第二章蛋白质结构与功能-沈-06.ppt

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沈勤,南通大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,生物化学与分子生物学,BiochemistryandMolecularBiology,第一章绪论,发展史蛋白质是生命的主要基础物质（20世纪初）物质代谢通路的描绘（20世纪30年代，用同位素示踪技术）生物遗传的遗传物质基础是核酸（19世纪70年代发现核酸）遗传信息传递中心法则的建立（20世纪中期）基因工程技术的发展（1970年发现了限制性内切酶.）基因组研究的发展（1986年提出人类基因组计划,2003完成）细胞信号转导机理的研究（1965年提出第二信使学说.）我国科学工作者的贡献（1965年人工合成胰岛素.）9.与生物化学有关的诺贝尔奖-与其他科学的关系本书的内容,第二章蛋白质的结构与功能,蛋白质的的分子组成蛋白质的分子结构蛋白质结构与功能的关系蛋白质理化性质及其应用,一、什么是蛋白质?

蛋白质（protein）是由许多氨基酸（aminoacids）通过肽键（peptidebond）相连形成的高分子含氮化合物。

二、蛋白质的生物学重要性,1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：

所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。

含量高：

蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。

1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用（激素）3）免疫保护作用（抗原,抗体）4）物质的转运和存储（血红蛋白,载脂蛋白）5）运动与支持作用（肌动和肌球蛋白）6）参与细胞间信息传递（膜蛋白等）,2.蛋白质具有重要的生物学功能,3.氧化供能,蛋白质的分子组成TheMolecularComponentofProtein,第一节,氨基酸,蛋白质,沙土砌成砖,砖块垒成墙,元素,墙组成建筑物,生命,蛋白质的分子组成,组成蛋白质的元素,主要有C（50-55%）、H（6-8%）、O（19-24%）、N（13-19%）和S（0-4%）。

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。

由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：

100克样品中蛋白质的含量（g%）=每克样品含氮克数6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点,一、蛋白质中的氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。

氨基均连接在紧靠羧基的-碳原子上故称-氨基酸。

氨基酸-组成蛋白质的基本单位,-CH3,-SH-H-COOH,-CH2OH-NH2,-CONH2,氨基酸结构通式,非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,氨基酸的分类:

（一）非极性疏水性氨基酸,这类氨基酸的特征是在水中的溶解度较小,当R基团趋于增大时,其疏水作用增强。

疏水作用强的氨基酸常处于蛋白质分子的内部,或在生物膜的疏水环境。

*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:

非极性疏水性氨基酸,

（二）极性中性氨基酸,这类氨基酸的R基团有极性但不能解离，易溶于水,（三）酸性氨基酸,（四）碱性氨基酸,天冬氨酸和谷氨酸,R基团含羧基,解离使分子带负电.,赖氨酸,精氨酸和组氨酸.R基团含氨基,解离分子带正电.,天冬氨酸asparticacidAspD2.97,谷氨酸glutamicacidGluE3.22,赖氨酸lysineLysK9.74,精氨酸arginineArgR10.76,组氨酸histidineHisH7.59,3.酸性氨基酸,4.碱性氨基酸,半胱氨酸（Cys）,胱氨酸,几种特殊氨基酸,脯氨酸（亚氨基酸）,CH,2,CHCOO,-,NH,2,+,CH,2,CH,2,2,-,NH,+,2,2,羟脯氨酸;羟赖氨酸;羟基谷氨酸;这些氨基酸是翻译后修饰而来,体内没有相应的遗传密码,二、肽键与肽,*肽键是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。

（一）肽键（peptidebond）,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。

*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基（residue）。

*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽（oligopeptide），由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽（polypeptide）。

N末端：

多肽链中有自由氨基的一端C末端：

多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,*多肽链（polypeptidechain）是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。

*主链和侧链：

肽链中肽单元是多肽链的骨架或主链基团构成侧链，在骨架上向外伸出,多肽链方向是从端端,肽，肽键,N-端,C-端,氨基酸残基,肽键,蛋白质的分类,蛋白质的功能,酶,转运蛋白,结构蛋白,蛋白质的分子结构TheMolecularStructureofProtein,第二节,一级结构（primarystructure）二级结构（secondarystructure）三级结构（tertiarystructure）四级结构（quaternarystructure）,蛋白质的分子结构包括:

定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。

一、蛋白质的一级结构,主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。

（一）、蛋白质的一级结构测定原则,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。

通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序列,排列出mRNA序列,已知一级结构的蛋白质的数量已相当可观,并以更快的速度增长.Internet上有若干重要的蛋白质数据库:

（Updatedproteindatabases）;例如:

EMBL（europeanmolecularbiologylaboratorydatalibrary）Genbank（geneticsequencedatabank）PIR（proteinIdentificationResourceSequenceDatabase）,二、蛋白质的空间结构,主要的化学键：

氢键,

（一）、蛋白质的二级结构,肽单元:

参与肽键形成的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式（trans）构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元（peptideunit）。

多肽链中主链骨架原子在局部空间的排列分布状况，并不涉及各R侧链的空间排布。

肽单元/肽键平面,肽链的主链原子中CC和CN之间的单键可以旋转，此单键的旋转决定两个肽键平面的相对关系。

肽键平面的相对旋转，使主链可以多种构象出现。

围绕肽键C原子和N原子的三个键角之和均为360。

，说明肽键及其相连的四个原子共处一个平面,肽键的C-N键长，比单键短，比双键长，具有部分双键的性质，不能自由旋转。

肽单元成为肽链折叠的基本单位,-螺旋（-helix）,-转角（-turn）,无规卷曲（randomcoil）,蛋白质二级结构的主要形式,-折叠（-pleatedsheet）,1、主链构象的分子模型,1、-螺旋,特点：

右手螺旋。

氨基酸侧链伸向螺旋外侧。

每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0.54nm。

主链中每个肽键的亚氨基上的H与后面第四个肽键平面的羰基氧构成氢键。

影响-螺旋形成的因素：

2、侧链的大小,1、酸性氨基酸、碱性氨基酸,3、脯氨酸,2、-折叠,特点:

相邻两肽键平面间折叠成锯齿状。

氨基酸残基侧链位于锯齿状结构的上下方。

两条以上肽链或一条肽链的若干肽段的锯齿状结构可平行排列，两条肽链走向可相同（顺向平行），也可相反（反向平行）。

稳定因素是链间肽键的羰基与亚氨基形成的氢键.,3、-转角,-转角:

伸展的肽链形成180回折,即U形转角.由个连续的氨基酸残基构成，稳定作用力是第一个氨基酸的CO与第四个氨基酸的NH形成氢键,4、无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。

二级结构是天然蛋白质在一级结构基础上折叠、盘曲成各自特定的空间结构。

意义：

决定了蛋白质的分子形状、理化性质和生物学活性。

分类：

主链构象和侧链构象。

基序（motif）,在许多蛋白质分子中，可发现二个或多个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个二级结构的集聚体，被称为基序（motif）。

钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,基序的特征性构象是其功能的基础,

（二）、蛋白质的三级结构,指在二级结构、基序、乃至结构域的基础上，由于侧链基团的相互作用，整条肽链进一步折叠和盘曲成球状分子。

即整条肽链中所有原子在三维空间的排布位置。

定义：

肌红蛋白（Mb）,153个氨基酸残基单链分子一个血红素辅基有A至H8段螺旋（占70%）,三级结构的形成和稳定主要依靠R基团之间形成的非共价键或二硫键.,纤连蛋白分子的结构域,

（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域（domain）。

结构域是蛋白质三级结构的基本构件单位.,铰链区,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。

四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。

有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基（subunit）。

血红蛋白的四级结构,总结表,蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein,第三节,一、蛋白质一级结构是空间构象的基础,

（一）、多肽链中氨基酸的组成及排列顺序决定了肽链的折叠方式,胶原蛋白的结构特点,含有大量的甘氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸,脯氨酸和羟脯氨酸不能形成氢键甘氨酸也不利于螺旋的形成,因此胶原蛋白的多肽链呈伸展状，以三股左手螺旋相互缠绕成右手螺旋，是高抗张力强度的结构（见书图）,Anfinsen实验：

124个AA;8个Cys4对二硫键球状蛋白,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,分子伴侣（molecularchaperones）,分子伴侣是蛋白质合成过程中形成空间结构的控制因子。

在新生肽链的折叠、加工和穿膜进入细胞的过程中起关键作用。

通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。

*分子伴侣和ATP的复合物可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。

*分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。

*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。

一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象及功能也相似。

起关键作用的氨基酸残基缺失或被替代，会严重影响空间构象及生理功能。

如：

胰岛素细胞色素,

（二）部分氨基酸残基在蛋白质空间结构中处于关键位置,如：

镰刀形红细胞,例：

镰刀形红细胞贫血,亲水的谷氨酸,疏水的缬氨酸,正常Hb（水溶性）,异常Hb（聚集成丝）,正常人,镰刀形红细胞贫血,红细胞形状改变，相互粘结，脆性增加。

氧结合能力大大降低,溶血性贫血,这种由遗传突变引起的蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。

（一）蛋白质的变性与复性,*蛋白质的变性（denaturation）在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失的过程。

二、蛋白质空间结构与生物学功能,蛋白质变性的本质,破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。

变性蛋白质的特征,变性蛋白质的主要特征是生物学活性丧失.,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性（renaturation）。

蛋白质的复性,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。

此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

（二）、酶原（zymogen）的激活,使无活性的蛋白酶原转变成有活性酶的过程,其实质是除去部分肽段,使酶蛋白空间结构发生变化,暴露或生成催化必须的”活性中心”,使酶具有了催化功能.,例如：

胰蛋白酶原,变构效应（allostericeffect）,蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。

（三）、蛋白质的变构作用,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。

氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。

血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白与血红蛋白的结构,（22）,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。

未结合O2,结合O2,血红蛋白的构象变化与结合氧,*协同效应（cooperativity）,一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。

如果是促进作用则称为正协同效应（positivecooperativity）如果是抑制作用则称为负协同效应（negativecooperativity）,蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：

若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。

蛋白质构象改变导致疾病的机理：

有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。

这类疾病包括：

人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。

蛋白质构象病（proteinconformationdisease）,疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白（prionprotein,PrP）引起的一组人和动物神经退行性病变。

正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。

PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。

第四节,蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein,一、蛋白质的两性电离,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

*蛋白质的等电点（isoelectricpoint,pI）当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。

利用蛋白质的这种性质,可将混合蛋白质通过电泳或离子交换层析方法分离与纯化.,*电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。

这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳（elctrophoresis）。

根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

蛋白质的两性解离与电泳,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。

*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。

*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。

*层析,层析（chromatography）分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。

蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：

利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。

*凝胶过滤（gelfiltration）又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。

目录,透析及超滤法,*透析（dialysis）利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

*超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

二、蛋白质的高分子性质,超速离心,*超速离心法（ultracentrifugation）既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。

*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（sedimentationcoefficient,S）表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。

因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。

三、蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。

*蛋白质胶体稳定的因素1、颗粒表面电荷2、水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链就会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。

变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。

*盐析（saltprecipitation）是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。

丙酮沉淀、,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。

蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。

除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。

*免疫沉淀法：

将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。

利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

四、蛋白质的紫外吸收光谱及呈色反应,由于蛋白质分子中含有共轭双键的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。

蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。

紫外吸收光谱,蛋白质的呈色反应,2、茚三酮反应（ninhydrinreaction）蛋白质经水解后产生的氨基酸也可茚三酮反应生成蓝紫色化合物。

3、双缩脲反应（biuretreaction）蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度和多肽的定量测定。

1、Folin酚试剂反应：

蛋白质中含有酚羟基的氨基酸，在碱性条件下，能与酚试剂反应生成蓝色化合物。

1、名词解释：

肽平面、基序、结构域、变构效应、蛋白质的等电点（PI）、蛋白质的变性2、蛋白质的基本组成单位是什么？

其结构特征是什么？

3、根据氨基酸侧链基团结构，试述氨基酸的分类？

可电离的极性氨基酸有哪些？

4、蛋白质的二级结构有哪些？

试述-螺旋的特点。

5、举例说明蛋白质一级结构是空间结构的基础。

6、列表说明蛋白质各级结构的定义和维系力。

7、什么是分子病？

蛋白质构象病？

复习思考题：

1.蛋白质的元素组成中，氮含量有什么特点？

该特点有什么意义？

2.蛋白质的基本组成单位是什么？

写出其结构通式。

3.所有氨基酸的-碳原子都是不对称碳原子吗？

4.“自然界存在300多种氨基酸和百亿种蛋白质，因此，参加蛋白质合成的氨基酸至少有300种。

”这句话对吗？

为什么？

5.什么叫“编码氨基酸”？

6.非电离的极性侧链氨基酸真的不能电离吗？

7.多肽链中氨基酸残基之间的连接是通过什么化学键？

8.12个氨基酸残基组成的多肽链称为几肽？

9.什么是蛋白质的一级结构？

10.什么是蛋白质的二级结构？

包括哪些结构单元？

11.什么是维系蛋白质二级结构的主要力量？

12.什么是蛋白质的三级结构？

13.维系三级结构的主要作用力是什么？

包括二硫键吗？

14.什么是蛋白质的四级结构？

14.一条蛋白质多肽链能否形成四级结构？

15.一个蛋白质的活性至少需要形成几级结构？

16.两个具有独立功能活性的蛋白质分子，相互缔合以共同完成某一生化功能，此时，能否称这个复合物是由两个亚基组成的？

17.什么是蛋白质变性和变构？

它们有何区别？

18.什么是蛋白质变性的主要表现和结构基础？

19.常见的变性因素有哪些？

是什么作用机制？

有共同点吗？

20.如果条件许可，所有的变性蛋白质都能复性吗？

21.举例说明蛋白质的变构作用与功能的关系。

22.蛋白质高级结构的决定因素是氨基酸的组成和排列顺序吗？

23.能够预测蛋白质的高级结构吗？

24.什么是蛋白质的等电点？

25.蛋白质亲水胶体颗粒的稳定因素是什么？

26.蛋白质有什么光吸收特征？