六味地黄汤对雌性致衰模型小鼠生殖器官影响的实验研究.docx

六味地黄汤对雌性致衰模型小鼠生殖器官影响的实验研究.docx

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六味地黄汤对雌性致衰模型小鼠生殖器官影响的实验研究

六味地黄汤对雌性致衰模型小鼠生殖器官影响的实验研究

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

【摘要】目的观察六味地黄汤（LW）对雌性致衰小鼠生殖器官的影响。

方法小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖建立衰老模型，同时给予六味地黄汤、己烯雌酚治疗，然后检测六味地黄汤对β-内啡肽（β-EP）、血清雌激素（E2）、孕激素（P）含量以及对卵巢、子宫形态学的影响。

结果六味地黄汤能够提高β-内啡肽含量，增加小鼠阴道脱落细胞涂片内角化上皮细胞和表层细胞，卵巢重量增加。

结论六味地黄汤具有雌激素样作用，可能通过调理下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO）的功能，使卵巢功能恢复。

【关键词】六味地黄汤；卵巢早衰　　Abstract：

ObjectiveToobservetheeffectsofLiuweiDihuangTangoncausingsenilitytoovariaofmice.MethodsToestablishsenilitymodelthroughsubcutaneousinjectionofD-galactogenintotheneckandbackofmice,whichweresubsequentlytreatedwithLiuweiDihuangTangandethylenecyclohexne.Meanwhile,toobservetheeffectsofLiuweiDihuangTangonthecontentofβ-endorphin,sero-estrogenandprogestogen,andonovariaanduterinehistomorphology.ResultsLiuweiDihuangTangcouldimprovethecontentofβ-endorphin,increasethecornifiedandepithelialcellandepidermalcellinthevaginalexfoliatedcellsmearofmice.ConclusionLiuweiDihuangTangservesthesamefunctionasestrogen,whichrestoresthenormalfunctioningofovariabyregulatingtheworkingsofsubthalamus-hypophysis-ovarianaxis.　　Keywords：

LiuweiDihuangTang;POF　　六味地黄汤（LW）是中医滋补肾阴的代表方剂。

由熟地、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮6味药组成,其特点是长于三阴（肝脾肾）并补而以补肾为主的方剂。

长期临床观察此方有抗衰老功能，但从未看到抗衰老实验室对小鼠生殖器官细胞、形态结构研究的报道。

本研究通过把六味地黄汤用于实验小鼠活体内对卵巢、子宫组织细胞、形态结构观察，从而为六味地黄汤对卵巢早衰分子生物学研究提供较可靠的实验依据。

　　卵巢早衰（prematureovarianfailure,POF）是指卵巢功能提前衰退，表现为妇女40岁之前非生理性的月经停止，伴有潮热、原发及继发不孕、全身和生殖器萎缩，卵泡刺激素（follicularstimulatinghomone,FSH）升高（FSH40IU/L）及E2下降。

目前病理机制不甚清楚，而建立POF动物模型对其病因的基础研究以及指导临床的诊断和治疗有重要意义。

由于半乳糖血症患者常表现为原发性闭经或卵巢早衰，且有报道动物体内的半乳糖增多可引起类似与卵巢早衰的改变，故本课题组采用D-半乳糖建立小鼠卵巢早衰动物模型［1］，通过观察LW对小鼠下丘脑－垂体－卵巢轴（HPO）的调节作用及对小鼠生殖器官形态学影响，探讨LW对POF的治疗机制，指导临床诊断和治疗。

　　1材料与仪器　　1.1动物　　雌性昆明种小鼠60只，8～12周龄，体质量25～30g，由河南省南阳医专实验动物中心提供。

饲养环境安静，温度25～35℃，相对湿度为50％～60％，自由进食、水。

　　1.2药品与试剂　　六味地黄汤草药药材购于河南省南阳市医药公司，由南阳医学高等专科学校药理教研室按比例组方，经煎制、过滤、浓缩为1g/ml（以生药汁）六味地黄汤口服液，高压灭菌，O℃冰箱保存备用。

D-半乳糖为上海恒信制药厂产品，批号为20010218。

用灭菌生理盐水配制成50g/L,0℃冰箱保存备用。

乙烯雌酚由上海衡山药业有限公司生产，批号为000201。

雌二醇（E2）放射免疫药盒购自天津德普公司；孕醇（P）放射免疫药盒购自中国医学科学院和医学技术中心；β-内啡肽（β-EP）放射免疫药盒购自海军放免技术中心。

其他制剂均为国产分析纯。

　　1.3仪器和设备　　（2/2）VI普通Ⅰ类B型脱水机，孝感宏业TS-12L；日本原装进口（1/2）JVCTK-C921EC显微镜摄像机；日本原装进口OLYMPUSCX31显微镜；德国原装进口mICROMGMBHHm200切片机；CSˉ摊片机。

电子体温计，DT一ITB型;电子天平，JD2000-2;Y～计数器，GAMMA-C120。

　　2方法　　2.1衰老动物模型的建立　　采用D-半乳糖亚急性衰老模型建立法。

D-半乳糖按每只小鼠经背部皮下注射D-半乳糖0.3ml/（kg·d），注射42d。

　　2.2实验分组　　　　将60只小鼠随机分成正常对照组（A）、衰老模型组（B）、六味地黄汤治疗1组（C），六味地黄汤治疗2组（D），乙烯雌酚组（E），每组12只。

A组、B组各鼠每天灌胃生理盐水20g·kg-1，同时B组，C组，D组，E组各鼠每天经背部皮下注射D-半乳糖0.3ml·kg-1，连续给药42d。

从11天开始，C组，D组分别灌服六味地黄汤（原汁1g/ml浓度）20g·kg-1·d-1或40g·kg-1·d-1，E组乙烯雌酚0.7mg·kg-1·d-1灌胃，连续给药32d。

　　2.3观察指标及方法　　2.3.1动情周期的测定给药两周，逐只连续观察受试动物外阴部、阴道上皮脱落细胞动情周期变化。

用消毒棉签插入小鼠阴道约0.5cm，轻轻转动后取出，将棉签上的阴道脱落细胞均匀涂于洁净的载玻片上，待涂片自然风干后用碱性美蓝溶液染色5min，然后用蒸馏水冲洗，自然风干后镜检，观察细胞形态，确定动情周期。

每日下午定时阴道涂片、H-E染色，细胞学检查。

　　2.3.2P，E2，β-内啡肽检测各组连续灌胃治疗2周后，称量体重并在大鼠动情间期，按放射免疫药盒操作说明测定β-内啡肽及雌、孕激素的含量。

每只鼠取血清200μl，血清量不足的动物将血清合并后检测。

成批检测P，E2,β-内啡肽，留样时要求用1%肝素和抑肽酶抗凝，迅速低温4℃离心，取血浆低温－20℃保存待测。

　　2.3.3生殖器官体质量观察42d采血后断头法处死动物，摘取子宫、卵巢，剔除脂肪和其他组织，滤纸稍拭后，分别放入电子分析天平精确称出湿重。

　　2.3.4形态学观察分组编号并浸入10％福尔马林固定、包埋、切片、HE染色、封片，进行组织学观察。

　　2.3.5统计学处理:

用SPSS13.0进行统计处理,统计学方法为样本均数的T检验。

　　3结果　　3.1小鼠阴道脱落细胞涂片的影响小鼠性周期一般为5d。

灌胃2周检测,除了E组有不同程度延长（5～6d）外，其余各组周期均不相同。

表现为B组与C组周期紊乱，长短不一。

D组与A组周期基本稳定为4～5d。

在灌胃4周检测,A组周期无明显改变、仍表现为4～5d；而其余各组均有明显改变，表现为D组周期延长至6～7d；E组延长至7～8d；C组基本趋于正常，表现为4～5d；B组周期仍不规则。

结果显示，D,E组与A组角化上皮细胞最高值及表层细胞最高值比较差异显著（P0.05），C组与A组比较无显著差异（P0.05）,C,D,E组与B组比较有显著统计学差异（P0.05）。

　　考虑是雌激素水平增高的表现，雌激素的作用是上皮增生、细胞成熟。

其影响程度一般以角化细胞指数为依据。

说明六味地黄汤可以提高雌激素水平，使其角化上皮细胞和表皮细胞增多。

　　3.2给药2周血清雌激素（E2）、孕激素（P）水平及β-内啡肽（EP）含量的变化　　结果见表1。

表1各组E2，P，β-EP含量的比较（略）　　3.3六味地黄汤对小鼠卵巢重量的影响　　结果见表2。

表2各组六味地黄汤与雌激素对小鼠卵巢重量的影响（略）灌胃LW能增加卵巢重量，提示六味地黄汤对致衰小鼠动情周期的紊乱有明显的调节作用。

　　3.4形态学变化　　3.4.1卵巢卵巢大体观察：

B组双侧卵巢缩小，表面明显苍白，点状突起较少。

A，C,D组双侧卵巢色泽较红，表面可见多个白色点状突起。

E组双侧卵巢缩小,但卵巢色泽较红，表面可见白色点状突起。

　　卵巢光镜形态（40×）:

A组及C组可见原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡、成熟卵泡较少，黄体数目较多，有的可见新鲜血黄体，间质少，间质腺少见（见图1）。

B组可见原始卵泡，未见初级卵泡，次级卵泡和成熟卵泡，闭锁卵泡较多，可见较多间质腺及陈旧黄体（见图2）。

D组和E组可见原始卵泡及大量初级卵泡、次级卵泡和接近成熟卵泡，黄体较多，间质少，间质腺体少见（见图3）。

　　3.4.2子宫（40×）A,C组可见正常子宫内膜，内膜厚占子宫壁的2/3，上皮以分泌细胞为主，胞质中有大量分泌泡，固有层有大量子宫腺，腺腔大，腔内有分泌物，结缔组织疏松，其中有丰富的毛细血管及小动、静脉（见图4）。

B组可见内膜薄，占子宫壁的1/3，上皮以柱状细胞为主，胞质中分泌物少，固有层结缔组织分布广泛，子宫腺少，腺腔小（见图5）。

D组和E组可见内膜厚，占子宫壁的1/3～2/3，上皮单层柱状，分泌细胞多，固有层结缔组织疏松，子宫腺多，血管丰富（见图6）。

病理学变化说明六味地黄汤可使卵巢重量增加，色泽较红，促进卵泡发育，具雌激素样作用；并能增加致衰小鼠子宫中腺体及血管数量，使子宫内膜肌层增厚，纤维结缔组织减少，缓解子宫萎缩，表明六味地黄汤和雌激素均有营养子宫及改善其功能的作用。

与文献报道相符［3，4］。

　　4讨论女性生殖功能的内分泌调节主要通过由下丘脑、垂体和卵巢组成的生殖功能调节轴。

下丘脑-垂体-卵巢轴是一个完整而协调的神经内分泌系统，它的每个环节均有其独特的神经内分泌功能，并且互相调节、互相影响。

它的主要生理功能是控制女性发育、正常月经和性功能，因此又称性腺轴。

此外，它还参与机体内环境和物质代谢的调节。

β-EP是女性生殖内分泌话动的重要调节因素，下丘脑含有丰富的β－EP，它对垂体、体温调节中枢、饮食中枢均有重要要的生理作用，同时，研究发现β-EP与下丘脑-垂体-肾上腺轴、下丘脑-垂体-卵巢轴有着密切的关系［1，2］。

而此轴的功能正是中医“肾”所具有的功能，有人证实这就是中医“肾”本质所在。

本实验研究结果表明用D-半乳糖建立衰老模型，小鼠血浆β-EP含量均明显下降，提示β-EP的改变与临床肾阳虚症状的发生及卵巢摘除术有关，至于β-EP下降的原因，可能大量应用D-半乳糖抑制卵巢雌、孕激素的分泌及手术导致雌、孕激素的改变有关［3］。

运用六味地黄汤与西药治疗的模型小鼠血浆β-EP的含量与A组接近。

表明六味地黄汤能使β-EP含量恢复正常，提示β-EP可能参与性腺轴的功能活动，尤其对卵巢功能有促进、调节、改善作用。

　　雌激素和LW对HPO轴的调节作用比较。

二者均能降低垂体LH的水平。

不同：

①雌激素使小鼠动情周期时间延长而LW对动情周期延长不明显；②雌激素使卵巢重量明显减轻，而LW组使卵巢重量明显增加。

和文献报道相符［4，5］证实雌激素和六味地黄汤对致衰小鼠HPO轴紊乱发挥调节上的差异。

雌激素和LW对致衰小鼠HPO轴紊乱的调节作用不同，发挥调节作用的环节或机理也不同,有待进一步研究［4］。

综上所述，六味地黄汤的作用决不是简单的雌激素代替或单因素干预。

而是通过对内分泌系统的功能促进导致卵巢与下丘脑-垂体-性腺功能的恢复，六味地黄汤对卵巢的作用不是单一的、独立的，而是多方面的、综合的。

考虑其可能的机制为①六味地黄汤通过调理HPO的功能，使卵巢形态功能恢复，并具有雌激素样作用，从而发挥对衰老小鼠卵巢、子宫明显的治疗效果及抗衰老作用；②六味地黄汤本身具有雌激素样作用。

【参考文献】　　［1］李洁，杨菁.卵巢早衰动物模型建立的研究进展［J］.生殖与避孕杂志，2006，26（9）：

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（2）：

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