR扩增方式，和低背景的化学发光检测方式，检测了AIV（H1N一、H1N二、H3N二、H5N1）和流感病毒B，特异性好，全数检测进程不超过5h。

　　6展望

　　病毒分离培育和血凝抑制实验常常作为评判新的检测AIV方式的对照，但病毒分离培育耗时长，至少需7d，无益于快速诊断，病毒分离的实验条件要求较高，同时有高致病性的危险，对毒株的检测及治理上要严格考虑生物平安方法。

AIV在鸡胚培育进程中还可能发生发生变异［22］。

血凝及血凝抑制实验特异性好，但其操作相对繁琐，同时必需具有必然血凝效价的标准病毒和新鲜制备的红细胞。

血清学检查对最后确诊有回忆性诊断价值，一样只能在发病23周乃至更长时刻才能有抗体阳性显现［17］。

由于AIV血清型众多，新的变异株不断显现，制备血清型特异性单克隆抗体相对困难，且在各类免疫接种的情形下，血凝抑制实验等血清学诊断方式也会失去作用。

核酸扩增技术（NAT）检测AIV，选择好靶基因和引物及优化反映参数，都可取得高灵敏度和特异性［23］。

关于血清型众多的AIV，不同亚型致病性不同，宿主散布不同，故快速、特异地分型在AIV诊断中显得尤其重要，而当前的核酸扩增技术尚不能高通量地辨别出所有HA或NA的已知亚型。

RTPCR方式能够取得所有AIV的已知HA亚型，但最终结果尚需借助测序方式［10］，不能作为常规检测手腕。

要实现高通量、大规模的检测，有望借助生物芯片这项技术。

生物芯片正慢慢应用于细菌及病毒的检测，它不仅能克服PCR扩增技术中难题，对PCR扩增技术还能起到补充作用［19］。

目前人们针对病毒，乃至AIV检测芯片不断优化杂交条件；将核酸扩增产物片段化，以减少核酸二、三级结构效应付杂交的阻碍；和对芯片载体结构和检测方式进行改良，都为成立快速、灵敏、特异的AIV检测方式提供平台［21］。

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