分析realtimePCR数据.docx

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分析realtimePCR数据

分析rｅal-tｉｍe-PCR数据

————————————————————————————————作者：

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用２-△△Ct法分析rｅaｌ-time　PCR数据

－----联合应用LightCycｌerＤataAｎalysiｓ软件和MSEｘcel

Ｂｙnｅtmｅe,c:

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引用请注明作者。

1、打开存取的数据文件,点击

2、依次点击

，

这是适合SYBＲ　greｅn为染料的选项。

点击ｓtｅp１：

Baseｌine下的“changegraphsetｔiｎgs”小图标

。

取消弹出的CustomizeGraph选项卡中的Ｌogariｔｈmis选项

点击“ＯK”按钮,退出选项卡。

3、点击

下的“changeｇrａphsettings”小图标

取消弹出的Ｃustomizｅ　Graｐh选项卡中的Ｌogaｒｉthmｉs选项

，点击“ＯＫ”按钮，退出选项卡。

4、在

选项卡中拖动红色标记线，选取个条曲线都为直线上升部位。

５、可以在

选项卡中观察是否需选取的是曲线直线上升部分。

观察绿线部分与S型曲线交叉的部分是否为直线。

6、如果确为直线,则左侧的“CrossinｇPoint”值为所需要的Ct值。

７、依次选取下图菜单:

将数据导出为文本文件。

8、打开所保存的文本文件，如图选取

9、将数据粘贴入新建的excｅｌ文件，“CrｏssｉｎｇＰoiｎt”列即是Ｃｔ值,删除“Standaｒｄ”和“ＣalculａtｅdConceｎｔration”列。

10、将目的基因，本例中为“iNOS”的Ct值按标本对应剪切入ｂetａ-acｔin值右侧一列。

分别标记两列数据为“ｂｅta－ａctin”和“iNOS”。

11、设置所有Ct值的单元格格式

12、数字选项卡，分类选择为数值，点击确定。

１3、将E列（目的基因Ct值右侧一列）输入公式“=D4-C4”,求出目的基因与同管beta-actinCｔ值之差，即△Ｃt。

14、向下拉复制公式，将△Ct列数值计算出。

15、在△Ct列右侧一列插入公式“=ＰOWEＲ（2，（0-E4））”,此即目的基因相对betａ-ａctin的相对表达量,即２－△Ct（2的-△Cｔ次方）。

1６、在２-△Ｃt列右侧插入公式“=F4/$F$4”,此列即“２-△△Ct”列,复制公式填满所有标本对应的2－△△Ct空格。

17、至此,２-△△Ct法计算的各标本目的基因的相对表达量完成，2-△△Ct列的数据可以用统计软件进行分析。