细胞冻存文档格式.docx

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细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。

细胞冻存操作步骤：

细胞1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。

细胞2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。

细胞3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。

细胞4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）&

times;

106/ml。

细胞5、将悬液分至冻存管中，每管1ml。

细胞6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

细胞7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。

细胞8、按下列顺序降温：

室温&

rarr;

4℃（20分钟〕&

冰箱冷冻室（30分钟）&

超低温冰箱（－80℃过夜）&

液氮。

细胞的复苏

一、细胞复苏的原则

在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。

复苏细胞一般采用快速融化法。

以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

二、细胞复苏的主要操作步骤

（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

（2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。

（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×

109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。

若细胞密度较高，及时传代。

或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。

这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。

然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。

此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用

【关键词】 

小干扰RNA；

反向转染法；

正向转染法；

原代细胞；

悬浮细胞

　　RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指小干扰RNA（smallinterferenceRNA,siRNA）进入细胞后，按照碱基互补配对原则与靶mRNA完全互补配对，进而引发靶mRNA的降解、抑制靶基因的表达。

RNAi因其对靶基因的沉默具有高度的特异性和强大的抑制作用正越来越多地被应用于多种疾病的预防和治疗研究［1］。

siRNA必须进入细胞内才能发挥对基因的沉默作用［2］，因此，如何将外源性siRNA高效地转入靶细胞就成为基因抑制成功与否的关键。

　　基因转染的方法很多,如磷酸钙沉淀法、电穿孔、脂质体法、显微注射法、逆转录病毒法等。

　　逆转录病毒是目前效率最高的转染载体，但由于其价格昂贵，构建耗时而不作为实验的首选。

阳离子脂质体法是较方便的转染方法之一［3］，在各种体外培养细胞的RNA干扰实验中,多以阳离子脂质体进行转染，但其对于原代悬浮细胞仍存在转染效率低的问题，故本实验在脂质体的介导下，运用反向转染法［4］和传统正向转染法转染小鼠脾淋巴细胞，比较两种方法的转染效率，寻找对原代悬浮细胞更高效的基因转染方法。

　　1 

材料与方法

　　1.1 

实验材料 

　　8～10周清洁级BALB/c雌性小鼠（扬州大学比较学院实验动物中心），小鼠淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司），RPMI1640培养基，OptiMEM无血清液体培养基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青公司），LipofectamineRNAiMAX（Invitrogen公司），Cy3荧光标记的siRNA片段（广州锐博生物科技有限公司），24孔板（Corning公司），荧光倒置显微镜（Olympus公司），流式细胞仪（BD公司）。

　　1.2 

研究方法

　　1.2.1 

小鼠脾淋巴细胞收集 

　　断颈处死小鼠，75%乙醇浸泡2～3min,无菌超净台内取出脾脏，将200目无菌不锈钢筛网置于60mm平皿中，加入适量Hank′s液，脾脏剪成碎块置筛网内，无菌玻璃注射器活塞轻柔研磨，使得分散的单细胞透过筛网进入Hank′s中；

Ficoll密度梯度离心法分离淋巴细胞，用PBS将所得细胞沉淀洗涤两遍，重悬于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，计数及台盼蓝染色计算活细胞数。

　　1.2.2 

细胞转染 

　　实验共分为3组。

实验组采用反向转染法，①每孔加Cy3siRNA1.5μl至不含血清的OptiMEM简化培养基200μl中稀释；

②用前摇匀RNAiMAX,取3μl至每孔中，与①液轻柔混匀成为转染复合物，室温孵育20～30min；

③用不含抗生素的RPMI1640完全培养基稀释细胞，每孔细胞悬液为400μl，整细胞数为（1～1.5）×

106，加入②液中，轻微前后推动平板使其混匀，每组设复孔。

对照组按照传统的正向转染法操作，先将细胞在孔板中孵育24h后再加入转染复合物，所加物质用量及浓度与实验组完全相同。

空白组未转染siRNA细胞。

将3组细胞均置于5%CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养，于4～6h后更换含10%小牛血清的完全培养基。

　　1.2.3 

细胞活性测定 

　　转染后24h每组细胞各取1×

106，分别用0.4%的台盼蓝染色5min后,随机各选取3个视野,显微镜下计数所有细胞。

以下列公式计算细胞存活率：

细胞活性=（总细胞数-着色细胞数）/总细胞数×

100%。

实验平行重复3次。

　　1.2.4 

细胞生存状态观察 

　　转染后24h倒置显微镜下（10×

20）每组随机取3个视野观察各组细胞，从细胞形态、细胞膜完整性、细胞数目等方面评估生存状态。

　　1.2.5 

荧光倒置显微镜观察转染效果 

　　转染后24h，荧光倒置显微镜观察各组Cy3siRNA转染细胞的荧光携带率。

Cy3为红色荧光标记物，应用Cy3siRNA转染小鼠淋巴细胞后，根据细胞内红色荧光的数量来判断转染阳性细胞的数量［5］。

于可见光下固定一个视野,计数细胞总数,转换荧光光源计数携带红色荧光的细胞数,转染效率＝有荧光表达的细胞数/细胞总数×

100%,每组选取3孔细胞，每孔细胞随机选择5个观察视野，重复3次。

　　1.2.6 

流式细胞仪检测转染效率 

　　转染后24h实验组和对照组各取1×

106细胞，4℃PBS洗细胞2次。

流式细胞仪计数发红色光的细胞数，计算转染效率。

　　1.2.7 

统计学处理 

采用配对t检验比较两种转染方法转染效率的差异，SPSS13.0软件进行统计分析，P<

0.05表示差异有统计学意义。

　　2 

结果

　　2.1 

　　细胞转染后24h台盼蓝拒染率计算结果显示：

实验组细胞活性为89.5%，对照组和空白组分别为84.5%和94.9%，3组之间细胞活性比较差异无统计学意义（P>

0.05）。

见图1。

　　2.2 

细胞生存状态观察

　　倒置显微镜下观察比较转染后24h实验组、对照组和空白组之间细胞生存状态，结果显示3组无明显差异。

　　2.3 

荧光显微镜下细胞荧光表达率 

　　实验组和对照组细胞内均可见红色荧光，实验组带有红色荧光的细胞数量明显多于对照组，空白组无荧光信号；

实验组与对照组经重复实验得到平均转染率分别为69.58%和39.83%，表明实验组较对照组转染效率高，差异有统计学意义（P<

见图2，表1。

表1 

实验组和对照组的转染效率（略）

　　2.4 

流式细胞术检测转染效率

　　转染后24h，实验组和对照组的Cy3siRNA对小鼠淋巴细胞的转染效率分别为63%和29%，实验组转染效率明显高于对照组（P<

见图3。

　　3 

讨论

　　高效的siRNA转染是研究基因沉默是否成功的前提。

目前，RNAi由于转染效率低而成为其发展的瓶颈并限制其进一步应用［6］。

所以选择最合适的转染方法是整个实验非常重要的一步。

siRNA转染的方法很多，磷酸钙沉淀法虽然操作简便，但转染效率低，重复性差；

电穿孔法适用于所有细胞，电压越高，转染效率越高，而细胞的存活率越低，成功的电穿孔均伴随高水平的细胞毒性,因此其应用受到了限制；

DEAE葡聚糖多用于DNA分子的转染，仅限于瞬时转染，且一般只用于BSC1,CV1,COS细胞系；

显微注射法是用微吸管吸取siRNA溶液,在显微镜下准确的插入细胞核中,将siRNA注射进去，转染率高,对细胞无药物毒害,但是技术要求高，操作繁琐耗时,工作效率低,装置昂贵；

阳离子脂质体在克服细胞屏障方面与病毒相似，容易透过细胞膜，而且操作简便，容易实施，在各种体外培养细胞的RNA干扰实验中得到了广泛的应用，但对于原代细胞、悬浮细胞仍存在转染效率低的情况［7］；

逆转录病毒法适用于各种细胞，转染效率高，但构建病毒载体耗时长且价格昂贵，尤其不适合于有效片段的筛选实验［8］，并且需考虑安全因素。

以上方法均有其优缺点，通过对各种转染方法的综合考虑，本实验选用脂质体为媒介转染小鼠脾淋巴细胞，基于其在采用传统正向转染法时对原代悬浮细胞存在转染效率较低的现象，我们应用反向转染法克服这一困难，把提高转染效率作为实现高效沉默靶基因的基础。

　　转染效率除了由转染方法所决定外，转染细胞状态和siRNA剂量、转染试剂的选择、转染复合物的孵育时间、培养液中血清和抗生素含量等也是影响转染效率的重要因素。

本实验在以上条件参数恒定和规范操作的基础上，提取小鼠脾淋巴细胞，选用脂质体LipofectamineRNAiMAX介导转染小鼠淋巴细胞，RNAiMAX比Lipofectamine2000细胞毒性小，转染悬浮细胞效果更好；

并用荧光素Cy3标记siRNA，使转染情况在镜下直接可见,从而提高实验的准确性。

反向转染法与传统正向转染法的区别［9］是传统方法需在转染前一天接种细胞铺板，培养24h后再加转染复合物转染；

而反向转染则是先加入转染试剂和siRNA混合物在培养板上共同温育数十分钟，然后加入细胞铺板培养，其优点在于：

①节约培养时间，淋巴细胞体外存活时间有限，可为转染后检测提供充足的时间和保持细胞良好的生存状态；

②操作程序简便，避免传统正向转染方法培养条件的频繁变化对细胞表达可能产生的影响；

③转染效率高，对于原代悬浮细胞可实现高效转染，从而使干扰效果比传统方法更好。

1小时即可完成转染，快速、省时并且操作方便。

实验在转染后24h台盼蓝染色检测各组细胞活性、显微镜下观察各组细胞生存状态；

从荧光显微镜及流式细胞仪两方面检测转染效率。

　　在其他实验条件相同的情况下，实验组与对照组的转染效率分别为66.5%和34.5%，说明反向转染得到的RNA转染效果比传统转染方法更好，对于原代细胞、悬浮细胞这一类难以转染的细胞也能得到较为理想的转染效果，值得一试。

同时，转染24h后实验组、对照组及空白组台盼蓝染色细胞活性分别为89.5%，84.5%和94.9%，显微镜下细胞生存状态亦无明显差异，提示该方法细胞毒性较低，操作过程对细胞损伤较小，对于原代悬浮细胞有着很好的应用前景，为siRNA转染原代悬浮细胞及应用RANi技术进行体外研究提供了实验依据。

【参考文献】

　　［1］BiF，LiuN，FanD.SmallinterferingRNA：

anewtoolforgenetherapy［J］.CurrGeneTher,2003,3（5）：

411-417.

　　［2］ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells［J］.Nature,2001,411（6836）：

494-498.

　　［3］EcheverriCJ，PerrimonN.HighthroughputRNAiscreeninginculturedcells：

auser′sguide［J］.NatRevGenet，2006，7（5）：

373-384.

　　［4］LaPanP,ZhangJ,PanJ.etal.Quantitativeoptimizationofreversetransfectionconditionsfor384wellsiRNAlibraryscreening［J］.AssayDrugDevTechnol，2008，6（5）：

683-691.

　　［5］ErfleH,SimpsonJC,BastiaensPI,etal.siRNAcellarraysforhighcontentscreeningmicroscopy［J］.Biotechniques，2004，37（3）：

454-458. 

　　［6］ErfleH,NeumannB,LiebelU,etal.Reversetransfectiononcellarraysforhighcontentscreeningmicroscopy［J］.NatProtoc，2007，2

（2）：

392-399.

　　［7］宋尔卫.RNA干扰的生物学原理与应用［M］.北京：

高等教育出版社,2005. 

　　［8］BrummelkampTR，BernardsR，AgamiR.StablesuppressionoftumorigenicitybyvirusmediatedRNAinterference［J］.CancerCell，2002,2（3）：

243-247. 

　　［9］FujitaS,OtaE,SasakiaC,etal.HighlyefficientreversetransfectionwithsiRNAinmultiplewellsofmicrotiterplates［J］.JBiosciBioeng，2007,104（4）:

329-333.

简介编辑

第一抗体

一抗二抗去除液

第一抗体就是能和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合的蛋白。

种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。

第二抗体

第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。

二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。

用抗AIVH5亚型血凝素单克隆抗体为包被抗体,兔抗AIVIgG为第二抗体。

区别

第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。

第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。

主要用于检测抗体的存在。

一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。

即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。

也就是说，抗原进入机体刺激机体免疫系统产生免疫应答，由B细胞可以产生与相应抗原发生特异性结合的特殊蛋白质。

一抗二抗都是一种可以特异结合别的物质的基团，而且一抗可以至少结合两种其他基团（底物和二抗）。

一抗：

可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。

一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。

二抗：

可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记（如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。

如果一抗自己带有可以被检测出的标记（如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），则不需要二抗。

但这样成本很高，因为一种一抗只识别一种底物。

所以如今的设计一般是二抗带上可检测标记，再来检测一抗。

而一抗识别底物。

这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。

举例编辑

利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就有目的蛋白。

定义编辑

生物素第一抗体标记图

指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

这种反应即可在机体内进行，也可以在机体外进行。

抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化。

HBsAg（表面抗原）

HBsAb（表面抗体）

HBeAg（E抗原）

HBeAb（E抗体）

（核心抗体）

最多见的是“三抗”阳性：

“抗-HBs+、抗-HBe、和抗-HBc+”，这说明乙肝病毒感染结束，体内病毒清除，提示这个人免疫功能十分正常，可以献血，也可以应用他的血制造高效价乙肝免疫球蛋门（HBIG），用于对乙肝的防治。

二抗阳性”即“抗-HBs+和抗-HBe+”或“抗-HBs+和抗-HBc+”

制备方法编辑

原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:

用于检测抗体的间接法（图a）、用于检测抗原的双抗体夹心法（图b）以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

操作步骤

方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法：

1.包被：

用0.05MPH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

（简称洗涤，下同）。

2.加样：

加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3.加酶标抗体：

于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：

于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：

于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：

可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：

反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·

D值：

在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·

D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。

次日洗涤3次。

加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。

同时做空白、阴性及阳性孔对照于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

试剂器材

1.试剂

（1）包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）:

Na?

CO31.59克NaHCO32.93克加蒸馏水至1000ml

（2）洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：

0.15MKH2PO40.2克Na2HPO4·

12H2O2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05%0.5ml加蒸馏水至1000ml

（3）稀释液：

牛血清白蛋白（BSA）0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。

（4）终止液（2MH2SO4）：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。

（5）底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）:

0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml0.1M柠檬酸（19.2克/L）24.3ml加蒸馏水50ml。

（6）TMB（四甲基联苯胺）使用液:

TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml底物缓冲液（PH5.5）10ml0.75%H2O232μl（7）ABTS使用液:

ABTS0.5mg底物缓冲液（PH5.5）1ml3%H2O22μl

（8）抗原、抗体和酶标记抗体。

（9）正常人血清和阳性对照血清。

2.器材:

（1）聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

（2）小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

（3）4℃冰箱，37℃孵育箱。

注意事项

1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。

有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

（1）固相载体的选择：

许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。

其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。

当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。

不管何种载体，在使用前均可进行筛选：

用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗体（或抗原）的选择：

将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要