Novikoff细胞CLC通道电流及半通道电流的电生理学.docx
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Novikoff细胞CLC通道电流及半通道电流的电生理学
Novikoff细胞CLC通道电流
及半通道电流的电生理学特性研究
生命科学学院2000级周鹏
摘要
利用全细胞膜片钳技术对Novikoff细胞上的氯通道电流及间隙连接半通道电流进行了研究，在Novikoff细胞上首次发现以Cl-为载流子的CLC通道电流。
记录到Novikoff细胞间隙连接半通道电流，并与间隙连接通道电流进行了对比。
此外，对于Novikoff细胞上的内向氯电流进行了初步探讨。
Abstract
Usingwhole-cellpatch-clamptechnique,wehavestudiedtheoutwardchlorinecurrentandhemi-channelcurrentofgapjunctioninsingleNovikoffcelltofindCLCchlorinechannelcurrentinNovikoffcellforthefirsttime.Wehavealsoinvestigatedthehemi-channelcurrentandcompareditwithgapjunctioncurrent.Furthermore,westudiedtheinwardchlorinecurrentandhavegotsomepreliminaryresults.
一、研究内容简介
（一）间隙连接
间隙连接（gapjunction）是细胞膜上的一种特殊结构，它为细胞间物质及信息的交换提供了直接通道。
“间隙连接”的概念由Revel[1]在1967年首次提出。
Revel等利用改进的胶质镧技术研究了心脏及肝脏组织中的六角形晶格结构，发现这种细胞间连接呈现出2nm的电子透明“缝隙”，因此将其命名为“间隙连接”。
Krentziger[2]利用冰冻切片技术分析间隙连接的六角形“桥”结构，发现在2nm缝隙的两侧膜内还存在着插入其中的颗粒。
1975年Goodenough[3]将这些颗粒命名为“connexon”，即连接子，又被称为半通道（hemichannel）。
1969年，Payton等人发现荧光染料可以通过间隙通道。
随后人们发现不仅小分子，一些大的疏水分子也可以通过间隙通道。
1981年，Spray[4][5]等人首创双电压钳技术，人们应用这项技术和荧光染料技术发现了间隙连接的电压依赖性，以及H+、Ca2+、ATP、cAMP、cGMP、钙调蛋白及其它物质对间隙连接的调控作用。
而后，间隙连接蛋白家族众多成员的cDNA分子克隆成功，为人们提供了有关这些蛋白质的一级结构。
1.间隙连接的分子结构
间隙连接是由两个相邻细胞膜上的一对六聚体（hexamer）互相对接（docking）而成，并形成细胞间连接细胞质的轴向通道（axialchannel）。
每个六聚体被称为间隙连接半通道（gapjunctionhemichannel）或连接子（connexon），含有六个连接蛋白（connexin，Cx）亚单位，正因为如此，间隙连接最近也被称为连接蛋白半通道（connexinhemichannel）（图1-1）。
图1-1间隙连接的分子结构示意图（摘自文献[6]）
间隙连接功能多样性的基础是间隙连接蛋白分子结构的多样性。
间隙连接蛋白的分子结构有多种不同形式，在人和小鼠的染色体上已确认存在约20种高度同源的连接蛋白，在其它脊椎动物上也有越来越多种类的连接蛋白被发现[7]。
不同间隙连接蛋白的组合构成不同的通道，其电导值及通透性的调节方式均有所不同。
每一种连接蛋白的名称由Cx与两位数字表示，这两位数字表示该连接蛋白分子的分子量（KDa）。
例如Cx43表示此Cx的分子量为43KDa。
Cx分子量范围从26KDa到57KDa，以细胞特异性方式进行表达。
迄今未发现非Cx蛋白作为间隙连接组分的情况。
已发现的所有连接蛋白均由四个跨膜片段、两个细胞外环和一个胞内环组成，其C-末端及N-末端皆在膜的细胞质侧[8]。
其中，跨膜区及两个细胞外环为保守区，在不同的连接蛋白中高度相似。
其余两个区域，即内环和C-末端存在明显的变异。
其中C-末端在各连接蛋白中极不相同，并包含在通道门控及间隙连接组装中起调控作用的磷酸化位点。
2.间隙连接的特性
间隙连接通道直径为1.6-2.0nm（哺乳动物、昆虫的通道直径为2.0-3.0nm），长度为18nm，其中两膜之间缝隙部分为2-3nm。
可通过分子量小于1KD的分子，包括大多数离子、小分子（如TEA、LuciferYellow等）、第二信使、氨基酸等。
不能通过的有蛋白质、细胞器及核酸等大分子。
间隙连接通道的选择性低于其他离子通道，但也存在选择性，不同连接蛋白形成的间隙连接通道的离子选择性不同。
HongZhanWang等[9]利用双电压膜片钳技术，比较了大鼠Cx43间隙连接通道对几种单价离子的选择性。
他们检验了7种阳离子和Cl-的相对通透性，顺序为：
RbCl＞CsCl＞KCl＞NaCl＞＞LiCl＞TMACl＞TEACl，由实验推测Cl-与K-的相对通透性为0.13。
间隙连接单通道电导的大小同样随不同的连接蛋白而有所不同。
Cx43电导大小多为45-64pS，25-30pS及75-160pS也有报道。
3．间隙连接的功能
间隙连接是一种在系统发生学上非常古老的细胞间通讯结构，在很多低等动物如腔肠动物和线虫的细胞间就已经存在。
在高等动物体内，除了极少数种类细胞如血细胞外，间隙连接广泛分布在各种组织中。
间隙连接广泛存在于所有的多细胞动物中，并参与实现各种生物的不同功能，从水螅的成形素（morphogen）的扩散，到视网膜的暗适应，都有间隙连接的参与。
最初认为间隙连接主要的功能是在可兴奋细胞间传导动作电位。
对连接蛋白的基因敲除实验表明，间隙连接具有协调细胞活动的功能，如第二信使通过间隙连接在细胞间传播、间隙连接传导卵母细胞和颗粒细胞间的双向信号以调控卵泡的成熟、通过间隙连接保持晶体渗透压的平衡等。
在人体中，间隙连接蛋白的突变可导致CMTX（Thex-linkedformofCharcot-Marie-Toothdisease）、先天性白内障、非综合症耳聋等多种遗传病[6]。
（二）间隙连接半通道活动的研究及其意义
1.间隙连接生理学特性的研究方法
间隙连接功能特性的研究主要有两种方法，即化学偶联及电偶联。
化学偶联方法是指将中等分子量（300-600Da）的荧光染料注入一个细胞并观察该染料向相邻细胞扩散的情况，并进行定量计算，以此判断间隙连接的功能状态；电偶联法是指用电生理学手段，特别是近年来使用膜片钳制技术直接测量成对细胞间隙连接的电导与电流。
前者的优点是染料只能通过间隙连接进出细胞，缺点在于难以观察通道活动的动态过程；后者的优点是能阐明该动态过程。
以上两种方法也适用于半通道的研究，但在使用膜片钳制技术研究半通道电流时，必须排除细胞膜上其他各种离子流的干扰。
本实验主要采用电学偶联法对半通道进行研究。
2.间隙连接半通道活动的研究意义
半通道在内质网中形成并插入细胞膜，之后与邻近细胞的另一半通道对接在一起，而其它未对接的半通道则留在细胞表面的非连接区。
这些未配对的半通道被认为可能具有与间隙连接通道相似的通透特性，这已被多种研究手段所证实。
研究表明，单个半通道可在生理条件下开放，且对能够影响间隙连接的各种条件变化（如电压、cAMP、cGMP、多巴胺、pH值）具有与间隙连接相类似的敏感性。
为了保持细胞间的通讯，间隙连接在生理条件下的开放是必需的；但对单个细胞来说，半通道的开放在很大程度上是损伤性的，随着胞质中小分子通过半通道流到胞外，细胞的完整性将很快被破坏。
因此，有机体内必然要以某种方式对未配对半通道的开放其加以调控。
胞外Ca2+浓度的升高会促使半通道关闭；胞外低钙会导致半通道的开放，而这一过程可以被间隙连接的阻断剂所阻遏[6]。
综上所述，单个半通道与间隙连接具有一系列的相似性质，这说明未配对的半通道已经具有了间隙连接通道的某些属性。
换言之，尽管间隙连接的正常功能是在一对以上的细胞间进行的，在两个半通道铆和过程中及间隙连接形成后其功能特点可能与半通道有所不同，但在这个铆和过程中半通道的结构和性质并未发生很大的变化。
因此，半通道的功能特性应当是间隙连接的活动基础。
对间隙连接功能的最终解决，还要依赖于对半通道这一基础结构功能的理解。
（三）氯通道
细胞膜上的阴离子通道允许阴离子沿其电学梯度主动扩散。
阴离子通道的离子选择性不强，有些对Br-、I-或NO3-的电导比对Cl-的更大，但仍然将其称为Cl-通道。
原因是Cl-为组织中最丰富的阴离子，在大多数情况下阴离子通道主要通过的是Cl-。
Cl-通道可由以下因素门控：
跨膜电压（电压敏感性氯通道）、细胞肿胀及信号分子结合（如突触后膜的配体门控阴离子通道）、各种离子（如H+或Ca2+）调控、由各种蛋白激酶引起的胞内残基的磷酸化以及ATP的结合及水解。
Cl-通道分布在质膜或细胞器膜上，并执行相应功能。
质膜上的Cl-通道对神经和肌肉的兴奋性起重要调节作用，大量Cl-离子通过Cl-通道的流动还是细胞体积的关键调节因素。
自White和Miller[10]在电鳗（Torpedo）电器官上发现小电导的Cl-通道CLC-0后，多种Cl-通道逐渐被确认，尤其是它们在非可兴奋细胞上的普遍存在。
虽然Cl-通道的研究和克隆比Na+、K+、Ca2+通道都晚，但随着对Cl-通道研究的深入，其重要性受到越来越多的重视。
1．氯通道的多样性：
膜片钳研究发现存在各种电导的阴离子通道，它们的单通道电导、阴离子选择性和调控机制都不相同，这充分说明了Cl-通道的分子多样性。
尽管对Cl-通道的研究直到膜片钳技术建立后才起步，但新发现的Cl-通道种类与日俱增,数量之多很快超过了除K+通道以外的任何通道[11]。
已经发现的Cl-通道跨越了几个通道家族[12]。
目前的研究尚不能对Cl-通道进行系统分类，至今人们了解较多的三个Cl-通道基因家族是CLC家族、CFTR（cysticfibrosistranmembraneconductanceregulator）及胞内Cl-通道家族（ClIC家族）。
在哺乳动物中，CLC基因家族有9个成员。
它们与任何已知的阳离子通道无相似性。
CLC蛋白有10至12个跨膜区域（图1-2），其中多个区域都参与孔道的形成，但无明显的、与Na+、K+、Ca2+相似的S4电压门控区域。
图1-2CLC通道跨膜拓扑结构模型（摘自文献[13]）
CLC通道为同二聚体，两个单体呈反向平行排列，各有一个离子孔道，构成双井模型[14]（图1-3）。
CLC是一个古老的Cl-通道家族，它还存在于原核生物、原生动物及高等植物中。
大多数但并非所有的CLC通道是电压依赖性的，胞外阴离子和pH对其有较强的调控作用。
另外，CLC通道通常对常规阴离子通道阻断剂（如DIDS等）不太敏感。
研究表明，CLC基因突变与四种人类遗传性疾病有关[15]。
图1-3鼠伤寒沙门氏菌CLC（S.typhimuriumCLC，StCLC）二聚体结构（摘自文献[14]）。
a.从细胞外侧角度观察的StCLC二聚体结构三维立体图（原图中，两个单体分别用红色和蓝色表示，并用两个绿色球体各表示一个位于选择性孔道的Cl-离子）。
b.从细胞膜角度侧面观察的StCLC二聚体立体结构，相对于a图沿x轴和y轴旋转90°，图中黑色线（35Å）表示细胞膜的厚度。
CFTR包括12个跨膜区域，一个调制R片段。
它的开放由胞内ATP控制，并通过pKA或pKG磷酸化。
它是ABC载体基因家族中唯一一个具有通道功能的成员。
由于异丙肾上腺素（以下简称ISO）可以使胞内cAMP升高，因此常用作CFTR的激动剂。
CFTR的突变导致囊性纤维变性（CF）[11]。
ClIC家族只有一个跨膜区，这在离子通道蛋白中是很不寻常的。
另一个Cl-通道家族CLCa或CaCl家族编码Ca2+-激活Cl-通道。
另外还有配体门控Cl-通道，如γ-氨基丁酸（GABA）受体门控Cl-通道和氨基乙酸受体门控Cl-通道，以及甘氨酸、乙酰胆碱（Ach）、Ca2+激活的Cl-通道[11]。
2．氯通道的生理功能：
质膜上Cl-通道的生理功能可分为三个方面：
细胞容积的调节和离子动态平衡；上皮细胞中盐溶液的跨膜转运；电兴奋调节。
Cl-通道在胞浆离子成分和细胞容积的调控中具有重要作用。
当细胞暴露于高渗溶液中，细胞的肿胀会导致肿胀激活的阴离子通道开放，释放盐分以阻止水分的进一步流入，从而使细胞容积恢复——容积的调节性下降。
在几乎所有的哺乳动物细胞中都有Cl-通道参与此过程，其它通道如肿胀激活K+通道也有参与。
许多上皮组织盐及水的分泌需要Cl-通道开放，而且常有两个胞内信号的参与，即[Ca2+]i和cAMP的升高。
由于Cl-通道只允许阴离子跨膜的主动扩散，Cl-通道的极性表达和Cl-摄取机制保证了其运输的方向性。
Cl-通道另一个重要功能是调节细胞膜的兴奋性。
最典型的例子是骨骼肌细胞的背景Cl-通道CLC-1。
CLC-1起着稳定肌细胞静息电位的作用，其失控将导致肌强直。
静息电位下，骨骼肌细胞对Cl-的通透性是K+的3～10倍，这与神经细胞大不相同。
在化学突触中存在一种神经递质门控的Cl-通道，它在抑制型神经突触及抑制型神经-肌肉接点中至关重要。
3．阴离子通道阻断剂：
阴离子通道缺少特异性阻断剂。
大多数阴离子阻断剂不但选择性较差，且无法完全阻断Cl-通道。
很多Cl-通道阻断剂都是芳香酸（aromaticacid），其中包括DIDS（4,4'-diisthiocyanostilnene-2,2'-disulfonicacid）、
NPPB（5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）benzoicacid）、
9-AC（anthracene-9-carboxylicacid）、Niflumicacid和Tamoxifen等。
SITS（4-acetamido-4’-isothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonicacid）也是一种常用的阴离子阻断剂。
各类氯通道对各种阻断剂的敏感性不同。
二价、三价离子常被用来阻断Cl-通道，如Zn2+、Cd2+、La3+等。
药理学研究表明，某些Cl-通道可以被胞外低pH阻断。
（四）膜片钳技术
膜片钳技术由Neher和Sakmann在1976年建立，并由于高阻封接等技术的创建而得以应用于很多细胞系的研究。
1．原理
膜片钳技术的原理是使用玻璃微电极接触细胞膜，以1GΩ以上的阻抗使之封接。
此时与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围细胞膜在电学上相互分隔，在此基础上固定电位，并对此膜片上的离子通道电流进行监测记录[16]。
当微电极尖端与膜片之间形成高阻封接时，其间的分流电流达到最小，横跨膜片的电流（I）可100%作为来自膜片电极的记录电流（Ip）而被测量出来（图1-4）。
图1-4膜片钳技术原理示意图，其中Rs称为入路阻抗，Rseal表示封接阻抗。
（摘自文献[16]）
2．膜片微电极的制备
膜片微电极是将玻璃毛细管用拉制仪拉制而成的。
由于微电极不是刺入的，其尖端以不锐利为宜，故应尽可能地使尖颈部短粗一些，这样也可减小Rs值。
通常使用两步拉制的电极来达到上述要求（图1-5）。
图1-5一步（次）拉制与两步（次）拉制的膜片钳电极形状比较
（可见两步拉制的尖颈部较粗，故Rs’>Rs”。
摘自文献[16]）
3．全细胞纪录
形成高阻封接后，在细胞吸附状态下施加负压吸引破坏膜片，或用大电流（<20nA）给与高电压电击以离断膜片可获得常规全细胞模式（Conventionalwhole-cellmode）。
此时即可进行全细胞电流的记录。
在全细胞模式下，外液可随意改变，但交换细胞内液则需要微电极内灌流等特殊的技巧[16]。
（五）Novikoff细胞
Novikoff细胞系是1959年由Swim[17]建立的，取自Novikoff肝细胞瘤的腹水。
Novikoff肝细胞瘤是1957年由Novikoff[18]在鼠的肝脏上通过化学诱发肿瘤得到的，后来又被Plageman及Swim用于培养。
尽管被称为肝细胞瘤，但这种细胞并不是由肝细胞（hepatocyte）产生的，而更可能是由肝星形细胞（Kupfferendothelialcells）或上皮细胞（endothelialcells）产生的。
Novikoff细胞在37℃于封闭的玻璃锥形瓶中悬浮培养，且培养过程中不像贴壁单层细胞培养一样需要提供CO2。
Novikoff细胞约12小时数量翻一番，在此过程中最初呈指数增长，最终达到对数生长。
在生长过程中，细胞形成不同大小的细胞簇，其中10%-20%的细胞簇是由两个大小相同的细胞形成的，因此不需经过蛋白酶处理即可得到较高产量的成对细胞。
Novikoff肝癌细胞适用于研究间隙连接的原因如下：
1、细胞较小（12-13μm），使电极内液与细胞内液之间的成份可迅速交换；
2、细胞膜的阻抗较高（1.1±0.4GΩ），故由串联电阻导致的间隙连接通道总电导（即全细胞电导）Gj计算的误差较小（<10%）；
3、培养过程简单且细胞对产量高；
4、此系统表达了在哺乳动物中普通存在的间隙连接蛋白Cx43，而且仅表达Cx43；
5、细胞膜上的离子通道种类相对简单。
以往的研究发现，Novikoff细胞的静息膜电位约为-40mV，膜电容约为7.35pF，Gj范围在1-200nS，平均值为53.55nS。
自从Rebecca等[19]1987年利用Novikoff细胞对荧光染料通间隙连接的扩散进行定量分析、研究后，Lazrak、Liu、Li等[20-24]先后研究了Novikoff细胞的间隙连接的通透性并证实半通道的存在。
Lazrak等利用双电压膜片钳技术发现，当跨间隙连接电压Vj﹥±50mV时，Novikoff细胞间隙连接通道开放，其电流从峰值衰减至稳态值，且呈时间依赖性和电压依赖性。
Gj为7.382±0.79nS，并至少在±80mV范围内对膜电位不敏感。
Novikoff细胞间隙连接单通道电导为47和97pS。
庚醇、Ca2+和胞外酸化都导致Novikoff细胞间隙连接脱偶联，而且pH的作用是通过胞内Ca2+介导的。
另外发现花生四稀酸（Arachidonicacid，AA）通过钙依赖和钙不依赖两种方式使Novikoff细胞间隙连接脱偶联，而油酸（OleicAcid，OA）和庚醇（Halothane）都以钙不依赖方式使间隙连接脱偶联。
Liu等则利用荧光染料外逸的方法证实了Novikoff细胞上不但存在半通道，而且这些半通道在特定条件下开放而导致染料外逸，如胞外低钙或用ATP处理细胞。
TPA（12-O-tetradeconylphorbol-13-acetate）能抑制染料外逸，而机械刺激是半通道开放的重要因素之一[25]。
Novikoff细胞系表达且仅表达连接蛋白Cx43。
因此，以Novikoff细胞为标本研究间隙连接及其半通道特性对进一步了解Cx43有重要意义。
我们的实验组试图通过对Novikoff细胞半通道的研究，建立一个用来研究Cx43的平台。
在对Novikoff细胞半通道电生理学特性进行研究的同时，必须对细胞上可能存在的其它离子通道进行观察，以排除它们对半通道电流的干扰。
迄今为止，尚无关于Novikoff细胞上各种离子通道的报道，因此揭示电压依赖性的各种离子通道就成为本工作的重要内容，并作为研究Cx43半通道活动的前提条件。
二、材料与方法
（一）材料
细胞：
Novikoff细胞株
各种溶液配方：
1.Novikoff细胞培养液（Swim’77Medium）（500ml）：
PartI：
Swim’77power（Sigma）4.5gF68flakes（Sigma）1.06g
NaHCO31.1gHEPES1.2gPhenolred0.005g
PartII：
D-glucose0.85gSodiumSuccinate·6H2O0.1325g
Succinicacid（ButanedioicAcid）0.0375g
CaCl2·2H2O0.1325gL-cystine·2HCl0.009g
分别将PartI溶解于300ml水中，PartII溶解于100ml水中，再将两部分调和，定容于440ml.。
调pH值至7.2-7.4。
加入50ml新生牛血清（终浓度为10%），加入5ml200mmol/LGlutamine贮液（终浓度为2mmol/L），加入penicillin（10,000unit/ml）和streptomycin（10,000μg/ml）贮液5ml。
经过滤除细菌后，4℃保存。
2.Novikoff细胞消化液：
Novikoff细胞标准外液＋2.5%Tripsin
3.Novikoff细胞标准外液:
NaCl145.0mmol/LKCl2.7mmol/LCaCl21.9mmol/L
MgCl22.0mmol/LGlucose5.5mmol/LHEPES10.0mmol/L
（NaOH调pH值为7.2）
4.TEA外液：
NaCl145.0mmol/LKCl2.7mmol/LCaCl21.9mmol/L
MgCl22.0mmol/LGlucose5.5mmol/LHEPES10.0mmol/L
TEA15mmol/L
（NaOH调pH值为7.2）
5.TEA无Cl-外液：
C2H5O4SNa145.0mmol/LKCl2.7mmol/LCaCl21.9mmol/L
MgCl22.0mmol/LGlucose5.5mmol/LHEPES10.0mmol/L
TEA15.0mmol/L
（NaOH调pH值为7.2）
6.Novikoff细胞标准电极内液：
NaCl6.0mmol/LKCl135.0mmol/LMgCl20.5mmol/L
HEPES10.0mmol/LATP-Na3.0mmol/L
（KOH调pH值为7.2-7.4）
7.CsCl电极内液：
NaCl6.0mmol/LCsCl135.0mmol/LMgCl20.5mmol/L
HEPES10.0mmol/LATP-Na3.0mmol/L
（CsOH调pH值为7.2-7.4）
8.CsCl+EGTA内液：
NaCl6.0mmol/LCsCl135.0mmol/LMgCl20.5mmol/L
HEPES10.0mmol/LATP-Na3.0mmol/LEGTA10.0mmol/L
9.无Cl-电极内液：
NaCl6.0mmol/LKAsp115.0mmol/LMgCl20.5mmol/L
HEPES10.0mmol/LATP-Na3.0mmol/LEGTA10.0mmol/L
CsCl20.0mmol/L
10.
EGTA+KAsp电极内液：
NaCl6.0mmol/LKAsp135.0mmol/LMgCl20.5mmol/L
HEPES10.0mmol/LATP-
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