实验技能理论材料微生物与生化药学.docx
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实验技能理论材料微生物与生化药学
蛋白质多肽的分离纯化方法
2.1根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
离心常用密度梯度（区带）离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
凝胶过滤在目标蛋白的提取过程中也被用来除去与目标蛋白分子量差异大的杂蛋白小分子的杂质。
2.2根据溶解度不同进行分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。
但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。
常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。
等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。
每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;而在非等电点时很容易溶解。
因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。
有用此法有提取茶叶蛋白质、葵花脱脂粕蛋白质、葡萄籽蛋白质相关报道。
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。
同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、（NH4）2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。
盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。
由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。
为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0.2%~2.0%。
利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐。
有机溶剂提取法的原理是:
与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇）能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。
例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇（-25℃）,可以使抗冻蛋白析出,从而纯化抗冻蛋白。
由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。
因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。
对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。
冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。
冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。
萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。
双水相萃取技术（Aqueoustwophaseextraction,ATPE）是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。
对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。
目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。
采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响。
反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。
反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。
这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。
2.3根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
离子交换层析（Ionexchangechromatography,IEC）是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。
带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。
离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
在外电场的作用下,带电颗粒（如不处于等电点状态的蛋白质分子）将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。
聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。
它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。
等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。
利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。
在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。
2.4利用疏水基团的吸附作用
疏水层析也称疏水作用下层析（hydrophobicinteractionchromatographyHIC）属于吸附层析一类。
蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，且不同蛋白质的疏水性具有差异，在高盐溶液中，蛋白质会与固定相载体上偶联的疏水性配基发生可逆性结合，在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。
可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。
影响疏水作用的因素包括：
盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。
疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
2.5利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力（即生物学亲和力）建立起来的一种有效的纯化方法。
它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。
应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。
近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力。
亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛。
2.6蛋白质的鉴定
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis）聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：
化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
SDS（十二烷基磺酸钠）是阴离子表面活性剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
作用原理：
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（β-巯基乙醇）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
总结
在实际工作中,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。
理想的蛋白质分离提纯方法,要求产品纯度和总回收率越高越好,但实际上两者难以兼顾,因此,考虑分离提纯的条件和方法时,不得不在两者之间作适当的选择;一般情况下,科研上更多地选择前者,工业生产上更多地选择后者。
因此,每当需要提纯某种蛋白质时,首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质,以便选择最佳的分离纯化方法,从而得到理想的效果。
今后,蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究,同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术,两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献。
核酸的分离与纯化
第一节核酸分离与纯化的设计与原则
细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。
DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。
其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。
前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。
除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。
DNA分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。
如人的DNA大约由3.0×109个碱基对（basepair,bp）组成，与5243bp的猿猴病毒（simianvirus40,SV40）相比，其长度约为后者的5.7×105倍。
相对来讲，RNA分子比DNA分子要小得多。
由于RNA的功能是多样性的，RNA的种类、大小和结构都较DNA多样化。
DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。
一、材料与方法的选择
（二）选择的原则
核酸分离与纯化的方法很多，无论采取何种方法，都应遵循总的原则：
一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。
（三）核酸完整性的保持
为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。
影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。
如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危害；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。
其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。
应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏；DNA酶（DNase或DNAase）的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。
RNA酶（RNase或RNAase）的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放
正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。
细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。
机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性DNA分子，因此该类方法不适合于染色体DNA的分离与纯化。
非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。
其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。
（二）核酸的分离与纯化
细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。
在保证核酸分子完整性的前提下，要从中分离出一定量的、符合纯度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上，利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。
这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异、物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。
应该去除的污染物主要包括三个部分：
即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。
非核酸大分子污染物主要包括蛋白质、多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。
（三）核酸质量与提取步骤的关系
一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。
相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。
这需要结合核酸的用途而加以选择。
（四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。
沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。
加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。
其中常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇、异丙醇和聚乙二醇。
核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。
对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：
紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。
由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。
在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50μg/ml的双链DNA，38μg/ml的单链DNA或单链RNA，33μg/ml的单链寡聚核苷酸。
如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。
若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。
紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
（2）荧光光度法：
荧光光度法以核酸的荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。
该法灵敏度可达1ng～5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。
另外，SYBRGold作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
（1）紫外分光光度法：
紫外分光光度法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。
在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0。
比值升高与降低均表示不纯。
其中蛋白质与在核酸提取中加入的酚均使比值下降。
蛋白质的紫外吸收峰在280nm与酚在270nm的高吸收峰可以鉴别主要是蛋白质的污染还是酚的污染。
RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值为1.8的DNA溶液不一定为纯的DNA溶液，可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染，需结合其它方法加以鉴定。
A260/A280的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标，2.0是高质量RNA的标志。
但要注意，由于受RNA二级结构不同的影响，其读数可能会有一些波动，一般在1.8～2.1之间都是可以接受的。
另外，鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响A260/A280的读数。
如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris缓冲液（pH7.5）中的读数低0.2～0.3。
（2）荧光光度法：
用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。
由于DNA分子较RNA大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%～85%，tRNA及核内小分子RNA占15%～20%，mRNA占1%～5%。
故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。
在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA与tRNA组成的相对有些扩散的快迁移条带。
在真核生物为28S、18S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带（图6-1）。
mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不见的。
通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，我们可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定在RNA制品中有无DNA的污染。
3．完整性鉴定常规使用凝胶电泳法。
（1）凝胶电泳法：
以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。
基因组DNA的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在电泳图上可以显著地表现出来。
而完整的无降解或降解很少的总RNA电泳图，除具特征性的三条带外，三条带的荧光强度积分应为一特定的比值。
沉降系数大的核酸条带，分子量大，电泳迁移率低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。
一般28S（或23S）RNA的荧光强度约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。
如果在加样槽附近有着色条带，则说明有DNA的污染。
（2）其它方法：
必要时，还可以通过一些特殊的试验来分析RNA的完整性，如小规模的第一链cDNA合成反应、以放射性标记的寡脱氧胸苷酸oligo（dT）为探针的Northern杂交以及对已知大小的mRNA的Northern杂交。
另外，随着毛细管电泳与生物芯片技术的飞速发展，有关核酸的分离、纯化、鉴定与回收的手段日益丰富。
（二）核酸的保存
核酸的结构与性质相对稳定，无需每次制备新鲜的核酸样品，且一次性制备的核酸样品往往可以满足多次实验研究的需要，因此有必要探讨核酸的贮存环境与条件。
与分离纯化一样，DNA与RNA的保存条件也因性质不同而相异。
1．DNA的保存对于DNA来讲，溶于TE缓冲液在-70℃可以储存数年。
其中TE的pH值为8，可以减少DNA的脱氨反应而pH低于7.0时DNA容易变性；EDTA作为二价金属离子的螯合剂，通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子以抑制DNA酶的活性；低温条件则有利于减少DNA分子的各种反应；双链DNA因结构上的特点而具有很大的惰性，常规4℃亦可保存较长时间；在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。
2．RNA的保存RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸消毒水中，-70℃至-80℃保存。
若以焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白（RNasin）或氧钒核糖核苷复合物（vanadyl-ribonucleosidecomplex，VRC），则可通过抑制RNA酶对RNA的降解而延长保存时间。
另外，RNA沉淀溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可于-20℃长期保存。
其中，甲酰胺溶液能避免RNase对RNA的降解，而且RNA极易溶于甲酰胺溶液，其浓度可高达4mg/ml。
需要注意的是，这些所谓RNA酶抑制剂或有机溶剂的加入，只是一种暂时保存的需要，如果它们对后继的实验研究与应用有影响，则必须予以去除。
由于反复冻融产生的机械剪切力对DNA与RNA核酸样品均有破坏作用，在实际操作中，核酸的小量分装是十分必要的。
（三）核酸的应用
分离纯化的核酸样品，既可用于核酸本身功能与性质的研究，亦可利用其功能与性质进行广泛的应用，如基因工程与蛋白质工程均以核酸分子作为原始材料。
可以说，目前包括聚合酶链反应，核酸的分子杂交与DNA重组与表达技术在内的绝大多数分子生物学技术，都是以核酸分子为处理对象，利用核酸分子的碱基配对原理与核酸的一种或多种酶修饰性进行的。
绝大多数分子生物学技术，实质上是对DNA和RNA的分析。
没有核酸的分离与纯化，分子生物学技术就没有研究与应用的基础。
第二节质粒DNA的提取与纯化
大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒（CCCplasmid）DNA，简称闭环质粒（closedcircularplasmid，CCplasmid）。
作为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体（vector），质粒在基因工程中应用十分广泛。
有关质粒的提取与纯化是必须掌握的基本技术。
一、提取与纯化的方法
质粒DNA的提取与纯化的方法很多，经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。
这些方法主要由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DNA的释放）及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。
按制备量的不同，质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量（1ml～2ml）制备、质粒DNA的中量（20ml～50ml）制备及质粒DNA的大量（500ml）制备。
（一）碱裂解法
碱裂解法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。
在NaOH提供的高pH（12.0～12
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