第九章 基因工程和基因组学Word免费范文精选.docx

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第九章基因工程和基因组学Word免费范文精选

　　第十二基章因程工基因和学

　　组一节

　　第因工程基二节第基因组学

　　第一节基因工程遗工传程基或因程，工是将子分遗学的传论与理程工术相技合结，用来改造、建动物创和物新品植，种业化生工产物生产品诊断，和治人疗遗传类病疾一的个新领域。

本章将重点介绍遗传程的工基原本理方法，和以及一应些实用例。

　　第节一因工基程遗传工程一可分般为:

狭义传工程：

指基遗工因程（重D组N技A）。

术广义遗传程工包：

蛋括质白程、细胞工程、工染体工色、细胞程器程、工基因工及酶程工程。

等

　　、基一因程概述1工基因工.的概程念基因程工：

在分水平上，采子取程建工方式设→按预照设计的蓝先→借助图实于室验技→术某种生物将基的因或基因组转移另到一生中去→使物者后定获向得新传性遗的状一技术。

门基工程因术技的建立，实验生物使学域产生巨大变革。

领

　　因工程基

　　因基工程g（eetniceginneeirgn又称）因拼基接技术DN和A重组技，是术以分子遗学为传论理基础以，子生物学分和微物学生的代方现为法手，段将不来同的源基按因先设计预的图，蓝在体外建构杂DN种分子A然，后入导活胞细以，变生改原有物的遗特传、性获新得品、种生产新产。

品因工基技术为程基的结因构和能的研功提究供了力有的手段。

　　基因工程g（neeitcegineneing）r

　　所基因谓程（工egenticneignerengi）是在子分平水上对因进基操作的行杂复术，是技外将源因基过通外重体组后导入受体细胞内使，个这因能在基体细胞内复受、制转、录译翻达的表作操。

是它人用为的法方所将要的某需一体生供物遗传的物质—D—A大N子提分出取来，在离体条下件适用的当工具酶进切割后，行它与作把为体载D的AN子分接连来起然后，与体一起载入导某一易生长、更殖繁的受体细中胞以让，源物外在质其“安家中落户”,行进正常复制的表和，从而获得新达种物的种崭新一术技。

　　基工程因有个两要重的特第征：

可把一自任何来物生基的转因移与其到毫无关系的任其何他体受细中胞因，可以此现按实照们人的愿，望改造生物的遗传特，创性出生物的造性状新；第：

某一二段NA可D在受细体内进胞行制复，准备大量纯为的DN化片A段供了提可能，宽了分拓生物子的研学究域。

领

　　基因工的程展发

　　196年9世全转界因基植物植面种积为71万0顷公，197年为19100万公顷1,9982年708万顷公，199年3990万公顷92,000442年万公0顷，201年52600万公顷2,002年0500万公顷。

　　.基因2工程发展的

　　2001种植年积面100公万的转基顷作因：

物大（豆330万3hm,占2世全界转基作物因的63,均%为除抗剂草豆大、玉）米9（08万m2h,1占%9、棉花（）86万h02,占m13%）、油菜2207mh万（占，5%）;其它还水稻有小、、花生、麦日葵亚、、甘麻蓝、马铃薯等，茄番、草烟南、瓜和瓜木50等种转基多作物因已培育成功主要。

分布美在（国5703万mh2）阿根、廷1（108万m2h、）拿大（3加20万m2h）中国（1和0万5m2h）国。

等

　　2010全世界转基年因物作相应作物种占总植积的面比

　　.因基工程内容的

　　①细从胞和织中组分离NAD;②限制内性酶酶切切NA分子D,制备DAN片段③;将切D酶N分子A与载D体NA接连→构建在能宿主细内胞自复我制重组的DN分子A;把④重DNA分组子引宿入受体主胞细→复制；⑤重组NA随宿主D胞的分裂而分配细子细胞到建→立性无繁系（clo殖n）或e育发成体个；从细⑥群胞中体选出所要需无性繁殖的→并使外源基因在系受细体中正胞常表达，翻译成白蛋质基因产物、回收等；或选筛出获得定性向变异状个体的

　　。

　　.4因基工的操作程步骤1.取获目的因基实施基是因程的工第步一。

如植的抗物（病抗毒、病细菌抗基因，种）的贮子藏白基蛋因，以人及胰的岛素因，干基扰基因素，都等是目的基。

要从因瀚的“基浩因海”中获得特定的目的洋因，基十分是易的。

不科学家经们不懈地探过索，想了出多许办法，中主其有要两条径途：

⑴从体细胞的供DNA中接直分离基因；人⑵合成工基。

因

　　人工成基合因的方

　　法前人目工成合基因方法的主有要两条。

条一径：

以途目的基转因录成信的使RNA为模，版反录成转互补单链D的NA然后在酶的作，用下成双链DNA,从合获而所得需要基的。

因另条一途径根：

已据的蛋知白的氨质基序列酸，推测出应相信的使RA序N,列然按照碱基互补后对配原的，则推测出它的因的基核酸苷序，再列通化过方学，法以单苷酸核为料原合目的基成因。

人如血的红白基蛋、胰因岛素基因就等以可通人工合过成因基的法获方得。

　　获

　　得目基的的因径目途基的：

因准指导备受入体胞细内，的以究研或用为应目的所要需外源的因基目的基因。

称获目得基因的的法很多，方也但十是分困的难一。

步前获得目目的因基有4条径：

　　途1.

　　.P3CR应反合D成AN合酶链式反聚应（CRP）以是NAD变性、复的某些特性为原理设制的。

计通过CR技术P取获需要所的异DNA特段片实在际应得非用多常，但前提条是件必是对须的基目因一有定的解，需要设计了引。

物PR技术的C理原下：

如

　　聚酶合链反应（PCR式的）骤（3步反）应系中还有高体D温NA

　　聚合，以酶及作原为料材的种四脱核氧三磷苷（酸4dXNTP）。

高DN温A聚合酶自一来特殊的耐高温种菌，俗细称Taq。

酶在7℃0高温，经下Tqa催化酶，四以种脱核苷三磷氧酸原为料，形成在互补引的物寡核苷酸，后迅合成一速与条模D板AN单（链链或负链）正补结合互D的AN新链

　　。

聚合酶链

　　。

.mR4N差异A显示获法目得基的因

　　mRNA差异示（显RmNAdifefenrtaldispilayD,D）1是929由哈佛年学医院PengLiag等n人立的建。

理：

原先P用RC技术扩增所的mR有A、N成生cNA群D,再体用测凝胶电序获泳取所需的要目的基，然因再后次PCR用扩增简单。

讲，就是的基从因的转产录mRNA来反物转录c成DA作N目的为基因。

　　5用、机的方法械如例超波声基把组因打片成。

段

　　基因工的操作程步2.骤基表达因载的体建（构即目基的与运因体结载合是实）施因基工程的第二步也，是因工程基的核心。

将目的基与运因载体结的合过程实，上际不同是源来DNA重的组新合的程过。

如果以质粒为运载作，体先要用一首定的制限切酶质粒割，使粒出现质个一口缺露，黏出性末。

端后用然一同限制酶种切断的目基因，使产其生相同的性末黏端。

将下的目切基因的的段片入质粒插的切处，再口加入适D量A连N酶接，粒的质性末黏与端的基目因DN片A段的黏性端就末因会碱基互补配而结合对，形一成重组DN个A分子。

如人的岛素胰因就基是过通种方法与这大肠杆菌的中质DN粒A子分结，合成重组D形N分子A（叫也组重质粒的。

）

　　因基程的操作步骤工3将.的基目导入因体细受是实施胞因基工的程第步。

三重将组ND分子引A入受体细胞中行扩增。

进基工程因常用中的受体胞细大有肠杆，菌枯杆菌，草土农壤杆菌酵，菌母动植和细物等胞。

用人工方法体使重组的D外NA分转移子受到体胞细，主是借要鉴细或病菌毒侵染胞的细途。

径例，如果如载运是质体，粒体细胞是细菌，受一是般细将菌用化钙处氯，以理增大细细菌壁的胞通透，性含使目有的基因重的质粒组入进受细体胞目的基因。

导入体细胞受，就后以随可受着细胞体的繁而复制，殖由细于菌繁的殖度速非快常，在很的短间时内

　　就能获得大量的目够基因的。

基因工程的操作步

　　骤.目4基的导入受体因胞细，是否后可稳定以维持和表达其传遗性特，有通过检测只鉴与定才能知道。

这基因工程是的第四工步作。

上以步骤成后，在完全的部体细胞受，真中能够正摄重入DN组A分的子受体胞是细很的少。

此，必因须通一过的手定段受体细胞中是否导入了目对的基进因行测。

检测检方的法有很多，例如，大肠种菌杆某种质的具粒有霉青素抗基因性当，种这粒与质源D外N组合A在一起成重形质粒组并，被转受体细胞入后就可，以根受据细胞是否具有体霉青抗性素判断来体细受是否胞获得目了的基因。

重D组N分子进A入体受细胞，后受体胞必细须现表出特定的状，性能才明说目的基因成了表达完过程。

　　、二限性制内切核酶酸1.限制性切酶（r内etrsctioneiznyme:

）种一水D解A的磷N酸二脂，遗传工程中酶要工具重。

细菌胞中细在限制修存系统：

饰制限：

降外源解DNA,限以制阻或病止侵毒。

这染是细菌细防胞御源异遗信息传入进一的手种段。

修饰：

饰外修DNA片段后，源保留在细新胞。

中限*制性切内如酶E:

cRo、HInidIII等酶切式方：

交错以式切断D方A双链，N生二个产同单链粘性相末。

　　端

　　⑴限制内切酶的性命名

　　根据其来自的生物名称用，文英母和字数字表；示①EoRIc来大肠自菌（E杆cserhcihacolii）;②HndiⅢ来自血嗜菌（杆Hemaohpluiisnlfeunaze。

　　）⑵

　　限制内性酶的切别类

　　Ⅰ类酶第：

切割部无特异性，随位机切。

割如cEo（B大杆菌肠B株）E、oKc大肠（杆K菌株）子量分大（约较000300）作用，时AT需PMg++、等辅因子。

助第类酶Ⅱ切：

割位有特部性异，识别一能段特异的DN序列A准，地酶确双切链DN的特A异列。

如序EoRI（c肠大杆）菌H、ndⅢ（嗜i血菌杆，）分子量较小（200约00-01000）,0用作时需Mg+存在。

　　+Ⅱ第类特点酶*切割生平产齐端末（bultnedsn,如S）amI:

*有的产生粘末端性（sticykeds）n,B如amHI、PstI:

*别特识碱基定序，如顺文回对序称（palin列domr,又e反称向重复列序从，个方两阅向其序读相列的同列序）。

　　部

　　分常用的限制内性酶切

　　、载体（ve三cotr运载）具工：

将目的”“基导因入受细胞体的工具。

NA片D段+合的载适D体A→重N组在体载NA的运载下，高DDA→N效地率入宿主进胞，并在细中进行其制复。

DAN载体：

质粒、噬菌体、毒病细菌、或酵菌母工人色染体等

　　。

载

　　的体条件：

具①复有原制，能点我自复；制②具多隆位克（mul点itlpeclnonigsie,tCMS或opyllnkeirreigno,即）有多种限酶的制点切；③选择时的遗传记，标抗如生基素因；④易从主细宿中回收胞。

　　㈠

　　菌细粒质质粒是细菌细内胞立于独菌细染体色自然存而在的、能我自制复易分离、导入的环状和链D双AN子分。

质粒有重具表型组测检标记检，是否携带测源D外A片N。

段在胞细内的制程度：

严紧型：

一个细复菌细内胞质粒数有量-2个；松1驰：

每个细型胞内有02-6个。

0

　　UpC1质8具有粒下特点以:

　　①子分量小，可受接大较源DN外片A段②;贝拷数，多500/细个；胞③克位隆点的酶位点多，克隆方便切；④具用有检于重组测质粒选择的记标（α–互补显色表型）的。

–α补：

互来自细菌D指ANla的c酶ZN的一段端基酸残基（α氨–肽）在与，α–肽缺的失laZ酶c混后合，恢能l复ac酶的Z活的一性基种内互因补象现。

　　㈡λ噬菌体（和型）基温因组全为长9k4b。

噬菌体NDA中间2约/3序的为中列间基簇因，两端D为N左、A右臂。

中间因簇可被外源基DNA代替不影而响其侵染菌的能力细。

能接1受~53k2的外源DNAb片段→为cD作A或核DNNA克的隆体载。

　　㈣

　　穿梭体载（hsutltveecorst指）能在种不两生同中物复制载体的如既。

能原在生核物（E.如clo）中i复，制能又在真细核（胞酵母）中如制复载体。

穿梭载的具体细菌质有的粒制原复点真核生、的物自复制序列主A（uot-nmouosyleplicraitnsgqueenecA,RS）以两者及的选择记性状，标有多克具位隆点。

　　穿

　　载梭穿体梭体在细菌中载用克于隆、增扩克隆基因在酵母，中用于因基达表析分。

酵母菌Y的Epy（esateispompalasmi）系列载体d以及IY、YCppY和p系R载体列均是穿梭体载。

　　工染色人体（batcrialeatrficiaichlrmooomesBAC）,

　　ABC载体一可般携带大50于bk外的源ND片段。

A因F改子造成AB载体，甚至C可用克隆10于kb0上以的DA片N。

段特：

带点外源有NA的DAC载B在体胞细是单中贝拷的；体载分子很量（小74k.b）;选择标记：

氯霉素抗基性；因克隆位多点。

　　㈥

　　母人工酵染体色ye（satartfiicialchomosro

　　me,AY）C

　　YAC有具自复制主列序、隆位点和可克在细和酵母菌菌选择中的标基记；因还有具母菌酵染体色一些特点可接；受100-001k0的外源bDN片A段。

YAC成已为人类基因组计划图和克位基因的重隆要工；并具进促人类了工染人色（体huanmarifticilachrmooomes,AC）H的究。

研991年完成6酵了菌全基母因组序列测的定（图下）

　　YACp4点特:

　　1.两可在酵母菌个利用的选中择基，URA3因和TP1（色R氨合成基酸因；）2酵母.菌丝粒着列序（ENC）;3.一个自4主制序列复AR

（1）S;4两个嗜热四.虫膜端重末序复（列TLE→保）重持Y组C为A线状构结；5.在两个末序端中间，列一段有填充列序Hi（s3）,使pACY4在菌细胞中细稳定能增扩6;Am.p抗及细性质粒复制菌点原7.一个E;ocIR隆克位，位于酵母点菌uSptRNA4因基。

　　内母人酵染色工体在克隆源外DN时，用ABamI和EcoHI双R酶，得到切二人工染色体个，与Ec臂oIR切酶外源的ND片A段连接，成构重的酵母人工染组体色，于转化酵用母菌。

　　*iT质粒特点：

　　1.具有个主要功五区域能：

①TDNA-LB与：

R间B-TNDA序列整合植物基因到组；质②转移区（P粒）;T③瘿碱（冠pino）e代区谢；④复制点原；毒⑤区性。

　　质粒的i两套体载统系：

*i质粒是2T0~5000kb环状的DAN子，分要主有两套体系统载：

双⑴元载（体inbrayecvotrs）:

具有两个粒质①用于隆外克源基片因段克的隆粒：

质在Ecol.和i农杆菌复制，容中易操作，可在二者间转移并，一种是穿梭质；粒②非病质致：

具粒毒有基性，没有T因D-AN序列。

两个将粒分质别入农杆导中菌经农杆，介菌，导克质粒中的隆外源NA转移到D植物染体中色。

　　、四因的基分离与定鉴一而般，言个基一→因是编一码多条链的肽个一DAN段，片括启动包子、终止及内含子子。

等的基目因：

指备准入导受体细胞内，的研究或应用以为目的需要的所外基因称目的源因。

基

　　何如获目的基得?

因㈠从基库中因分离基因㈡PCR扩基增因㈢工人合基成因

　　㈠

　　从基因中库分离因从基基因中分库离基，首因要构先建因基。

库1.基因（库gneelbiarry）基因：

库组DN一和cDNA序列A隆克集的体合。

根克隆据的核酸序、列来，源把因库基为：

分基核因库染、体色、库cDA库N、粒线库等体

　　②色染基体因库

　　人基因组类项研究目，利中流用细动胞分（fl拣owyctomery）技t将人类染色术分开→构体单个染色建体因基→库加人速基因类作图组分和。

析酵菌母：

利改良用脉的冲电泳法（puls方defeldigeleletcro-porhessi,PFGE）,将酵菌母61根染色体据依分子量其小分开后大，于用建染构体库色，在基组因分析中的发挥作。

用

　　流动细胞拣分（fowlyctmetor）y技

　　③

　　DcN库A

　　以mRNA为模板→经反录酶合转成互DN补（cDANA→）建构基因库。

大多数真核绝物mRN生A的3端′有具一段聚A多端尾序列利用一→多段聚T引物为，与多聚A互补配→双对D链A分子经N端补齐两以带→限制性酶切的人工点接头接→连酶切与后体（载常通是噬体菌）连接→制备cDA库。

N

　　cDN

　　库与A核DNA不库同:

　　cDAN仅具有库胞细或织内组达基因的表mNR序A列→仅括包因组基的分部因基

　　序列（显外子分部。

）DNcA库对于究研因的表基模式达分离和一某特定基是非常因有的用如要分。

在某一离胞细组或内高织表达的效某种因，基可该用胞或细织的组mRA构N建DcAN,则库容易很到得个这基。

因例如动，的红物细中胞有具大血红蛋白，量用红胞细的RNmA建cD构AN库，中从选球蛋择白基就因方很便。

　　.2筛基因选库

　　根据选基因相关待信息确→定筛选法方和件条→从因库中基选筛、离分因基多。

方法数利用一段核苷酸是列序（DN、ADcN或A寡聚苷酸核）抗体或探针（作robP）,用e射性同位素放或非射性放同位标素探针记→筛基因库。

筛选过程库：

将噬菌体感形染的噬成斑印影在菌硝酸纤维膜上性变与带有目→的基因的射性放DAN或cNA探针进行D杂→交放性射自显→影杂信号交（黑点）应对噬的斑菌即阳为克隆性

　　限性酶图制：

　　谱用采类似的方法可将，不D同AN用制性酶限酶，切据其根产生多型性，即的制性酶片段限长度多型的性来，分析NDA水平变的异度程以，RLF作为分子标P进行记基组图因分谱。

　　析核⑵酸子分交①Sou杂hetr杂交n分析：

英由S国uothern（975）1发明，琼将脂凝糖胶的上NA条D转移到带龙膜尼→进行DN上分A杂子分析交方的法。

筛选基库因到阳性克得→将限隆制酶性切酶与Souhetr杂交结合→绘制n制性限酶图谱

　　。

　　⑵核分酸杂交③子Wetesr杂交n析：

分用于白质的分析。

蛋

　　⑶核酸列序测定定克隆测的DN后片A核酸段序。

列一般采S用aneg（19r77发明的双脱氧核糖）酸核终法止定核测序列。

酸在Sanegr双氧脱法，可中荧用光记标来代放射替性记标。

　　⑷核

　　序列酸析分

　　定测的核酸列是序否基因、有什为么功能，需用算计机软或生件学物实验进一步分。

析①源同列的分序②无析任何同性的新序源

　　列①

　　同源序列分的析

　　*同源比较：

将待测序列性在核酸和蛋白质个水两上比平较基因的同源性，间序列发送到将BlatsD等ADatNa数据进库行比。

较*读阅架的分框

　　析：

个O一FR一条是能码编一条多链肽的DN序列，A有具翻译起信始和终号信止号等。

DNcA序列分可析内子含。

　　等

　　能㈡PCR增扩因基

　　合酶链式聚反应（polyemrsaehaincraetcoinPC,）R以体外可快速扩D增NA。

美M国ulls（i9861发明）现代生物（发展史学的上程碑里。

　　）

　　P

　　CR反应个三步（一聚循环个）:

　　1.变性：

9-49℃5使板D模AN双变成单链链；2.复性5:

-700下℃,物引别分与补DNA单互互链配补对3;.延伸：

引在的物导和引aq酶作T用，7下2℃合下模板DNA的成互补。

链PCR应通反有2常5-35循环个，般一扩可5增b左右的片k段。

该技术衍由出一生新些技术，的R如PA和DALP等F技。

术

　　㈢

　　工人合成基因据已根的知因基氨基或序酸列，化将学合成核寡酸的苷方法与促酶合成NDA的方结合起来法可快很人地合工基成因。

如OE-PSRCs（eueqnceoerlvpaepd可增出完扩extenisonS,EO）术整的技因基列。

序

　　㈢人工

　　1.基因转：

生长快鱼耐不良、环、肉境质的转好基因鱼中（）国。

.转2基牛：

因汁乳中含人生有长激素的转基因（牛根廷）。

阿.转3黄瓜青枯抗基病因的甜椒5.黄瓜抗青转病基因的马铃枯薯4.转鱼抗寒因的基茄番6.不会引过起的敏基因大豆转

　　.超7级物：

导入贮动蛋藏白因的超基级羊超级和鼠小8特殊.动：

物入导基人因具特殊途用的和猪小9鼠抗.虫棉苏：

云金胞芽菌可杆成合蛋白杀毒棉死铃，把这虫分部因基入棉花的离体导胞中，再组细织养就培获得抗可虫棉

　　。

转

　　基因方的法和技术

　　㈠基因程工业最工应用基因工程生早人产蛋白质的方的是在法菌细中达表的胰人素岛198（）。

2方法如左下图所示。

现已在细中生菌1产0多种药品例如表皮，生因长、人生长激子素因子、干素扰乙、型肝炎程工苗疫等。

目，酵前母菌、物植悬浮胞、细植和动株物养细胞培成均功应用于地表外达源白蛋。

　　基工因程岛素

　　胰岛胰是素治糖疗病的特效尿，药期长来以能依靠只猪、从等动物牛的腺胰提中，取010K胰g腺能只取提-45的胰g岛，其产素量低之价格和之可高想而。

知将合的胰岛成素因基入大导肠菌杆每，0200L培养液能产就生100胰g素岛！

大模规工化生产不但解决了这种比黄业金贵还的药品产量题，问使还价格降其了30低%5%0!

　　因基工生程产人的胰岛素

　　应用大肠杆菌产生人类生长激素

　　基工程干因素扰干扰素疗治毒感染病简直“万能是药灵”!

过去人血从中取，3提0L血才提取1mg!

其“0贵”程珍自不度多用。

说基工因人干扰素程α2-b（达芬安）我是第国一个全国产业化因基程人工干扰α素2b-具有，抗病，抑毒制瘤肿胞增细，调生人节免体疫能的功用，广作泛用病毒于性疾病疗和多种治瘤肿的治，是当疗前际公国的认毒性病疾病治的疗首选物药肿瘤生物和疗的主要药物治

　　。

　　其基它因程工物药

　　人造液、血细胞介白、素肝疫苗乙等过基通因工实程现工化生业，均为产除解人的病类苦提，人类高的康水平健发挥了大的重用。

作㈡

　　物基因工植程物植基转因化指是外源基因将转移到植物细内胞并整、到合物植因基中稳组定遗传和达的过程表许。

多物基植已经被分因离克隆。

、农杆菌转法化基和因转枪化应用法多最。

　　.1根癌杆菌农化转技术

　　根癌农菌杆导介植物的化转术技应最用（早双子叶物植→单子植叶）。

物程：

将目的过基与因动启（花椰子病毒菜3S5）终止及组子嵌成DN合A分→子插入到Ti生衍质粒R与BBL构内重成组质→粒转化农菌杆胞细→用重利组杆农去感染植菌物胞细使→粒质分部DNA包括的基因，目合到整植物染色→实体遗现传化转。

利用草抗磷（g甘lyhposae）tE.clio中离分隆的克EPSP成酶基因，合已培育高抗出草剂除基因转植。

物

　　农杆

　　菌化法转

　　2.基枪转因技化术

　　高以压气体动力为，速发高包裹有重射组DA的N属金颗→粒将的基目因直导入接植细胞物→整合染色到体。

上化的转体多以载pUC系质列粒为基构础→建通常有细具复制菌原及点抗性选择标记可、在植中物表的达动子、启终止子及控调序、列物植抗性选标择记如除（草、潮剂霉素等性）。

抗

　　㈢转因动基物

　　转基动物