克隆操作流程.docx

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克隆操作流程

生产部克隆组操作流程

一、PCR扩增目的片段

实验原理:

PCR（polymerasechainreaction）是一种常用的分子生物学技术，常用于体外扩增特异的DNA片段。

基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（有时直接用单链DNA作为模板），以便它与引物结合；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三个基本过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

PCR仪：

LongGeneL96+Thermalcycler

离心机：

TGL-16,湘仪

凝胶电泳仪：

TanonEPS300

凝胶成像系统：

Tanon2500，

其林贝尔离心机：

LX-5000

微波炉

1.2实验试剂：

天根pfuDNApolymerase（2.5U/ul）

天根dNTP（10mM/ul）

TAKARADNAmarker（DL5000、DL10000）

1XTBE缓冲液

超纯水

2、实验步骤：

（1）将干粉引物以12000rpm离心30s，小心打开管盖按照引物订单报告加灭菌的超纯水稀释至10mM，震荡混匀（打开盖子前一定要离心，避免干粉引物飞溅）。

（2）在0.2ml的离心管中加入以下成分：

质粒模版（25ng/ul）

1ul

Primer1（10mM）

1ul

Primer2（10mM）

1ul

10×PfuBuffer

5ul

dNTPmixture（10mM）

1ul

PfuDNA酶（2.5u/ul）

0.5ul

ddH2O

?

ul

总体积

50ul

（模板一般可以是质粒、单或双链DNA片段、cDNA等或其他不同复杂类型的模版，加入的量有一定的变化。

一个典型的50ulPCR反应，加入的模板量为0.1ug-2ug；dNTP的浓度为50umol/L-200umol/L；每条引物的量为0.1umol-1umol，加入的酶为1.5U-2.5U。

最后加水保证总体积为50ul，做多管的时候可以把除引物模板以外的组分混合后分装，离心5s混匀，然后置于PCR仪的工作台上）。

（3）设置PCR运行参数并运行：

（4）用微波炉加热0.75%琼脂糖凝胶至完全溶解，在胶板上插上梳子倒一块胶，静置凝固。

（5）PCR反应结束后取2ul产物进行电泳，检验是否扩增成功，确定有目的条带后其余样品进行PCR产物纯化（或胶回收）。

二、PCR产物的纯化（或者切胶纯化）

实验原理：

PCR产物一般都含有过量的引物、DNA聚合酶、引物二聚体、模板DNA及dNTP等，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切反应、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。

目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。

本实验采用Biospin胶回收试剂盒对PCR产物直接进行纯化，ExtractionBuffer促进60bp-23kb间的DNA片段选择性的吸附在膜上，经WashBuffer洗涤除去引物二聚体、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料等，最后经去离子水将目的DNA片段从膜上洗脱下来。

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

湖南湘仪离心机：

TGL-16,

金属恒温加热器：

博彩生物HB301

1.2实验试剂：

Biospin胶回收试剂盒

超纯水

2、直接纯化实验步骤：

（1）向PCR产物中加入5倍体积的ExtractionBuffer,混匀。

（2）将混合液全部转移到吸附柱，静置2分钟，8000rpm离心1min,弃去收集管中的液体（静置是为了保证吸附膜能充分吸附DNA）。

（3）向吸附柱中加入500ulExtractionBuffer，12000rpm离心1min,弃去收集管中的液体（洗去残留在吸附膜上的酶蛋白物质）。

（4）向吸附柱中加入750ulWashBuffer（初次使用时按照说明书加入相应体积的无水乙醇），静置5min，12000rpm离心1min，弃去收集管中的液体（洗去吸附在膜上的离子盐类等物质）。

（5）12000rpm空离2min（离心除去吸附在膜上的乙醇，避免对后续实验的影响）。

（5）将吸附柱转移到灭菌的1.5ml的离心管中，静置1min（静置使乙醇完全挥发）。

（6）向吸附柱内加入80ul55℃左右的超纯水，室温静置5min（静置使DNA能充分溶解于H2O中）。

（7）于12000rpm离心1min，离心管内的液体即为DNA溶液（重复两次）。

3、割胶纯化步骤：

（1）根据上样体积的多少，在制胶板上倒上加样孔大小合适的琼脂糖凝胶（根据待分离DNA目的片段的大小与非特异性片段的大小调整凝胶浓度，一般使用0.75%的胶，当待分离片段较大时，适当降低胶的浓度；当待分离的片段较小时，适当增加胶的浓度）。

（2）将DNA样品与相应体积的上样缓冲液（LoadingBuffer）混匀全部加到上样孔中，120V恒压电泳30-45min。

（3）从电泳槽中取出凝胶，放入EB溶液槽中染色5-8min，取出凝胶并放入清水中冲洗一次。

（4）在凝胶成像系统下，用刀片切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，并放入2ml离心管中（操作人员要做好安全防护措施，胶不要长时间在紫外灯下照射，避免DNA的损伤）。

（5）按1:

3的比列（凝胶质量毫克数：

融胶液体积微升数）加入ExtractionBuffer。

（6）在恒温加热器上50℃温育10min，每隔3min颠倒混匀（一定要保证胶完全融化，否则会堵塞吸附膜，影响DNA的回收率）。

（7）同直接纯化的

（2）-（7）步。

三、DNA片段的酶切及纯化

实验原理：

DNA限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基序列并在特定的位点进行切割的核酸水解酶。

使用两种DNA限制性内切酶分别对DNA片段和载体DNA进行酶解可以获得所需的特定DNA粘性末端，以便将DNA片段与载体进行连接。

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

数显鼓风干燥箱BOXUNGZX-9146MBE

其林贝尔离心机LX-5000

1.2实验试剂：

TAKARA各种常用的DNA限制性内切酶

超纯水

2、实验步骤：

（1）下面以TAKARA的BamHI和XhoI对DNA进行双酶切举例：

在1.5ml的离心管中加入下面的体系：

PCR产物（20ng/ul）

80ul

10×BufferK

10ul

BamHI（10U/ul）

2ul

XhoI（10U/ul）

2ul

ddH2O

6ul

总体积

100ul

将离心管轻弹混匀，并低速离心3S（加入酶量的多少会根据PCR产物量的多少、酶切时间、酶切体系大小有适当的变化，一般在100ul的体系中，酶切1ug的DNA片段，反应4h加入的酶为10U-20U）。

（2）将离心管放入37℃的干燥箱中保温4h。

（3）4h后取出离心管，按照PCR产物的纯化方法进行纯化并电泳。

注：

当双酶切的酶没有合适的公共Buffer时，只能进行分步酶切。

使用的酶量不要过多，避免产生星号活性。

四、质粒的提取及酶切

质粒提取实验原理：

本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

收集适量的菌体在碱性条件下（NaOH）细胞被裂解，释放出质粒DNA、基因组DNA、蛋白质等各种物质，经过离心沉淀，酚/氯仿抽提，75%乙醇洗涤除去基因组DNA、蛋白质、盐类等，最后用适量的去离子水溶解质粒。

本实验使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒进行提取质粒。

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

离心机：

TGL-16，湘仪

数显鼓风干燥箱BOXUNGZX-9146MBE

凝胶电泳仪：

TanonEPS300

涡旋震荡仪

微波炉

1.2实验试剂：

AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，AxygenAP-MN-P-250

TAKARA各种DNA限制性内切酶

超纯水

2、质粒提取实验步骤：

（1）收集2ml菌液于2ml离心管内，12000rpm离心1min，弃上清。

（2）向离心管内加入250ulBufferS1，在震荡仪上震荡至完全悬浮（BufferS1中含有葡萄糖、RNaseA、EDTA，葡萄糖的作用是保证悬浮的菌体不会很快聚沉，RNaseA水解RNA，避免RNA的污染，EDTA可以螯合DNA水解酶发挥作用必需的Mg2+，防止质粒被水解）。

（3）向离心管内加入250ulBufferS2，并立即盖上管盖，上下轻轻翻转6-8次混匀，静置可观察到溶液变得澄清粘稠（BufferS2中含有NaOH和SDS，NaOH强碱性使菌体裂解，基因组DNA和质粒变性，双链打开等，SDS有弱碱性溶于水，在下步起作用。

静置时间不要超过5min）。

（4）向离心管内加入350ulBufferS3，轻轻上下翻转6-8次，12000rpm离心6-8min（BufferS3中含有HAc和KAc，HAc中和NaOH，使溶液形成一个合适的PH，质粒的双链可以恢复而基因组DNA双链无法恢复；KAc的K+置换SDS中的Na+形成难溶于水的PDS将变性的基因组DNA和蛋白质一起形成沉淀）。

（5）吸取上清至吸附柱内，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液。

（6）向吸附柱内加入500ulBufferW1，12000rpm离心1min，弃滤液（BufferW1是酚-氯仿溶液，除去膜上吸附的残余蛋白质）。

（7）向吸附柱内加入750ulBufferW2，12000rpm离心1min，弃滤液（BufferW2主要是75%的乙醇，除去盐离子，重复两次）。

（8）将吸附柱放回离心管，12000rpm离心2min，弃滤液。

（9）将吸附柱放入灭菌的1.5ml的离心管中，静置2min，在吸附柱膜中央加入50ul55℃的灭菌水静置1min。

（10）12000rpm离心1min，滤液即为质粒溶液。

（11）0.75%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的质粒。

3、载体酶切纯化原理同DNA片段酶切纯化原理，实验步骤：

（1）下面以TAKARA的BamHI和XhoI对质粒进行双酶切举例：

在1.5ml的离心管中加入下面的体系:

质粒溶液（60ng/ul）

50ul

10×BufferK

10ul

BamHI（10U/ul）

4ul

XhoI（10U/ul）

4ul

ddH2O

？

ul

总体积

100ul

将离心管轻弹混匀，并低速离心3S。

（2）将离心管放入37℃的干燥箱中保温4h（酶切过夜时酌情减少酶的用量）。

（3）4h后取出离心管，按照切胶纯化步骤对载体进行纯化。

（4）0.75%琼脂糖凝胶电泳初步检测酶切载体的质量及初步定量。

五、连接反应

实验原理：

载体DNA和目的片段DNA经过相同的DNA限制性内切酶消化处理后，会产生相同的粘性末端，T4DNALigase能催化双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的磷酸二酯键，使DNA片段插入到质粒载体中。

由于质粒载体和DNA片段都是双酶切消化的，在连接反应时可以避免载体的自身环化以及实现DNA片段的定向插入。

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

保温盒其林贝尔离心机：

LX-5000

1.2实验试剂：

TAKARAT4DNALigase（或者NEBT4DNALigase）

2、实验步骤：

（1）用碎冰将保温杯温度调至16℃（常用的T4DNALigase的最高活性温度是37℃，但我们在连接反应中采用的是16℃是因为在37℃下连接形成的磷酸二酯键不稳定，在16℃下酶的活性较高，形成的磷酸二酯键较稳定，因此采取16℃进行连接反应）。

（2）在0.2ml的离心管中加入下面的体系：

载体DNA（30ng/ul）

2ul

目的片段（20ng/ul）

6ul

10×T4DNALigaseBuffer

1ul

T4Ligase（350u/ul）

1ul

总体积

10ul

轻弹混匀，低速离心，将离心管放入保温盒内16℃保温4h，以备进行转化实验（一般条件下，载体与片段的目的片段的摩尔比为1：

3）。

六、感受态细胞的制备

实验原理：

大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（如：

CaCl2、RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过细胞膜进入细胞内的状态，本实验采用CaCl2法处理大肠杆菌制得感受态细胞，实验中常用的感受态细胞是甲基化缺损和限制性内切酶缺陷性的宿主细胞。

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

湖南湘仪离心机H-2050R

上海欣茂721型可见分光光度计

超净工作台

制冰机

高压灭菌锅

50ml离心管（2支）

1.2实验试剂：

LB培养基

灭菌0.1mol/L的CaCl2溶液

灭菌40%的甘油

灭菌20%CaCl2-甘油（40%甘油与0.1mol/L的CaCl2等体积混合）

2、实验步骤:

（1）第一天取保留的感受态菌株（如DH5α）于超净工作台中划一个无抗平板37℃培养16-18h，分离单菌落。

（2）第二天在超净工作台中挑取平板上的单菌落，置于2ml的无抗的培养基中37℃摇培过夜（220rpm、16-18h）。

（3）第三天在超净工作台中取1ml培养好的菌液加入到200ml培养基中摇培（37℃、220rpm）3-5h，并测定OD值（一定要注意OD值，OD值太小，菌的浓度不够；OD值太大，菌的活性降低）。

（4）当测定OD值达到0.3-0.5后将培养瓶置于冰盒中静置10min，然后将菌液转移至灭菌的离心瓶离心，于4℃4000rpm离心10min，弃去上清。

（5）向离心瓶中加入10ml预冷的0.1mol/LCaCl2并悬浮菌体，马上于4℃4000rpm离心10min，弃去上清（此为洗涤除去菌体上的培养基等等物质）。

（6）重复步骤（5）

（7）向离心瓶中加入3ml预冷的20%CaCl2-甘油悬浮菌体，并分装到灭菌预冷的1.5ml的离心管中（每支管分装100ul）。

置于﹣20℃冰箱保存备用。

六、转化

实验原理：

本实验采用热转化法使DNA连接产物（即重组质粒）被感受态细胞所吸收并能稳定的在宿主细胞内存在和增殖。

目前关于热转化法的机理研究尚不是很清楚，以下为一种说法：

细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增强，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA水解酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物。

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

超净工作台

数显恒温水浴锅

制冰机

摇床博彩生物

离心机：

TGL-16，湘仪

数显鼓风干燥箱BOXUNGZX-9146MBE

1.2实验试剂：

DH5α感受态细胞

LB液体培养基（无抗生素）

LB培养基固体平板（1ml培养基+1ul相应抗生素）

2、实验步骤：

（1）打开超净工作台，紫外杀菌20min然后开风机。

（2）从冰箱取DH5α置于冰盒中融化（一支感受态分3支使用）。

（3）在超净工作台中将10ul连接产物注入感受态中，并置于冰盒中，计时30min。

（4）开恒温水浴锅，将温度调节为42℃，30min钟后，将感受态置于水浴锅中90s（严格控制热击时间），再将感受态置于冰盒中5min。

（5）向感受态中加入800ulLB液体培养基，将离心管固定在摇床中，37℃，220rpm培养45min（对于转化连接产物，一般都要进行复苏，在转化质粒时，可以根据感受态细胞的转化效率，质粒浓度等决定是否进行复苏）。

（6）45min后，取出离心管，7000rpm室温离心1min，弃去700ul上清。

（7）在超净工作台中用移液枪将离心管中的菌液吹至悬浮均匀的涂在有相应抗生素的平板上。

（8）将平板置于干燥箱中，37℃培养过夜（一般培养16h，培养时间过长，可能会长出卫星菌落，影响挑取单克隆）。

七、挑取单克隆

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

超净工作台

摇床博彩生物

1.2实验试剂：

LB液体培养基（1ml培养基+1ul相应抗生素）

2、实验步骤：

（1）早上从干燥箱中取出平板，并观察菌落生长情况。

（2）打开超净工作台，并紫外杀菌20min。

（3）取10ml的试管，每支试管中加入2ml的LB液体培养基。

（4）用灭菌的10ul的枪头从平板上挑单菌落置于试管中，每个平上挑取2-3个单菌落（一定要留一支试管做空白对照以判定是否因操作等问题染菌）。

（5）将试管置于摇床37℃，220rpm培养18-20h。

八、菌液PCR验证

实验原理：

含有目的片段的重组质粒被大肠杆菌吸收后，会随着大肠杆菌的增殖而增殖，以培养的菌液为PCR反应的模板，若菌体中含有重组质粒，菌体在高温裂解时会释放出重组质粒，该质粒所包含的目的片段可以作为PCR反应的模板，从而能扩增出相应大小的目的片段。

1、实验仪器及试剂

1.1实验仪器：

PCR仪：

LongGeneL96+Thermalcycler

凝胶电泳仪：

TanonEPS300

凝胶成像系统：

Tanon2500

其林贝尔离心机：

LX-5000

超净工作台

1.2实验试剂：

天根TaqDNApolymerase（2.5U/μl）

天根dNTP（10mM/μl）

载体通用引物（10mm/L）

TAKARADNAmarker（DL5000、DL10000）

1XTBE缓冲液

超纯水

2、实验步骤：

（1）开超净工作台，紫外杀菌20min。

（2）在超净工作台内将每支试管中的菌液取出200ul，做好标记，以备送测序。

（3）在0.2ml的离心管中加入以下成分：

菌液

2ul

Primer1（10mm/L）

0.5ul

Primer2（10mm/L）

0.5ul

10×TaqBuffer

2.5ul

dNTPmixture（10mM）

0.5μl

Taq酶（2.5u/ul）

0.25μl

ddH2O

19ul

总体积

25ul

将离心管轻轻混匀，低速离心3S，然后置于PCR仪的工作台。

（4）PCR仪运行参数设置：

94℃8min

94℃30sec

55℃45sec

72℃（1kb/min）2min

72℃8min

4℃∞

（5）反应结束后，取每支离心管中的PCR产物5ul进行电泳检测，并判定条带大小是否正确。

九、测序

将PCR验证正确所对应的阳性菌液送测序公司进行测序。

十、转交

测序结果经比对后，将正确的的菌液提取质粒，然后转交给蛋白表达组进行蛋白表达及后续试验。

附：

克隆组常用试剂配方

1、20×TBE电泳缓冲液1L（储存液）：

216gTrisbase

110g硼酸

80ml0.5mol/LEDTA（PH8.0）

去离子水定容至1L保存，使用时取100ml定容至2L（即稀释为1X工作液）。

注：

TBE的缓冲能力较强，可以较长时间维持PH的稳定，加入的EDTA的作用是螯合DNA水解酶起作用所必需的Mg2+，防止在电泳过程中DNA被水解。

2、LB培养基（1L）：

蛋白胨：

10g

酵母提取物：

5g

NaCl：

10g

去离子水定容至1L，高压灭菌。

若是配制固体培养基，每100ml培养基中加入1.5g琼脂然后灭菌。

3、0.8%琼脂糖凝胶（100ml）:

0.8gregularagaroseG-10

100ml1XTBE

微波炉加热至完全融化备用。

4、常用抗生素储存液：

氨苄青霉素：

50mg/ml（溶于水）

氯霉素：

34mg/ml（溶于乙醇）

卡那霉素：

50mg/ml（溶于水）

壮观霉素：

100mg/ml（溶于水）

使用时1ml培养基里加入1ul抗生素。

配制抗生素时的水和离心管要保证灭菌，分装时在超净工作台操作。

5、TIANGEN10XPfuBuffer：

200mMTris-HCl（PH8.8）；100mMKCl；100mM（NH4）2SO4；20mMMgSO4；其他成分。

6、TUANGEN10XTaqBuffer：

200mMTris-HCl（PH8.4）；200mMKCl；100mM（NH4）2SO4；15mMMgSO4；其他成分。

7、TAKARA10XKBuffer：

200mMTris-HCl，PH8.5

100mMMgCl2

10mMDTT（酶保护剂，保持酶的稳定）

1000mMKCl

8、TAKARA10XHBuffer：

500mMTris-HCl，PH7.5

100mMMgCl2

10mMDTT（酶保护剂，保持酶的稳定）

1000mMNaCl

9、TAKARA10XMBuffer：

100mMTris-HCl，PH7.5

100mMMgCl2

10mMDTT

500mMNaCl

10、TAKARA10XT4DNALigaseBuffer：

660mMTris-HCl（PH7.6）

66mMMgCl2

100mMDTT

1mMATP

11、DNA6XLoadingBuffe：

0.05%溴酚蓝（指示剂）

0.05%二甲苯腈蓝FF（指示剂）

36%甘油（增加比重，样品快速沉到孔底）

30mMEDTA（螯合Mg2+）