11121微生物实验F讲义修.docx
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11121微生物实验F讲义修
《生物学F》
讲稿
任课教师：
余文英、黄碧芳
教学时数：
60学时
实验周数：
6周
微生物实验目录（60学时）
第一周
实验一：
酸乳的制作（3学时）
实验二：
葡萄酒的制作（3学时）
第二周
实验二：
培养基的配制与灭菌（3学时）
实验三：
酵母细胞固定化技术（3学时）
第三周
实验四：
滤膜法测定水中大肠菌群（3学时）
实验五：
噬菌体的分离、纯化及效价测定（3学时）
实验六：
污水的细菌总数的测定（3学时）
第四周
实验七：
四大类微生物菌落的形态比较与识别（2学时）
实验八：
放线菌，霉菌，酵母菌子囊孢子形态的观察（4学时）
第五周
实验九：
微生物菌种保藏（3学时）
实验十：
物理因素对微生物生长的影响（3学时）
实验十一：
化学因素对微生物生长的影响（3学时）
实验十二：
生物因素对微生物生长的影响（3学时）
第六周
实验十三：
大分子物质的水解试验（3学时）
实验十四：
糖发酵试验（3学时）
实验十五：
IMVIC试验（3学时）
实验十六：
比浊法测定微生物生长曲线（3学时）
实验十七：
细菌总DNA的提取（3学时）
实验十八：
DNA的琼脂糖凝胶电泳（3学时）
实验十九：
利用互联网和计算机辅助基因分析鉴定古菌和细菌（3学时）
第一周
酸乳的制作
一、实验目的：
学习制作酸奶及成品质量的评定
二、实验原理：
乳酸是以牛乳为主要原料，接入一定量乳酸菌，以发酵后而制成的一种乳制品饮料。
活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。
三、实验器材：
材料：
鲜牛乳，市售的各种酸乳饮料，蔗糖
器材：
无菌血浆瓶（35个）、无菌移液管（5ML枪头）或小汤勺，恒温水浴锅、冰箱
四、实验步骤：
（1）配复原牛奶（牛乳粉）：
按1:
7的比例把奶粉配成复原牛奶，并加入5-6%的蔗糖。
或用市售鲜牛乳加入5-6%的蔗糖即可。
（2）瓶装：
在250毫升的血浆瓶中加入200毫升。
（3）消毒：
将装有牛乳的血浆瓶置于80℃恒温水浴锅中用巴氏消毒15分钟，置于90℃恒温水浴锅中用巴氏消毒15分钟。
（4）冷却；将已消毒过的牛乳冷却至45℃。
（5）接种：
以5%-10%的接种量将市售的各种酸乳饮料接种入冷却至45℃牛乳，并摇匀。
（6）培养：
把接种后的血浆瓶置于40-42℃温箱中培养3-4小时。
（7）冷藏：
同在多数发酵食品一样，酸乳在形成凝块后应在4-7℃的低温下保持24小时（称后熟阶段），以获得乳酸的特有风味和较好的口感。
（8）品尝：
酸乳质量评定以品尝为标准，通常有凝块状态，表层光洁度，酸度及香味等数项指标，品尝时若有异味就可判定酸乳污染了杂菌。
酸乳的家庭制作
现在牛奶已成了许多家庭餐桌上的必、备品，那么怎样在家自制酸奶呢?
制作方法一：
（1）.配奶：
首先购买一瓶原味酸牛奶作为菌种（125ml）。
一瓶可以接种五瓶鲜奶500ml）。
纯牛奶：
酸奶=4:
1—5:
1
（2）消毒：
牛奶如果是新开封的，本身已消毒得很好，可以不用煮开消毒
（3）冷却：
将消毒后的奶冷却至45°C（以手摸杯壁不烫手为度）
（4）接种：
按5%-10%（V/V）比例加入酸奶
（5）装瓶：
将上述牛奶装入无菌瓶，使液面据瓶口1.5cm
（6）保温：
将装好的牛奶迅速蒙上保鲜膜至于40-42°C保温3-4小时（具体时间视凝乳速度而定）
（7）后熟：
已形成凝胶状的酸奶在4°C下保持12-24小时，使其后熟（即后发酵）
（8）成品：
若无异味，即可食用。
制作方法二：
l、在牛奶中添加6%-10%蔗糖后搅匀。
2、将配好的奶至于85-90°C下消毒15-20分钟（水浴加热）
3、准备好奶锅一个，搅拌的勺或筷子一副，厚瓷或厚玻璃杯若干个。
然后将上述用具蒸煮杀菌。
另外备温度计一支。
4、将鲜奶加热煮沸5分钟。
煮沸时间不能过短。
要吃甜酸奶可在煮沸时加一定量的白糖。
5、经煮沸杀菌的牛奶，用水冷却或自然冷却到42℃左右。
若没有温度计时，可用手摸瓶外不烫手为宜。
6、接菌种。
将购买来的酸牛奶用杀过菌的餐具打碎，倒入已冷却好的牛奶中，充分搅拌。
7、装杯。
将接种好的奶分装在事先准备好的杯中，并加盖。
8、发酵、将装奶的杯置于30℃至35℃的温度下进行发酵。
大约经过4—6小时即可形成凝块，然后便可食用。
另外，如想继续制做酸奶，可用自己前一天做的酸奶为菌种就可以了。
葡萄酒的制作
一、实验原理
随着葡萄产业的迅速扩大，带动了家庭小作坊式葡萄酒的酿造，但由于农民对酿酒工艺不十分熟悉，造成了大量的浪费。
现介绍一套家庭较为实用可行的红葡萄酒酿造工艺。
二、实验器材
1、原料：
红葡萄酒酿造品种的葡萄原料，酒母，白糖。
2、器材：
发酵罐，缸，破碎机，榨汁机、发酵瓶、纱布、台枰
三、操作步骤
充分成熟的红葡萄一除梗、破碎一初发酵一后发酵（添缸、倒缸）一澄清一贮存
（1）．除梗、破碎
用手将葡萄挤破，去除果梗，容器为塑料盆或铝盆，不能用铁制容器。
（2）调整葡萄汁
成熟的红葡萄在不加糖时，酒精度为12度左右。
如想酿制酒精度稍高的酒，可在1升的葡萄汁中添加1度酒精的方法。
具体操作为：
先将白砂糖溶解在少量的果汁中，再倒人全部果汁。
若制高度酒，加糖量要多，但由于酵母不耐高浓度糖液，所以，应分两次加糖。
（3）初发酵
将调整后的果浆放人已消毒的发酵缸中，容积占800／0，以防发酵旺盛时汁液溢出容器。
发酵时，每天用木棍搅拌4次（白天两次，晚上两次），将酒帽（果皮、果柄等浮在表面在缸中央形成的一种盖状物）压下，使各部分发酵均匀。
在26～3O℃的温度下，初发酵经过7-10天就能基本完成。
若温度过低，可能延长到15天左右。
（4）压榨
利用虹吸式法将酒抽人另一缸中，最后用纱布将酒帽中的酒榨出。
（5）后发酵及成酿
经过后发酵将残糖转化为酒精，酒中的酸与酒精发生作用产生清香的酯。
加强了酒的稳定性。
在后发酵及成酿期间要进行倒酒。
一般在酿酒的第一个冬天进行第一次倒酒，翌年春、夏、秋、冬各倒1次。
酿酒后第1年的酒称为新酒，2-3年的酒称为陈酒。
贮藏时间越长，味道越浓，稳定性也越强。
（6）澄清
红葡萄酒除应具有色、香、味品质外，还必须澄清、透明。
自然澄清需要很长时间，人工澄清可采用加胶的方法。
下胶的材料为鸡蛋清，具体加胶的方法为：
每100升酒加2～3个蛋清，加蛋清前，要将蛋清打成沫状，加少量酒搅匀，再加入酒中，充分搅拌均匀，静止8-10天后即可。
（7）葡萄酒的调配
葡萄酒发酵结束后，往往酒精度不够，味也不甜。
根据众人习惯于饮用酒精度稍高且甜的红葡萄酒，可将葡萄酒进行调配。
一般加酒精（医药用酒精或饮料酒精）和白砂糖。
加糖时，先将糖用葡萄酒溶解，根据需要调制成适口的红葡萄酒。
四、实验记录：
日期
气温
颜色
气味
瓶中物高度
状态
酵母细胞固定化技术
一、实验原理
固定化酶和固定化细胞是利用各种不同方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、吸附法和结合法。
一般来说，细胞更适合采用包埋和吸附法固定化。
这是因为细胞个大，而酶分子很小；个小的酶容易从凝胶孔径中漏出。
包埋法固定化细胞即将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞，常用凝胶包埋法。
常用的载体有聚丙烯酰胺、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、光交联树脂等。
二、实验器材
1、菌种干酵母
2、仪器或其他用具电子天平，量筒，250mL、50mL烧杯，250mL三角瓶，培养箱、酒精计等。
三、操作步骤
1．活性干酵母的活化
用电子天平各称取1.0g干酵母，分别放在两个250mL三角瓶中用50mL浓度为2%的蔗糖溶液在30℃恒温活化30min，分别编号1、2备用。
2.海藻酸钠-酵母菌悬液制备
用10mL蒸馏水加热溶解0.7g海藻酸钠，将增殖酵母菌液1与海藻酸钠溶液充分混合均匀，形成海藻酸钠-酵母菌悬液。
3.酵母细胞的固定化
称取无水氯化钙，配制成2%的氯化钙溶液，将海藻酸钠—酵母菌悬液滴入氯化钙溶液中造粒，并恒温（20℃）维持2h，使酵母充分固定化。
倾去上清液，用蒸馏水冲洗固定化酵母3次，然后重新置于2%的氯化钙溶液中平衡24h后，备用。
4.固定化酵母的发酵试验
将固定化好的酵母置于100mL，pH5.0的发酵培养基中，放置于温度调节为30℃的电子恒温培养箱中进行发酵，定时记录发酵液糖度或酒精度的变化。
增殖培养基：
蔗糖5%，蛋白胨0.5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，pH5.0。
发酵培养基：
蔗糖15%，蛋白胨0.5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸氨0.2%，pH5.0。
5固定化效果测定
酒精度的测量：
采用酒精比重计
时间
酒精度
第二周
培养基的制作
配置培养基的基本流程如下：
（详细见教材）
原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌
牛肉膏蛋白胨培养基的制备
一、实验原理
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。
基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。
在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。
琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。
固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏3.0g
蛋白胨10.0g
NaCl5.0g
水1000ml
pH7.4～7.6。
二、实验器材
1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。
2、仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳/皮筋，纱布等。
三、操作步骤
1、称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。
2、溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热，或在磁力搅拌器上加热溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需要的总体积，如果配置固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5%～2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同时进行，节省时间。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。
同时，需不断地搅拌，以防琼脂培糊底烧焦。
配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中。
3、调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。
反之，用1mol/LHCl进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。
pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
配置pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解而不能凝固。
过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。
一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。
4、分装
按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角烧瓶中。
（1）液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
（2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。
分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
5、加塞
6、包扎
加塞后，将全部试管用麻绳/皮筋捆好，再外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿塞，其外再用一道麻绳/皮筋扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。
三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。
（有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。
）
7、灭菌
将上述培养基以0.103Mpa,121℃，20min高压蒸气灭菌。
8、搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
9、无菌检查
将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。
高氏Ⅰ号培养基的制备
一、实验原理
高氏Ⅰ号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。
如果加入适量的抗菌药物（如各种抗生素、酚等），则可用来分离各种放线菌。
此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。
如高氏Ⅰ一号培养基中的磷酸盐和镁盐相互混合时易产生沉淀，因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。
此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如高氏Ⅰ好培养基中的FeSO4·7H2O的量只有0.001%，因此在配制培养基时需预先配成高浓度的FeSO4·7H2O贮备液，然后再按需加入一定的量到培养基中。
高氏Ⅰ号培养基配方如下：
可溶性淀粉20g
NaCl0.5g
KNO31g
K2HPO4·3H2O0.5g
MgSO4·7H2O0.5g
FeSO4·7H2O0.01g
琼脂15～25g
水1000mL
pH7.4～7.6
二、实验器材
1、溶液或试剂可溶性淀粉，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，琼脂，1mol/LnaOH,1mol/LHCl。
2、仪器或其他用具试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，药匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳或橡皮筋，纱布等。
三、操作步骤
1、称量和溶化
按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。
然后再称取其他各成分依次逐一溶化。
对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·7H2O配成0.01g/mL的贮备液即可。
待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
2、pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查与牛肉膏蛋白胨培养基的配制方法相同。
马铃薯培养基的制备
一、实验原理
马铃薯培养基（PDA培养基）是一种用来分离培养真菌的选择性培养基。
PDA培养基：
马铃薯200g，葡萄糖20g,琼脂l5～20g，蒸馏水l000mL，pH自然。
此培养液1000ml加1%的庆大霉素3.0ml。
二、实验器材
1、溶液和试剂葡萄糖，琼脂，庆大霉素（1%水溶液）。
2、仪器或其他用具试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气锅等。
三、操作步骤
1、称量和溶化
按培养基配方，准确称取各成分，并将各成分依次溶化在少于所需要的水中。
将各成分完全溶化后，补足水分到所需体积。
在1000ml培养基中加入1%的庆大霉素3.0ml，混匀后，加入琼脂加热溶化。
2、分装，加塞，包扎，灭菌，无菌检查与牛肉膏蛋白胨培养基的配制方法相同。
酵母细胞固定化技术
四、实验原理
固定化酶和固定化细胞是利用各种不同方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、吸附法和结合法。
一般来说，细胞更适合采用包埋和吸附法固定化。
这是因为细胞个大，而酶分子很小；个小的酶容易从凝胶孔径中漏出。
包埋法固定化细胞即将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞，常用凝胶包埋法。
常用的载体有聚丙烯酰胺、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、光交联树脂等。
五、实验器材
1、菌种干酵母
2、仪器或其他用具电子天平，量筒，250mL、50mL烧杯，250mL三角瓶，培养箱、酒精计等。
六、操作步骤
1．活性干酵母的活化
用电子天平各称取1.0g干酵母，分别放在两个250mL三角瓶中用50mL浓度为2%的蔗糖溶液在30℃恒温活化30min，分别编号1、2备用。
2.海藻酸钠-酵母菌悬液制备
用10mL蒸馏水加热溶解0.7g海藻酸钠，将增殖酵母菌液1与海藻酸钠溶液充分混合均匀，形成海藻酸钠-酵母菌悬液。
3.酵母细胞的固定化
称取无水氯化钙，配制成2%的氯化钙溶液，将海藻酸钠—酵母菌悬液滴入氯化钙溶液中造粒，并恒温（20℃）维持2h，使酵母充分固定化。
倾去上清液，用蒸馏水冲洗固定化酵母3次，然后重新置于2%的氯化钙溶液中平衡24h后，备用。
4.固定化酵母的发酵试验
将固定化好的酵母置于100mL，pH5.0的发酵培养基中，放置于温度调节为30℃的电子恒温培养箱中进行发酵，定时记录发酵液糖度或酒精度的变化。
增殖培养基：
蔗糖5%，蛋白胨0.5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，pH5.0。
发酵培养基：
蔗糖15%，蛋白胨0.5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸氨0.2%，pH5.0。
5固定化效果测定
酒精度的测量：
采用酒精比重计
时间
酒精度
第三周
稀释平板计数法
一、实验原理
微生物得稀释平板记数使根据在固体培养基上所形成得一格菌落，即是由一格单细胞繁殖而成，且肉眼可见得子细胞群体这一生理及培养特征进行得。
也就是说一格菌落即代表一格单细胞。
记数时，首先将待测样品制成均匀的一系列不同的稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个菌），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含量数。
此法所计算的菌数是培养上长出来的菌落数，故又称活菌计数，一般用于某些成品检定（如杀虫剂等）、生物制品检定、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检定。
二、实验器材
1、苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）菌剂。
2、90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平板、1ml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、牛肉膏蛋白胨培养基、无菌玻璃刮铲等。
三、操作步骤
1、样品稀释液的制备准备称取待测液样品10g，放入装有90ml无菌水并放有小玻珠的250ml三角瓶中，用手或置谣床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置约20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液1ml移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2菌液1ml移入装有9ml无菌水试管中，即成10-3稀释液；以此类推，一定要每次更换吸管，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释度菌液，供平板接种用。
（如图）平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。
通常测定细菌菌剂含菌数时，多采用10-7、10-8、10-9稀释度的菌液；测定土壤细菌数时，多采用10-4、10-5、10-6稀释度的菌液；测定放线菌数量时，多采用10-3、10-4、10-5稀度的菌液。
2、平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
（1）混合平板培养法将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用1ml
无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各1ml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各1ml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。
然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50度的细菌培养基（图7），轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷却后倒置，适温培养，至长出菌落后即可计数。
（2）涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复），再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个刮铲，在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。
将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透于培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。
3、结果计算计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中，选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。
（1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。
（2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30-300个菌落为宜，霉菌以每皿10-100个菌落为宜。
选择好技术的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算；混合平板计数法：
（3）每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数
每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数
4、将实验结果填入下表
稀释度
10-7
10-8
10-9
菌落数
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1克样品总菌落数
滤膜法测定水中大肠菌群
一、实验目的
学习使用滤膜法测定水中大肠菌群。
二、实验原理
滤膜法是采用滤膜过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。
所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，其孔径约0.45μm。
三、试剂与器材
无菌水，河水或湖水；
伊红美蓝琼脂培养基：
蛋白胨10g,乳糖10g,K2HPO42g,伊红Y0.4g,美蓝0.065g,琼脂20g,水1000ml,pH7.2
3．器材：
灭菌过滤器（可用高压蒸汽灭菌），镊子，滤膜，烧杯等。
四、实验内容
1．滤膜灭菌
将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤2—3次再煮，以洗去滤膜上残留的
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