第二章色谱技术.docx
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第二章色谱技术
第二章色谱技术
第一节色谱学概论
色谱技术是利用混合物中各组分理化性质（分子形状和大小、带电状态、溶解度、吸附能力、分配系数、分子极性以及分子的亲和力等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相），造成流动相对固定相作单向相对运动。
流动相推动样品中各组分经固定相向前迁移，使各组分、迁移速度不同，而对物质进行分离的方法。
这一技术具有分离效率高，应用范围广、分析速度快、样品用量少、易于自动化及能够与其它方法配合使用等优点，已成为近代生物学、生物化学、分子生物学、生物工程等学科中的重要研究手段，并发展成为一门对物质进行分离、分析、纯化与鉴定的综合性技术。
1903年，俄国植物学家Tswett将植物叶子中各种色素的石油醚提取物加到菊根粉或碳酸钙填充在玻璃管内的填充柱上端，然后用石油醚从上向下淋洗，由于移动速度不同，胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和b依次在柱内排列成连续的环状色带。
他称这种混合物分离的方法为色谱法（chromatography），又称色层分析法或色谱法。
此法所用的玻璃管称之为色谱柱（chromatographiccolumn），管内的碳酸钙填料叫固定相（stationaryphase），淋洗液叫流动相（mobilephase）。
这是一种经典的液相色谱分析方法，随后被广泛用于无色物质的分离与色谱。
40年代出现以滤纸为支持物的纸色谱（paperchromatography），50年代出现了薄层色谱（TLC,thin-layerchromatography）。
1952年Martin等人首次以气体为流动相并配合微量酸碱滴定发明了气相色谱（GC，gaschromatography），为挥发性化合物的分离测定带来了划时代的变革。
60年代末在经典液相色谱的基础上发展出高速、高效的高效液相色谱（HPLC，highperformanceliquidchromatography）。
1975年离子色谱的出现和金属鏊合色谱的发展改变了以往色谱法主要用于有机物分析的局面，广泛用于无机离子和金属元素的分离分析。
以后又出现了可以色谱柱口径几微米到几百微米可以检测纳升级或10-14克极样品的毛细管色谱。
气相色谱-质谱（GC/MS）、气相色谱-傅立叶变换红外光谱（GC/FTIR）等联用技术为复杂混合物的分离、鉴定效率大大提高，利用GC/MS可以分析鉴定出汽油中近200个成分。
借助计算机技术的发展，现代色谱技术发展趋向于自动化、智能化。
色谱技术有多种分类方法（表2－1），同一个色谱类型可以有不同的名称。
（1）按照固定相的附着方式，可以分为柱色谱和平板色谱。
前者固定相装在色谱柱内，后者的固定相呈平板状，纸色谱中固定相是滤纸附着的水膜；固定相均匀涂布在塑料（或玻璃、金属）板上称之为薄层色谱；若将固定相软支持物上则又叫薄膜色谱。
（2）按照分离原理，可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱（包括络合和鏊合）。
（3）按照流动相物理状态，可分为液相色谱和气相色谱。
液相色谱根据固定相物理状态不同又包括液-液色谱和液-固色谱，同理气相色谱包括气-液色谱和气-固色谱。
其中若流动相处
表2-1色谱法的一般分类
类型
名称
原理
装置
基质或载体
形状
固定相
流动相
柱
色
谱
吸附色谱
疏水力和静电引力
柱状
固体
液体
硅胶、氧化羟基磷灰石、活性炭等
分配色谱
反向分配色谱
溶解度
柱状
液体
液体
纤维素、硅藻土、硅胶等
离子交换色谱
离子间结合力
柱状
固体
液体
离子交换树脂、纤维素、葡聚糖和人造沸石等
亲和色谱
亲和力
柱状
固体
液体
带配基的葡聚糖和琼脂糖等
凝胶色谱
排阻效应
柱状
液体
液体
交联葡聚糖、交联琼脂糖、生物胶等
聚焦色谱
电荷效应、离子间结合力
柱状
固体
液体
多缓冲离子交换剂PBE
高效液相色谱
随固定相基质变化而变化
柱状
固体
液体
液体
吸附剂、离子交换剂、亲和吸附剂、多缓冲离子交换剂等
气相色谱
与吸附色谱和分配色谱原理相同
柱状
固体
液体
气体
吸附剂活有机溶剂液膜
纸色谱
滤纸分配色谱
溶解度
薄层
液体
液体
滤纸
薄
层
色
谱
吸附色谱
疏水力、静电引力
板状
固体
液体
硅胶、氧化铝等
分配色谱
溶解度
板状
液体
液体
纤维素、硅胶、硅藻土等
离子交换色谱
离子间结合力
板状
固体
液体
各种离子交换剂
凝胶色谱
排阻效应
板状
液体
液体
交联葡聚糖
聚酰胺薄膜色谱
疏水力、静电引力
薄膜
固体
液体
聚酰胺
于临界温度和临界压力下，则称之为超临界流体色谱（LLC，supercriticalfluidchromatography）。
研究较多的是CO2超临界流体色谱，主要用于分析沸点高、热稳定差的物质。
（4）按照两相极性，可分为正向色谱（normalchromatography）和反相色谱（reversephagechromatography）。
前者流动相极性小于固定相，后者流动相极性大于固定相。
（5）按照流动相展开方式，可分为迎头色谱、顶替色谱和冲洗色谱。
迎头色谱（frontalchromatography）是将待分离混合物连续注入色谱柱，而不加入流动相。
这种方法可以获得纯的第一个洗脱组分，后面的组分是混合物。
顶替色谱（displacemengchromatography）是利用一种组分或试剂将另一种组分从固定相中顶替出来。
这种方法分离的各组分谱带紧靠在一起，难以100%回收，主要用于大规模制备分离。
冲洗色谱（elutionchromatography）中各组分可以被流动相完全隔开，是目前采用最多的分离方式。
在实际应用中常常把不同的分类标准混合使用，如吸附薄层色谱。
第二节常用色谱技术分离原理
一、固定相的制备与相关色谱方法
1．薄层制备和薄层色谱
薄层色谱法是将支持物在玻璃板上均匀地铺成薄层，把待分析的混合物加到薄层板上，然后选择合适的溶剂进行展开，而达到分离、鉴定的目的的方法。
薄层色谱兼有柱色谱和纸色谱的优点。
它设备简单，操作容易；展层时间短，只需几分钟到几十分钟，即可完成；温度对分离结果影响不大；灵敏度高，不同的薄层厚度可分析0.01～500mg重量不等的样品；可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。
由于薄层色谱法具备上述优点，并且分离物质的原理依所用不同支持物的性质而不同，可以是吸附色谱、离子交换色谱、分配色谱或凝胶色谱等，所以它在分离鉴定方面的应用也日趋广泛。
薄层的支持介质按性质可以分为无机吸附剂（氧化铝、硅藻土、磷酸钙等）和有机吸附剂（硅胶、纤维素粉、纤维素、葡聚糖、聚酰胺等）（表2－2）。
选择支持介质主要考虑样品组分的溶解性、酸碱性和极性以及介质的亲和能力。
按照薄层制备方法可分为软板和硬板。
软板是将吸附剂直接均匀地铺在玻板上。
制作简单，但易被吹散。
硬板是在吸附剂中加入水或其他有机溶液，调成糊状再铺板，经干燥后才能使用，通常称，制备比较困难，但易于保存，故常用。
尤其用硅胶G（硅胶中含5～15%煅石膏）制备的硬板对大多数的物质分离都是适宜的。
薄层色谱的基本步骤为：
（1）实验材料的准备实验样品一般经过提取制成溶液态。
溶剂最好用挥发性好的有机溶剂，水溶液会降低吸附剂活性从而导致样品斑点扩散。
样品浓度一般为1-5mg/mL。
样品纯度越高，分离效果越好。
表2-2薄层色谱常用基质性质
（2）制板即铺制薄层。
常以玻璃板为吸附薄层的支持物。
可在一根玻棒的两端绕几圈胶布（决定薄层厚度），用玻棒压在一块长方形或方形玻板的一端，把吸附剂沿支持物向另一端匀速推动，或者通过倾斜流动、震动使溶液态吸附剂在玻璃板均匀分布，即成薄层。
吸附剂匀浆或溶解时采用的试剂不同也会影响样品分离效果。
一般薄层厚度为250μm比较合适，若厚度小于200μm将影响Rf值。
制备型薄层可以适当加厚500-700μm甚至1-2mm。
薄层板铺好后阴干，除分配薄层外一般使用前需要活化，如硅胶G薄层需105℃烘烤0.5小时活化、氧化铝G薄层需110℃烘烤0.5小时活化、聚酰胺薄层40-60℃烘烤4小时活化。
涂布棒：
用一根直径1cm左右的玻璃管（或玻棒），两端绕几圈胶布，其胶布的圈数视所制薄板的厚度而定。
也可在玻璃管两端套上0.4mm厚的铜片制成的铜环（见图2-1），以螺丝帽固定距离，因铜片之间距离可调，所以只需一根玻璃管就可制成不同厚度的薄板。
当将调匀的吸附剂倾注在玻璃板上时，用玻璃管压在玻璃板上，把吸附剂向一个方向推动即成薄板。
还可将涂布薄板的玻璃板排成一长条形，两侧放同样厚度的有垫片作支持用的玻璃板，垫片厚度与要涂制的薄板厚度相当。
在倾入调好的吸附剂后，立即用玻璃棒或有机玻璃板，沿着表面均匀地刮推即形成薄层。
此法无需特殊装置，简便易行。
不足之处在于徒手操作，薄层难以均匀。
涂布器：
它分为可移动的涂布器和固定的涂布器两种。
所谓可移动涂布器是涂布槽移动，玻璃板不动。
而固定涂布器则是涂布槽固定，玻璃板以一定的速度移动。
但二者的装置是相同的。
涂布装置如图2-2，它由涂布台和涂布槽二个部分组成。
涂布台可用厚玻璃，薄玻璃及木板粘合制成，用作固定待涂玻璃片的位置。
涂布槽是一边的下缘留有大小适中的缺口，呈方形或长方形无底的槽子，缺口的高度就是涂布薄层的厚度，当拉动涂布槽时，槽内的吸附剂涂料就通过条形缝隙均匀地涂布在玻璃板上（见图2-3，这样涂布的薄板比较容易达到均一的要求。
涂布槽可用有机玻璃粘成，若用铜或不锈钢制作更好。
（3）加样加样量应考虑样品的浓度，样品浓度太低、点样次数太多都会影响分离效果。
图10-2简易涂布器
。
图2-4化学纯甘氨酸的点样量与Rf值的关系
点样是一项比较细致的操作。
适当的点样量，集中的斑点是得到一个好的色谱的必要条件。
通常样品的浓度以mg/mL为单位。
根据不同的要求，不仅采用的显色剂及其灵敏度，吸附剂性能及薄板厚度不同，而且点样量也不同。
若对纯物质的鉴定，采用灵敏度高的显色剂时，点样量只需微克或毫微克；若进行天然物质或中间产物的分离时，点样量就需50微克，甚至几百微克；若进行制备色谱时，点样量可达一毫克以上。
总之，点样量少了，不易检出，点样量多了，易拖尾或扩散，影响分离效果，如图2-4。
点样管可用内径约1mm管口平整的毛细管或微量点样管和自动点样管。
当吸取样品液后，轻轻移至距离薄板一端2.5cm处，点成圆形或条状（双向色谱点样位置可参考有关纸色谱），为使原点直径不超过2—3mm，应该注意到：
①溶解样品的溶剂最好是挥发性的。
②点样宜分次点加，即点一次后‘用吹风机的冷空气吹干，再点、再吹干，反复进行，直至点完所要求的样液量。
③点样量的体积要尽可能小些（2-10µl左右）。
当几个样品点在同一块薄板上时，须在同一起始直线上，它们相互间隔为1.5cm左右，见图2-5。
靠边缘的样点不能距边太近，以免边缘效应产生误差。
点样最好是在密闭的室中或比较干燥的条件下完成，避免薄板吸水降低活性，若无此条件，点样时间要短，点样完毕后，使斑点干燥，再去展层。
图2-5展层示意图
I溶剂前缘II起始线III溶剂浸入的深度（图中数字单位均为cm）
（4）展层薄层的展开需在密闭的器皿中进行，把点样的薄板一端浸入展层剂中，其深度为0.5cm左右，溶剂必须达到饱和，千万勿使样点浸入展层剂中。
展层方式有上行、下行、近水平的上行与下行展层（不含粘合剂的硅胶薄板只能用于水平方向展层）。
根据展层的次数和方向，又可分为一次展开，多次展开，双向展开和连续展开。
展层欲获得满意结果，必须选择适当的展层剂和合理的展层装置。
①展层剂的选择要使物质分离效果好，就需要选择适当的展层系统。
展层剂的选择是根据被分离物质的极性及其和展层剂的亲和力来决定的。
被分离物质和有机溶剂的极性大小是和其分子中功能团的类型、数目及分子中碳链的长短、饱和程度有关。
原昭二等人曾提出在硅胶或氧化铝薄板上功能团由弱到强的次序是：
-CH3、-H、-OCH3、-N02、-N（CH3）2、-COCH3、-OCOCH3、-NH2、-NHCOCH3、-OH、-CONH2、-COOH
溶剂的极性可以用介电常数和偶极矩来衡量。
一般介电常数大或偶极矩大，溶剂的极性也大。
溶剂的介电常数见表2-3。
众所周知，在有机化合物中普遍存在着共价键。
在共价键中，当两个原子结合成共价键时，成价电子云均匀的分布在两原子间，正负电荷中心相迭，偶极矩等于零。
这样的共价键没有极性，叫做非极性共价键。
这种分子称为非极性分子；而当两个不同原子以共价键结合时，由于不同原子对电子吸引力不同，因而共用电子对就或多或少地接近吸引电子能力较强的原子，而使键的两端成为正负两极，这样形成的共价键是有极性的，叫做极性共价键，这种分子称为极性分子。
分子的偶极矩是衡量分子极性大小的物理常数，双原子分子的偶极矩是由二个原子的电负性差而引起的。
两原子的电负性相差愈大，成键时，键矩愈大，整个分子的偶极矩也愈大，这种分子的极性就愈强。
多原子组成分子的偶极矩是分子中各个键矩的向量和，因此由极性键组成的分子不一定是极性分子。
总而言之，在衡量一个有机化合物的极性时，不能单孤立地看其偶极矩，而要从化合物组成的结构全面考虑。
一般极性官能团的存在可以增加分子的极性。
而非极性基团如烷基等的存在，则使分子极性降低。
非极性碳链增长时，则因非极性烷基在整个分子中比例增大，所以极性降低。
当碳链长度相同时，则随着极性基团数目的增加或极性基团极性的增大和不饱和程度的增加而分子极性增大。
了解了如何衡量一个物质的极性大小后，展层剂应怎么选择呢?
图2-6表明了化合物结构、溶剂极性和吸附剂活性三者之间的关系。
当三角形转至虚线方位时，样品角和溶剂角均指向非极性位置，而吸附剂角指向高活度级位置。
这就是说，样品是非极性的，要选择非极性或弱极性的展层剂和活性高的吸附剂。
但究竟如何才合适，可用下面两个方法来摸索。
A．微量圆环法：
欲分析的样品，按常规方法点在薄板上，两点相距2-3cm，再用毛细管吸取所试验的溶剂系统，然后插入样点的中心，溶液自毛细管中流出进行展层，干燥后显色，观察斑点的分离情况。
见图2-7。
B．小型色谱法：
用普通的载玻片（2.5X7.5cm）制备薄板，活化后，把欲分析的样品点至薄板上，在染色缸中展开5cm，干燥后显色，观察斑点分离情况。
此两种方法，操作简便，需溶剂量少，用时间短（几分钟），前者可在同一板上进行多种展层剂的选择，后者则灵敏度较高。
从上面任何一方法中观察到的圆环或斑点如何调整呢?
以小型色谱法为例，调整展层剂应从两个方面考虑：
一是当两个以上的不同成份的物质发生重叠时，可能（a）展层剂的极性过大，被分离物质的迁移率在0.5以上或接近溶剂的前缘，需降低展层剂的极性即可达到分离目的。
（b）被分离物质的迁移率在0.1以下或停留在原点，表明展层剂的极性太小，需加大展层剂的极性，分离可顺利进行。
二是展层剂与吸附剂的酸碱性。
普通分离酸性组份，特别是离解度较大的弱酸性组份，应在展层剂中加人一定比例的酸，可防止拖尾现象。
而分离碱性物质如某些生物碱等，则选用碱性溶剂，多数情况是选用氧化铝为吸附剂，选用中性溶剂为展层剂。
若采用硅胶为吸附剂，则选用碱性溶剂展层为宜。
但对某些碱性较弱的生物碱如喜树硷则可在硅胶上使用中性溶剂进行展层。
例如：
咖啡碱和绿原酸在硅胶薄板上进行分离，当选用氯仿、丙酮（8:
2）层层时，咖啡碱Rf值为0.1，绿原酸仍在原点，因此要加大层层剂的极性，而改用氯仿—丙酮—甲醇—醋酸（7:
2:
1.5:
0.5），此时咖啡碱的Rf值为0.48，绿原酸为0.05，因而达到了分离目的。
但是要确定绿原酸的纯度和性质，上述展层剂仍不符合要求，可改用正丁醇、醋醋酸、水（4：
1:
10，此时绿原酸的Rf值为0.42，咖啡碱为0.68，如图2-8。
从这组Rf值的变化，可间接说明绿原酸较咖啡碱具有更大的水溶性和极性。
展层剂应该使被分离物质的Rf值在0.05—0.85之间，待检定物质的Rf值在0.5左右，所以展层剂要有一定的纯度。
如乙醚、乙醇中含水量不等，而氯仿中含有少量的乙醇，这些都会改变分离能力和影响Rf值的重复。
为此使用时，常以重蒸馏或干燥脱水方法处理，这样混合溶剂的配比就可固定。
普通展层剂只用一次，在作酸或碱性物质的展层时，常在展层剂中加入酸性物质（甲酸、醋酸、磷酸和草酸）或碱性物质（二乙胺、乙二胺、氨水和呲啶）。
②展层装置
根据展层方式，展层装置可分为立式（A）、卧式（E、F）、S型（B）、下行（C）和连续展层装置（d）等，详见图2-9。
展层装置的大小依色谱薄板的大小而定。
小薄板，一定要用小色谱槽，这样易达饱和，溶剂的饱和度对分离效果影响较大，如图2-10。
图2-9各种色谱装置
图2-11中，三个染料（甲基黄、苏丹红和靛酚蓝）分别点在四块一致的硅胶G，薄板上（10X20cm），展层剂为二氯甲烷。
没有盖子的色谱装置。
展层剂（前缘）仅移动1cm；不饱和的色谱装置（即在色谱缸中倒入溶剂后，立即展层）。
60分钟移动10cm；用U型滤纸条（参看图2-9A）预先饱和的装置。
在21X21X9cm色谱缸中贴上一适当的U型滤纸条，滤纸用适当大小的玻璃条压住，倾人展层剂后平衡一段时间；特殊不饱和的S型装置（见图2-10C）（即密闭的装置）仅展层21分钟，与60分钟的效果相同。
事实充分说明：
在饱和的情况下（c和d）要比不饱和的（a和b）展层时间短，分离效果好。
同时看出在不饱和时，边缘效应大。
Stah1认为边缘效应是由于色谱槽中的不饱和状态和展层剂在薄板不同部位分配不同而引起的。
即当混合溶剂在薄板上展层时，极性较弱的溶剂（它被吸附剂吸附得也较弱）和沸点较低的溶剂（己烷—醋酸溶剂系统中的己烷）在边缘挥发得快，也就是说在边缘部分比中心部分含有更多的极性较大的溶剂，从而使边缘的Rf值高于中部的Rf值。
此现象被称为边缘效应（单一的展层剂无此效应）。
用饱和的色谱装置就可消除边缘效应。
③展层操作方法把点好样的薄板浸入0.5cm深的适宜展层剂中，当展层剂移动至离起点约10cm处（约0.5h），将薄板取出放平，用铅笔或小针记下溶剂前沿位置后，在室温或烘箱内干燥，测其Rf值。
展层剂移动的距离和Rf值有一定的关系，因此每次的展层距离要固定，以便Rf值的重复。
（5）样品定位和定量有色物质展层后可以直接显示出有色斑点，无色化合物可以借助物理方法或化学方法定位。
物理方法如激发荧光（如核酸），属非破坏性方法；化学方法如茚三酮显色，属破坏性方法。
非破坏性方法主要用于多次展层和双向展层。
与纸色谱一样，茚三酮显色剂可以喷雾并烘烤使样品显色，也可以将显色剂直接加到展层剂中。
若对样品进行了放射性标记，则可用扫描来定位。
样品的定量主要有洗脱测定和薄层扫描两类方法。
前者是将样品斑点连同吸附剂刮下，用适量溶剂将组分从吸附剂中洗脱出来，然后利用分光光度法或同位素标记法进行定量测定。
后者利用薄层扫描仪直接将薄层上斑点的光吸收转换成电讯号并通过记录仪或检测仪定量显示出来。
2．色谱柱的制备和柱色谱
色谱柱是色谱法的常用装置。
柱色谱是将固定相装于柱内，利用样品组分的差速迁移和各组分的谱带扩散，使样品经洗脱液（流动相）洗脱移动而分离的方法。
色谱柱通常是玻璃的，一般长柱分辨力好，但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。
柱色谱法的一般步骤：
（1）色谱材料的准备材料在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。
例如，凝胶色谱材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来而得到所需的电离形式。
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。
（2）装柱色谱柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。
让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。
用溶剂彻底洗涤色谱柱后使液面降到比色谱床表面略高一点。
最后覆盖一张圆形滤纸，以免加样时扰乱床表面。
（3）加样上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。
将样品用滴管仔细滴加到色谱床的表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
（4）洗脱选用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。
洗脱时，样品上柱量不超过总柱量的10%，溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。
在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。
在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。
另外，还可通过逐渐改变溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是能够减少拖尾现象。
（5）部分收集及分析柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列试管中或使用部分收集器。
这种装置能使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。
洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。
也可将部分收集器与核酸蛋白检测仪联通使用，以对洗脱物中的蛋白质或核酸在280nm或260nm的光吸收进行连续监测。
图2-13柱色谱的装置示意图
1.磁力搅拌器；2.恒流泵；3.层析柱；5.分光光度仪；6.酶反应试剂；7.紫外吸收曲线；
8.酶活性曲线；9.紫外分光光度仪10.部分收集器；11.记录仪
柱色谱的几个基本概念：
（1）色谱图记录仪根据各组分洗脱时间（横坐标）和洗脱体积（纵坐标，以检测器响应的电压或电流值表示）画出的曲线图。
它反映了各组分洗出浓度随时间的变化。
在色谱图上每一个色谱峰就代表一种组分，有些组分的色谱峰可以重叠。
色谱图中没有样品随流动相洗出时，检测器输出电压或电流不变，在色谱图上画出直线，称之为基线。
t
（2）保留时间和保留体积溶质（样品）通过色谱柱所需时间，即从进样到柱后洗出组分浓度最大值的时间叫保留时间。
流动相经过色谱柱的平均时间叫死时间。
实际应用中利用与流动相性质相似、在色谱柱上无保留的溶质经过色谱柱的时间表示。
溶质通过色谱柱的时间包括它在流动相和固定相中消耗的时间，溶质在色谱柱固定相上的滞留时间（从保留时间中去除死时间）叫该组分的调整保留时间。
保留体积为保留时间和流动相体积流速的乘积，其中包含了死体积，即在死时间内非保留溶质流经色谱柱的流动相体积。
（3）孔隙度色谱柱的常用特征参数之一。
一般指总孔隙度，指色谱柱横截面上流动相体积与柱总体积之比。
总孔隙度的大小决定于填料类型和填充密度。
二、色谱技术分离原理
1．吸附色谱
某些物质如氧化铝、硅胶等，具有吸附其他一些物质的性质。
它们对各种被吸附物质吸附力的大小依其分子结构不同而有差异，故可以选择合适的吸附剂，利用这种差异将混合物分离。
用这种方法所进行的各种成分的分离与待分离的物质被吸附剂所吸附的程度及它们在分离用溶剂（洗脱液或展开剂）中的溶解度等因素有关。
待分离物在吸附色谱系统中受到两种力的作用：
一种是吸附剂对它的吸附作用；另一种是溶剂对它的溶解作用（解吸作用）。
这就造成不同分子结构的物质在此色谱系统的两相中具有不同的分配系数。
经过在两相中的多次分配以后，各种物质将依其结构不同而被分离开来。
例如，在柱吸附
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