聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制.docx
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聚丙烯酰胺凝胶电泳配制
聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳（electrophoresis）是指带电颗粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。
在生物化学及分子生物学中，主要是根据生物大分子所带电荷的数量及其在分子表面排布的不同来对它们进行分离和鉴定。
电泳现象早在1809年就被发现，但将这种现象用于生物化学领域却萌芽于十九世纪初，1907年，有人曾研究过白喉毒素在琼脂中的电泳；1937年，瑞典的Tiselius建立了“移界电泳法”（movingboundaryEP）,成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即清蛋白、α1-、α2-、β-和γ-球蛋白。
其后的几十年，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生。
以所采用的固体支持物区分，有纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳
表1电泳技术的种类
类别
名称
型式
不用支持体的电泳技术
1．Tiselleas式微量电泳
2．显微电泳
3．等电点聚焦电泳
4．等速电泳
5．密度梯度电泳
属自由电泳
用支持体的
电泳技术
1．纸上电泳
2．醋酸纤维薄膜电泳
3．薄层电泳
4．非凝胶性支持体区带电泳支持体有：
淀粉、纤维素粉、玻璃粉硅胶、合成树脂粉末
5．凝胶支持体区带电泳
（1）淀粉胶
（2）聚丙烯酰胺
①圆盘电泳法
②平板法
③SDS-凝胶电泳法
（3）琼脂糖凝胶电泳
（4）琼脂凝胶电泳
包括常压、高压电泳
（水平式或垂直式）
水平式或垂直式
（平板法、柱形法及线丝法）
垂直式（柱形法）
垂直式或水平式
垂直式（测分子量）
平板法或柱形法
（如免疫电泳）
其他用法
1．双向电泳
2．电泳—层析相结合
3．交叉电泳纸
4．连续低电泳
等；以电泳形式区分，有在液体介质中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，有板形或柱形的等（表1）。
电泳由于与光学装置、自动记录仪及自动部分收集器结合，又组成了等电点聚焦仪、等速电泳仪等等，80年代末发展起来的毛细管电泳（capillaryelectrophoresis）是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离……这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。
电泳按其分离的原理大致可分为四类：
区带电泳（zoneEP，ZEP）、移界电泳（movingboundaryEP，MBEP）、等速电泳（isotachophoresis，ITP）和等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）。
现将各种电泳分离原理简单介绍如下：
1．区带电泳如图1（a）所示，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。
电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。
加不同的介质可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。
2．移界电泳如图1（b）所示，它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。
各界面可用光学方法显示，这就是Tiselius最早建立的电泳方法。
3．等速电泳如图1（c）所示，在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。
按距离对浓度作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。
4.等电聚焦如图1（d）所示，由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成PH梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。
abcd
图1不同电泳法的分离原理示意图
a．区带电泳；b．移动界面电泳；c．等速电泳；d．等电聚焦
电泳技术由于具有快速、简便及高分辨率等优点，其应用十分广泛。
从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在生化实验室和生化工业方面应用更为普通；医药部门还用作临床诊断。
在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。
本文主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与技术。
（一）迁移率（泳动度）
1．电泳速度
设溶液中有一带有正电荷Q的颗粒，在强度为E的电场影响下移动，带电颗粒所受的力为F＝QE。
同时此颗粒的移动受到方向相反的摩擦力F1＝fv的阻碍，f代表摩擦系数，v代表速度。
当这两种力相等时，颗粒以速度v向前迁移（图2）。
即
QE＝fv………………………………………………………………………
（1）
H
+
_
v
v＝QE/f………………………………………………………………………
（2）
Q
F′=fv
F=QE
图2带电颗粒在电场中迁移的受力情况
摩擦系数f和扩散系数D的关系为
f＝KT/D………………………………………………………………………（3）
其中K为布氏常数，T为绝对温度，因此可以从颗粒的扩散系数求出。
根据Stoke定律，一球形分子在溶液中泳动所受的阻力
F1＝6πrηV…………………………………………………………………（4）
r为颗粒半径，η为介质粘度，v为泳动速度。
（4）式同F1＝fV式比较可得：
f＝6πrη……………………………………………………………………（5）
（5）式代入
（2）式得：
V＝QE/6πrη…………………………………………………………………（6）
由（6）式可知，带电颗粒在电场中的电泳速度v与其所带电荷Q，电场强度E成正比，与颗粒半径r大小，液体粘度系数η成反比。
即在同一电场同一介质中的颗粒，如带电荷数不同或颗粒大小不同,则各自电泳速度不同，因而电泳能使各颗粒分开。
2．迁移率
颗粒在电场中移动的快慢一般不用电泳速度来表示。
因为同一颗粒在不同电场中其电泳速度是不同的，由
（2）式或（4）式可见速度是电场强度的函数，V＝f（E）,用v不能反映颗粒本身的特性。
因此，颗粒移动快慢通常用迁移率μ或m来表示。
泳动度为带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度。
即:
μ＝v/E＝（d/t）/（V/l）＝dl/Vt（cm2·v-1·s-1）………………………………（7）
d为颗粒泳动距离（cm）,l为支持物的有效长度（cm）,V为加在支持物两端的实际电压（v）,t为通电时间（s）
（6）式代入（7）:
μ＝Q/6πrη……………………………………………………………………（8）
由（8）式可见，迁移率与带电颗的带电荷数，半径、介质粘度有关，而与电场强度无关。
所以说，在确定条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。
3．有效迁移率
由迁移率的定义式μ＝v/E可得
v＝μE…………………………………………………………………………（9）
即电泳速度与迁移率和电场强度成正比。
由于电解质在溶液中不同程度的电离对离子迁移速度影响较大，因此，在实际电泳过程中，离子在电场力作用下电流速度是由下式决定的。
v＝αμE…………………………………………………………………………（10）
式中α是电离度，μ是离子迁移率，αμ称为有效迁移率。
显然，带电颗粒的有效迁移率大，其电泳速度也就大。
离子有效迁移率在讨论聚丙烯酰胺凝胶电泳时是一个很有用的物理量。
因为在粗孔胶中为了保证蛋白质p夹在先行离子Cl-和随后离子甘氨酸根G-之间使蛋白质样品浓缩、压成薄片就必须对粗孔胶设计一个缓冲体系，以使得它维持的PH值所造成的离子解离度，刚好满足如下关系，即
αC1-mC1-＞αP-mP-＞αG-mG-
这就是电场强度相同时离子在粗孔胶中实际迁移的顺序。
式中的m就是离子迁移率u，之所以变更符号，其原因是它所用的单位常以10-5cm2·V-1·s-1为一个m单位。
当分离成分电泳到细孔胶后，由于要使蛋白质在这一分离胶中分开成区带，而不使甘氨酸根影响蛋白质的分离，因此需要设计另一个PH缓冲体系，使之满足
αC1-mC1-＞αGmG＞αP-mP-
这时随后离子一跃而起超过各种蛋白质。
（二）影响电泳的外界因素
电泳速度除受颗粒本身的性质如带电性，直径大小等影响外，还受其他外界因素的影响。
1.电场
（1）电场强度（电势梯度）
电场强度是指单位长度上的电压降（v/cm）。
由
（2）式见，电场强度E对泳动速度起着十分重要的作用，电场强度越大，电泳速度越快，单位时间内颗粒迁移的距离就越大，电泳时间就可缩短。
根据电场强度的大小可将电泳分为二类：
常压电泳（100～500v）与高压电泳（500～1000v）,前者电场强度一般为2～10v/cm，后者为20～200v/cm，常压电泳分离时间长，需数小时到数天，多用于分离大分子物质，高压电泳分离时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物质。
在实际工作中有时需要进行快速电泳，如果没有高压电泳设备，人们往往利用上述原理，把常压电泳槽小型化，缩短支持介质的两端距离。
例如将原来两端相距20cm改为5cm，此时外加电压虽仍是200v，但电场强度则从10v/cm变为40v/cm，这就加快了电泳速度。
有时为了使样品迁移率放慢，也可调小电压，降低电势梯度。
（2）电极及电极反应
电泳的电极材料大都选用铂金丝，铂金丝的安放位置影响电场强度。
如两极间铂金丝位置放得不好，电场强度不均匀，常会使电泳谱带弯曲或同一样品的迁移速率不一样。
通电过程中电极二端会发生电解反应：
正极（氧化极）H2O→2H++1/2O2↑+2e-
负极（还原极）2H2O+2e-→2OH-+H2↑
因此在电泳过程中，正负极均可看到气体产生（负极有密集的氢气泡，正极有较大的氧气泡），电泳过后，两个电泳槽的PH可相差很大（2～4个PH）。
另外电泳过程中会产生热量，尤其是高压电泳，因此高压电泳槽要附有冷却设备，常压电泳可放在冰箱中降温。
2.缓冲液
缓冲液的成分及浓度决定并稳定着支持介质的PH和溶液的离子强度，并影响着带电颗粒的迁移率。
（1）成分通常电泳用的缓冲液有：
巴比妥（钠）；硼酸（钠）；磷酸盐；Tris等。
要根据电泳类型和对象选用缓冲液成分，例如用纸电泳分离血清蛋白可选用巴比妥-巴比妥钠缓冲液，而聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶常可用Tris-甘氨酸缓冲液……。
缓冲液成分总的要求：
不使样品变性，不改变支持物的理化性质，不影响电泳后染色，有利于电泳的进行及样品的分离。
（2）浓度主要影响溶液的离子强度（μ）。
离子强度是离子浓度（Ci）和离子价数（zi）的函数μ＝f（ci、zi）稀溶液的离子强度可用下式计算
μ＝1/2Σ1SCiZi2
式中s表示共有s种离子；Ci为离子的摩尔浓度；zi为离子价数。
例如0.01mol/LNa2SO4加0.02mol/LNaCl溶液的离子强度应为：
μ＝1/2（0.01×12+0.01×22+0.02×12+0.02×12）＝0.045
离子强度越高，颗粒的迁移速度就越慢。
在电解质溶液中，带电荷的颗粒能把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围，形成一个离子扩散层。
一方面影响颗粒所带的电荷，降低其在电场中的电场力F，从而影响迁移速度（式2）；另一方面，当加以电场时，颗粒向与其电荷相反的电极移动，即带正电荷颗粒移向负极，带负电荷颗粒移向正极，离子扩散层由于携带过剩的与颗粒符号相反的电荷，则向相反方向移动，结果因颗粒与离子扩散层之间的静电引力，使颗粒迁移速度减慢。
上述（8）式是由理想的绝缘体系推导的，如果考虑离子强度的影响：
μ＝（Q/6πrη）/（1+kμ1/2r）
k为常数，25℃,k＝0.33×103,μ为离子强度。
缓冲溶液浓度低时，离子强度减少，会影响溶液的导电性，样品分子扩散加重，分辨率下降。
因此缓冲液的离子强度应有个适宜的范围，一般控制在0.02～0.2之间。
（3）PH
溶液的PH值决定了带电颗粒解离的程度，决定了物质所带电荷的性质和数量，也决定了样品的迁移方向。
以蛋白质为例，当溶液的PH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液PH大于等电点时，蛋白质分子带负电荷，成为阴离子，PH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，迁移速度越快，反之越慢。
图3表示了不同PH条件下，蛋白质分子带电荷情况及其在电场中运动状态。
-H+
-H+
PH
PH＜PI
PH＝PI
PH＞PI
蛋白分子的电荷
+H+
+H3N-R-COOH
+H+
+H3N-R-COO-
H2N-R-COO-
离子形式
阳离子
两性离子
阴离子
在电场中的迁移方向
向阴极
不迁移
向阳极
图3蛋白质分子在不同PH条件下所带电荷及其在电场中迁移方向的示意图
因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的PH缓冲液。
电泳时，正负电极接线也要随PH变化而变化，例如在碱性条件下，蛋白质带负电荷，正极应接在远离加样品的一方，以使蛋白质在支持物上定向迁移。
3．支持物
多数电泳都有支持物，如纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，然而支持物的结构与性质对带电颗粒的迁移率有很大影响，主要表现为对样品的吸附，产生电渗与分子筛效应。
支持物对样品的吸附，使带电颗粒泳动过程中，摩擦力增加，一方面降低了迁移速度，另一方面导致样品拖尾，故使分辨率下降。
在电场中液体对于团体支持物的相对移动称为电渗。
例如在纸电泳中，由于组成纸的纤维素带负电荷，因感应相吸而使与纸相接触的水层带正电荷（H3O+），使溶液在电场作用下向负极移动，并带动物质向负极移动。
如果样品原来带正电荷应向负极移动，结果由于电渗使样品移动得更快，反之就会变慢，甚至倒退。
用PH8.6的巴比妥缓冲液进行血清纸电泳，在这PH下蛋白质带负电荷应向正极移动，可是r-球蛋白却移向负极，这就是电渗造成的，因为这时溶液向负极流动，对蛋白质颗粒泳动起阻碍作用，又加上r-球蛋白分子颗粒较大，移动慢，电渗作用大于颗粒的泳动力，结果使颗粒后退。
纸和淀粉等支持物电渗作用明显，醋酸纤维和聚丙烯酰胺凝胶电渗较小。
分子筛是凝胶电泳的一个特性，用来作电泳的凝胶通常具有网状结构且具有弹性的半固体物质，具有分子筛作用，使小颗粒易透过，而大颗粒不易通过，凝胶的分子筛效应对分离样品是有利的。
二、聚丙烯酰胺凝胶的合成、结构与性质
1.合成
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide，简称Acr）和交联剂N1，N1-甲叉双丙烯酰胺（N，N-methylenebisacrylamide,简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构的凝胶（图4）。
参与反应的催化剂有二种成分。
一是引发剂，它提供原始自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应；二是加速剂，它加快引发剂释放自由基速度。
表2是常用引发剂与加速剂的搭配。
过硫酸铵和核黄素分别引发二种不同类型的反应。
表2聚合反应催化剂的搭配
引发剂
加速剂
引发反应
（NH4）2S2O3
（NH4）2S2O3
核黄素
TEMED
DMAPN
TEMED
化学聚合
化学聚合
光聚合
TEMED，N，N，N1，N1-tetramethy1ethylenediamineN,N,N1N1-四甲基乙二胺；
DMAPN，3-dimethylaminpropionitrile,3-二甲基氨丙腈
化学聚合：
过硫酸铵在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，进而使单体形成自由基，引发聚合反应。
聚丙烯酰胺凝胺的分离胶（小孔胶），就是通过这种化学聚合而合成的。
光聚合：
核黄素在光下形成无色基，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。
但过量的氧会阻止链长的增加。
此法比上法制得凝胶的胶孔大，因此常作电泳中的浓缩胶。
以上的聚合反应，受许多因素的影响。
（1）大气氧能淬灭自由基，终止聚合反应，所以反应液应当与空气隔绝。
（2）有些材料，如有机玻璃能抑制聚合反应，在有机玻璃容器中，反应液和容器表面接触的一层，不能形成凝胶。
（3）某些化学物质可以减慢反应速度，如铁氰化钾。
（4）温度影响聚合反应，温度高，反应快；温度低，反应慢。
因此在设计电泳器和制备凝胶时，要注意这些因素的影响。
图4丙烯酰胺，N’,N’-甲叉双丙烯酰胺和聚丙烯酰胺的化学结构式
2．凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
为了使样品分离得快，操作方便，便于记录结果和保存样本，要求凝胶有一定的物理性质，合适的筛孔，一定的机械强度，良好的透明度。
这些性质很大程度上是由凝胶浓度和交联度所决定的。
100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数称为凝胶浓度，记号为T。
T（%）＝［Acr（g）+Bis（g）］/V（ml）×100%
凝胶溶液中，交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度，记号为C。
C（%）＝Bis/（Acr+Bis）×100%
凝胶浓度能够在3%～30%中变化，浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；浓度太小，凝胶稀软，不易操作。
凝胶浓度主要影响筛孔的大小。
实验表明，筛孔的平均直径和凝胶浓度的平方根成反比。
P＝kd/T1/2
P.网孔的平均直径；T.多聚体浓度；d.多聚体分子直径（5A）K.常数，假如多聚体链结构近似直角交联的，则K为1.5
例如：
T＝5%时P＝1.5×5A/5%1/2≈33.5A
T＝7%时P＝1.5×5A/7%1/2≈28.3A
交联度C反映凝胶结构中甲撑桥的密度。
交联过高，凝胶是不透明的，并且缺乏弹性；交联过低，呈糜糊状。
交联度可以决定筛孔的最大直径。
在实验中观察到，要获得透明而有合适机械强度的凝胶，单体用量高时，交联量应减少，单体用量低时，交联剂量应增大。
下式是一个要求良好的电泳用凝胶的经验公式。
在100ml溶液中：
Acr（g）×Bis（g）≈常数（约1.3）
凝胶浓度与被分离物的分子量大小关系。
大致可用表3表示。
表3分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
适用的凝胶浓度（%）
蛋白质：
<104
1～4×104
4×104～1×105
1～5×105
75×105
20–30
15～20
10～15
5～15
2～5
核酸：
<104
104～105
105～2×106
15～20
5～10
2～2.6
最常用的凝胶，T＝7%～7.5%，C＝2%～3%，Davis标准凝胶的组成是，T＝7.2%，C＝2.6%。
用此浓度的凝胶分离生物体内的蛋白质能得到较好的结果。
当分析一个未知样品时，常常可先用7.2%的标准凝胶或用4%
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