牙髓干细胞 研究进展综述.docx

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牙髓干细胞研究进展综述

牙髓干细胞

1牙髓干细胞概念

牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。

2000年Gronthos[1]等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。

这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞（DentalPulpStemCells,DPSCs）。

现在普遍认为牙髓组织中具有形成细胞克隆能力和较强增殖能力的未分化间充质细胞即DPSCs[2]。

2牙源性干细胞

至今，已从人类牙齿相关组织中分离和鉴定出7种干细胞:

（1）牙髓干细胞（dentalpulpstemcell,DPSC）[1]，来自恒牙牙髓；张巍巍等[3]以人牙髓干细胞为种子细胞与PLGA支架材料在体外进行复合培养，表明PLGA有利于于牙髓干细胞的粘附与增值。

Lindroos等[4]得到DPSC与其他间充质源性干细胞具有相似的表面标志物和骨相关性的标志物的结论，支持DPSC在硬组织再生方面的可能性。

从成人第三磨牙牙髓中分离的DPSC在适宜的条件下可诱导分化为有功能活性的神经细胞，并在基因和蛋白水平表达神经组织专有的标志物[5]，为治疗神经系统方面的疾病提供了新的途径。

DPSCs不表达成牙本质细胞特征性蛋白DSP、DMP，则表明DP-SCs尚处于未分化状态[6]。

我国学者通过对根髓和冠髓进行比较时发现：

DPSCs存在于全部牙髓之中,在根髓中的密度更高[7]。

（2）人类脱落乳牙牙髓干细胞（stemcellfromthepulpofhumanexfoliateddeciduousteeth,SHED）,来自儿童脱落乳牙的牙髓;Miura等[8]研究发现，正常脱落的乳牙牙髓中的细胞经培养会表现出成纤维细胞样生长，其增殖率和群体倍增数均比骨髓基质干细胞（BMMSC）、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。

ShenYY等[9]发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志，如RUNX-2、OCN、BSP，表明SHED在体外可以分化为成骨细胞;将SHED与人类牙齿切片复合后，在体外培养或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表达成牙本质细胞分化的标志（DSPP，DMP-1，MEPE）[10]。

一系列实验表明SHED在体内只能诱导宿主细胞分化为成骨细胞[11]，而其自身无法分化为成骨细胞，但在体外培养过程中却可以分化为成骨细胞。

SHED可能还具有参与机体的免疫调节等功能[12]。

李丽文[13]等用不同密度接种培养DPSCs,计算细胞产量、倍增次数,观察细胞形态、检查克隆形成率和钙结节形成能力的方法得到，1.5～3cells/cm2低密度接种培养DPSCs有利于细胞快速扩增,扩增后的细胞保持较高的增殖和分化潜能。

SHED的增殖能力、克隆形成效率和钙结节形成能力均优于DPSCs。

（3）根尖乳头干细胞（stemcellfromtheapicalpapilla,SCAP）[14,15]，来自牙根发育未完成的根尖乳头；Abe等[16]从人年轻第三磨牙根末端分离根尖周牙乳头，并采用酶消化法从中分离出细胞进行研究，结果发现这种细胞在低密度下培养时，能够像其他间充质干细胞一样形成贴壁生长的克隆原细胞聚集，并具有成骨、成牙本质和成脂等多向分化潜能，因而作者将这种细胞命名为SCAP。

SCAP是牙根发育时成牙本质细胞的重要来源，在牙根的形成和发育中起着重要的作用，具有强于DPSCs的群体倍增能力以及增殖率、端粒酶活性和细胞迁移率，是一种极具潜力的成体干细胞[17]。

张富强等[18]以第l代猪牙乳头细胞作为干细胞与β-磷酸三钙支架复合后将其接种于裸鼠皮下，结果成功地构建出牙髓牙本质复合体样结构。

Ikeda等[19]发现，人牙乳头间充质细胞经过培养、增殖和处理可分化为成骨组织，说明人牙乳头间充质细胞可用于骨组织再生。

Shi等[20]还发现根尖牙乳头间充质细胞的牙再生能力强于DPSC，原因是牙乳头中所含的干细胞数量高于成熟的牙髓。

（4）牙周膜干细胞（periodontalligmentstemcell,PDLSC）或牙周膜祖细胞（periodontalligmentprogenitorcell,PDLPC）[21]，均来自牙周膜;Byoung-Moo等[22]用酶消化法将健康成年人的牙周膜组织制成单细胞悬液进行体外培养，通过克隆筛选和磁珠分离得到了具有形成细胞克隆能力和高度增殖能力的细胞，从而提出了牙周膜干细胞（PDLSCs）的概念。

正常情况下，牙周膜细胞可通过增殖和分化使其本身以及与之相连的牙骨质和牙槽骨处于不断更新和改建的状态。

而当受到疾病或外界刺激时，则可通过牙周膜中干细胞的不断增殖和分化使组织再生[23]。

关于PDLSCs的细胞表型，免疫组化结果显示PDLSC表达间充质干细胞的标志物，而这些标记物是鉴定PDLSC的基础[24]。

PDLSC和PDLP则偏重牙周组织的重建。

在临床上主要是利用干细胞的分化和再生潜力促进组织愈合和再生[25,26]。

（5）人类智齿牙滤泡祖细胞（precusorcellfromhumandentalfollicleofwisdomteeth,PC），或称为牙囊干细胞（dentalfolliclestemcell,DFSC）[27],来自智齿牙囊；牙囊（dentalfollicle，DF）是包绕发育牙齿的疏松结缔组织。

Honda等[28]从小牛牙根形成阶段的恒切牙牙胚中分离出牛DF细胞，进行了一系列试验，证明DF细胞中含有牙周膜细胞及牙骨质细胞的前体细胞；目前研究发现在口腔的不同组织中均分离出干细胞。

（6）牙槽骨干细胞（alveolarboneproperderivedstemcell,ABPSC）[29],来自牙槽骨骨髓。

（7）牙龈/口腔黏膜干细胞（ginginval/oralmucosastemcell,OMSC）[30,31]，来自牙龈黏膜下结缔组织或来自牙胚的间充质干细胞（mesenchymalstemcellfromtoothgerm）[32]，其来源属于牙髓干细胞；另外还有根尖牙囊干细胞（periapicalfolliclestemcell,PAFSC）[33]，属于上述的SCAP。

牙源性干细胞具有间充质干细胞的功能特性和多向分化能力，并表达间充质干细胞的表面标志物如CD44、CD73、CD105，但不表达CD34和CD45[34]。

不同来源的牙源干细胞如图1所示。

OMSC:

牙龈/口腔黏膜干细胞;ABPSC:

牙槽骨干细胞;DPSC:

牙髓干细胞;SHED:

人类脱落乳牙牙髓干细胞;DFSC:

牙囊干细胞;SCAP:

根尖乳头干细胞;PDLSC:

牙周膜干细胞。

图1不同牙源干细胞的来源组织部位

3牙髓干细胞的分离培养

3.1仪器和材料

仪器：

超净工作台。

倒置相差显微镜及照相系统，流式细胞分析仪，细胞筛网，JEM-2000EX透射电镜。

平底24孔、96孔塑料培养板。

二氧化碳恒温培养箱，细胞培养瓶及培养板，高速离心机，细胞记数板，可见光分光光度计，酶联免疫检测仪。

材料：

现在国内实验中采用的普遍的牙髓细胞来源于临床上因阻生而完整拔除的下颌第三磨牙（获得患者许可），要求牙齿健康，无牙体牙周疾病，患者年龄12~25岁[35]。

人源乳牙：

6~10岁健康儿童无牙体牙髓疾病的滞留乳牙；鼠源性牙髓细胞：

5周龄大鼠，雄性。

5周龄裸鼠，雌性；犬源性牙髓细胞：

5~6个月龄的比格犬的健康年轻恒牙；4~6月龄小型猪乳下切牙等牙齿。

3.2细胞分离培养

培养牙髓干细胞方法有酶联合消化法、组织块培养法和组织块酶消化法。

分离牙髓干细胞方法有三维悬滴法和免疫磁珠分选法。

3.2.1酶联合消化法

以2000年，按Gronthos等[1]的酶联合消化方法,将人乳牙牙髓组织在完全培养液浸润下剪碎，3g/LcollagenasetypeI、4g/Ldispase按1∶1比例混合，于37℃水浴中消化乳牙牙髓组织1h，离心弃上清液，沉淀用培养液充分混匀，反复吹打离散细胞团块，经70μm的细胞筛网过滤获得单细胞悬浮液，加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养液，置入3.5cm培养皿内37℃恒温培养箱标准条件下培养。

别利克孜·卡德尔[36]等人在2013年对酶联合消化法进行了改良。

将人乳牙牙髓组织标本块浸入同样的消化液中，仅在37℃水浴中消化15min左右，待组织块呈絮状加入完全生长液终止消化，300g离心力离心5min，弃去上清液，将组织团块均匀铺入3.5cm的培养皿中，在各组织块处分别滴加50-100μL完全生长液，置入37℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育，两三天更换完全生长液，待组织周边有较多的细胞爬出后，挑弃组织块，补足完全生长液继续孵育。

当大多数克隆的细胞汇合至80%-90%时，吸弃培养液，进行传代扩增培养。

3.2.2组织块培养法

新鲜采集的牙髓，在生物安全柜中用PBS洗3遍，置于6cm培养皿中，加入少量完全DMEM/F12培养基（其中含20%FBS、1%L-Glutamine、1%NEAA及1%双抗）浸润牙髓组织，用无菌手术剪将其剪碎，盖玻片将组织块固定在培养皿中，37℃、5﹪CO2培养。

48h换液，此后每3、4d更换1次培养基。

培养约10~14d会有细胞从组织块中爬出，细胞达到80﹪~90﹪汇合后，用TrypLE在37℃消化，按1:

3比例传代[37]。

3.2.3组织块酶消化法

（1）牙拔除后用75%酒精擦拭牙体表面消毒，再用含青霉素、链霉素的PBS浸洗牙2次备用；

（2）原代细胞培养：

无菌条件下劈开牙齿，取出牙髓，切除根尖部约2mm牙髓组织，剪成大小约1mm×1mm×1mm的组织块，用4%Ⅰ型胶原酶消化45min，终止消化，1000r/min离心5min，弃上清，所得组织用含20%胎牛血清的α-MEM培养液重悬后接种于35mm培养皿，于37℃、5%CO2恒温孵箱内培养，待细胞长至80%汇合率时，胰酶消化传代．

（3）有限稀释法克隆纯化人牙髓干细胞：

取对数生长期的原代细胞，调整细胞密度，把细胞稀释到＜10个/mL，以100μl/孔接种于96孔培养板内，培养24h后镜检，挑出单个细胞的孔，继续培养；待单克隆面积至孔底50%以上时，取多个克隆培养细胞混合扩大培养[38]。

3.2.4三维培养法

参考并改进Gronthos[1]的方法，从健康人体的第三前磨牙中获取牙髓，用酶消化法和酶解组织块法进行原代DPSCs培养并常规传代。

人DPSCs的三维培养法：

将处理好的0.25gCytodex3微载体与50ml含1×105/ml第四代DPSCs的新鲜DMEM/F12（含15%FBS）混合均匀，载入经高压灭菌的HARV中，此时，培养基充满整个容器，无气泡，调整转速，使微载体不与器壁碰撞，不在中心聚集。

整个装置放入37℃，5%CO2的培养箱中。

常规换液[39]。

3.2.5免疫磁珠分选法

原代细胞收集方法：

按照Gronthos[1]的方法，在体外进行原代培养，获得细胞放入37℃，5%CO2培养箱中培养3d后弃去未贴壁细胞，PBS清洗每3d换液一次。

细胞生长达80%融合时1：

3传代。

取生长状态良好的第3代乳牙牙髓细胞1×108，以含1%胎牛血清的PBS重悬，加入STRO-1抗体，4℃孵育60min，每隔10min轻振，防止细胞沉淀。

然后用含1%的胎牛血清的PBS清洗3次，去除残留抗体；细胞再次重悬通过30μm的滤网获得单细胞悬液，按说明加入相应剂量的磁珠混匀，4℃孵育15min，加入10ml缓冲液以300g离心力离心10min，完全去除上清;加500μl缓冲液混匀细胞团；将分选柱置磁力架上，用500μl缓冲液预先润湿分选柱，缓冲液快要滴完时将细胞悬液加入到分选柱内不要产生气泡，待细胞悬液将要滴完时加入500μl缓冲液重复3次，收集从分选柱流出的乳牙牙髓细胞；从分选器上取下分选柱加入1ml缓冲液用分选柱配套的推子快速推下，将收集到的SHED再次经过分选柱重复筛选一次。

加入含15%的胎牛血清的全培4ml置37℃，5%CO2培养箱中培养[40]。

4牙髓干细胞在口腔科学的用途

4.1牙本质/牙髓组织的修复和再生

Couble等[41]培养发育早期的牙髓，发现可分化形成成牙本质细胞。

研究可以得出结论牙髓干细胞在成牙本质细胞遭受损失后，会分化为成牙本质细胞，成牙本质细胞分泌牙本质以维持牙本质的完整。

DPSC、SHED和SCAP都具有一定多向分化潜能,其中包括形成牙本质/牙髓样复合体[42]。

目前牙本质/牙髓组织修复和再生方法主要有以下几种。

（1）将牙髓干细胞直接植入牙髓腔。

（2）将牙髓干细胞与支架结合植入牙髓腔。

（3）将牙髓干细胞和支架材料先植入动物体内,再取出植入人体牙髓腔。

（4）将牙髓干细胞和支架材料种植在人类牙齿组织块上,再植入动物体内。

4.2牙体牙冠的再生

Yu等[35]将DPSC和成年鼠的根尖牙蕾细胞（apicalbudcells）结合,在植入活体后形成典型的牙冠样结构，其中包括成釉细胞层、牙釉质、牙本质、前期牙本质和成牙本质的细胞层，Ikeda等[43]报导从小鼠牙齿发育的杯状期分离出成牙上皮细胞，将其与DPSC结合在胶原凝胶上进行体外培养，形成的牙胚植入小鼠颌骨内，结果发现此生物合成牙与牙槽骨结合良好，并具有天然牙齿的功能。

DPSCs的回植的研究，Zhang等[44]将体外培养的人第三磨牙DPSCs与海绵胶原、多孔陶瓷和纤维钛网3种三维支架复合，并分为2组，第1组在诱导成骨的培养基中培养4周，第2组植入裸鼠皮下6周。

结果表明，在第1组的3种支架材料中均可见丰富的细胞外基质矿化沉积,并有DSPP的表达,第2组均可见DSPP阳性的组织形成,但是此种组织与牙本质不同,更像结缔组织，而且仅在多孔陶瓷材料上有细胞外基质矿化。

在口腔医学上，有望填补缺损的牙齿。

4.4颅骨、颌骨及面骨的损伤修复研究

2009年，d’Aquino等[45]用DPSC成功培养出骨组织碎片，将此碎片植入动物可产生有血管供应的板状骨。

他们还报道了用DPSC治疗下颌骨缺损的临床研究结果。

他们先拔取患者的上颌智齿，分离培养自体DPSC，再将其植入明胶载体产生DPSC复合体。

然后拔除双侧下颌智齿，一侧置入DPSC复合体，另侧作对照。

结果发现，术后60天，实验侧第二磨牙皮质骨垂直增生至牙釉与本骨质交界。

术后3个月，新生骨组织、细胞因子、BMP-2和血管内皮生长因子（VEGF）的表达在实验侧显著高于对侧。

术后1年,实验侧完全稳定骨化,达到第二磨牙骨质再生的目的。

4.5口腔科学其他方面应用的研究

（1）牙髓干细胞与钛合金种植牙结合，Mangano等[46]对DPSC与钛合金表面的结合部位进行基因表达的研究，结果发现，DPSC能很快分化为成骨细胞和内皮细胞沿合金表面形成骨组织，并表达相应的特异蛋白标志物。

（2）牙源干细胞与透明质酸HA涂面的种植牙结合，Yamada等[47]报道，当DPSC或SHED与PRP合用，所形成的骨质能与涂有透明质酸（hyaluronicacid,HA）的种植牙根更好地结合。

5牙髓干细胞在其他疾病中的用途

5.1牙髓干细胞用于脑血管意外损伤的修复研究

Yang等[48]分离培养了人类第三磨牙的DPSC，并诱导其转化为神经干细胞（NSC）。

将此NSC细胞移植到大脑中动脉栓塞大鼠模型，结果发现，治疗组的神经性障碍明显改善。

Sugiyama等[49]从猪牙髓衍生取得DPSC细胞（CD31–/CD146–）。

将Sprague-Dawley大鼠进行大脑中动脉栓塞，24小时后将DPSC细胞（CD31–/CD146–）注入大脑。

结果发现,DPSC细胞体内分化为NSC及神经细胞，表达doublecortin的神经细胞数上升2倍；表达NeuN的神经细胞增长8倍；在缺血的脑部VEGF的水平比正常大脑提高28倍。

此结果表明，来自牙髓的DPSC细胞（CD31–/CD146–）能够促进移植的和内源性的神经干细胞分化。

5.2牙髓干细胞用于脊髓损伤的修复研究

Nosrat等[50]研究表明，神经元可以从牙髓的干细胞诱导分化产生。

随后，许多研究进一步表明，DPSC具有转化为神经元的能力。

Huang等[51]成功地将DPSC移植到小鼠海马区，并在体内分化为神经细胞，为牙源性干细胞修复中枢神经系统疾病提供了证据。

Sakai等[52]移植DPSC和SHED到脊髓全断大鼠，结果发现DPSC和SHED的表面标志、基因表达和分泌的细胞因子发生明显改变。

移植DPSC和SHED后，脊髓全断大鼠后肢的运动功能明显恢复，神经轴突明显再生。

DPSC可能通过三个方面促进脊髓损伤修复：

（1）抑制损伤导致的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的凋亡；

（2）直接抑制多种阻碍轴突生长的抑制因子如硫酸软骨素、蛋白聚糖和髓磷脂等相关糖蛋白；（3）分化为成熟的少突胶质细胞促进神经轴索生长[53]。

5.3牙髓干细胞用于帕金森氏病的修复研究

Nesti等[54]将DPSC与中脑神经组织细胞联合培养后移植到体外帕金森氏病（Parkinson’sdisease）模型上，发现DPSC能提高大脑神经细胞对MPP＋或鱼藤酮所导致神经毒性的保护作用。

Ibarratxe等[55]报道了牙髓干细胞用于帕金森氏病修复治疗具有许多优越性：

牙源性干细胞比较容易得到自体细胞，可避免免疫排斥和炎症反应；DPSC本身具有神经细胞及胶质细胞标记物的表达；DPSC具有类似神经元的电活动如表达神经细胞的受体，并产生动作电位；DPSC可在宿主的神经组织内生长存活。

5.4牙髓干细胞用于心肌梗死、糖尿病和免疫缺陷性疾病的修复研究

Gandia等[56]用冠状动脉结扎法在大鼠裸鼠造成急性心肌梗死的模型,并将DPSC注入心肌内。

4周之后显示心肌功能改善,梗死区缩小，新血管形成增加。

他们认为，DPSC可以作为急性心肌梗死细胞疗法的干细胞来源。

Govindasamy等[57]报道将DPSC分化为胰岛样细胞聚集体（islet-likecellaggregates,ICA）,并发现其表达相应的转录因子如CPP、Pdx1、Pdx4、Pdx6、Ngn和Isl1等,从而起到调节血糖治疗糖尿病的作用。

研究表明,MSC对很多自身免疫疾病（系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症等）有一定的疗效，可能是通过免疫调节发挥作用[58,59]。

6牙髓干细胞的研究进展

6.1国外牙髓干细胞研究进展

1999年，Harada等[60]发现在小鼠切牙颈环星网状层中心的上皮细胞层存在干细胞,维持小鼠切牙终生不断萌出。

2000年，GronthosS等[1]人发现人牙髓组织中同样存在成体干细胞，首先牙髓干细胞提出的概念。

2002年，Young等[61]分离猪第三磨牙牙胚，制备单细胞悬液，并接种到可降解的聚合物支架上，植入大鼠肠系膜内生长20~30周，可成功地构建出牙齿结构，包括含成熟牙釉质的釉器官、牙本质、成牙本质细胞、髓室、上皮根鞘和成牙骨质细胞，证实在猪第三磨牙有上皮和间充质干细胞的存在。

Miura等[7]从人脱落乳牙中分离到干细胞,其具有较DPSCs和BMSCs更高的增生能力和克隆形成能力，并可以分化成神经细胞、脂肪细胞和成牙本质细胞，回植小鼠体内后可形成骨和牙本质，注射入小鼠脑内生存可超10d，并可表达神经标记物神经微丝（neurofilament,NFM）。

他们把这种干细胞命名为脱落乳牙干细胞（stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth,SHED）。

2004年，Norsat等[52]发现牙髓细胞能产生多种神经营养因子，并为多巴胺能神经元提供营养支持，与三叉神经元复合培养可刺激轴突生长，而且DPSCs可以在体外分化为神经元,证明DPSCs具有多相分化潜能。

2006年，IoharaK等[62]发现DPSCs表达STRO-1、CD146、CD34以及c-kit这几种间充质干细胞表面抗原。

在成人牙髓组织中，STRO-1主要定位于血管壁和神经束膜，CD146定位于牙髓的微血管，而STRO-1和CD146的共表达仅限于血管外壁，因此推测DPSCs来源于血管周的微环境。

2008年，ProsperF等[63]表示应用DPSCs于各种组织的修复和疾病治疗中已成为可能。

2009年，Monterio等人[64]发现牙髓干细胞向中胚层细胞分化，诱导分化为成牙本质细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞等并在适当条件下具有向内胚层细胞分化的潜力。

2010年，Sakai等人[12]发现DPSC和SCAP可生成牙本质-牙髓复合体，而SHED生成矿化组织而非牙本质-牙髓复合体。

将SHED接种到牙片支架上并将其植入免疫缺陷小鼠皮下培养，经四环素染色和显微镜观察发现，SHED生成带小管的牙本质组织。

2011年，研究人员发现牙本质再生需要有活性的牙髓组织，牙髓组织的再生需要有血液的供养[65]。

利用干细胞进行组织再生则需要生成有效的血管网络，为移植的细胞提供氧气和营养，保证细胞在参与组织再生时的需要[66]。

在血管生成和血管再造的过程中，在明胶微球支架中加入VEGF并将其接种DPSC后将其植入到空的根管内，再将其植入到切除根尖的小鼠牙槽根管中培养4～8周，空的根管内形成了带血管的牙髓组织[67]。

2013年，MeadB等[68]人有证据表明牙髓干细胞可能是一个更合适的细胞类型比视网膜治疗骨髓间充质干细胞。

雪旺细胞在维持外周神经功能程中发挥重要作用。

2014年，Martens等[69]发现损伤后神经再生修复过，人DPSCs经诱导分化，可以分化为雪旺细胞。

具有髓鞘形成能力。

6.2国内牙髓干细胞的研究进展

1998年，田卫东等人[70]应用完整的胚胎上皮和分离的牙间充质细胞或其他组织的MSC构建的再生牙有正常的牙冠形态，这一点要优于应用成体牙细胞。

2004年，贺慧霞等人[39]透射电镜下，DPSCs的核呈卵圆形，约占胞体体积的80%~90%，核仁大而明显，常染色质居中，异染色质少，分布于核周。

胞浆很少，核浆比例大。

细胞器较少，核糖体丰富。

这些形态特征体现了DPSCs的未分化或低分化状态。

2005年，杨雪超等人[71]成功国内学者也成功的诱导了DPSCs向成牙本质细胞、肌管样细胞以及脂肪细胞的分化。

2007年，刘彩霞等人[72]将其与羟磷灰石-磷酸三钙支架复合并将其植入免疫缺陷小鼠体内，形成了牙骨质和牙周膜样的新生组织。

2008年，张富强等人[18]以第l代猪牙乳头细胞作为干细胞与β-磷酸三钙支架复合后将其接种于裸鼠皮下，8周后行组织学、牙本质涎蛋白免疫组化和透射电镜检测，结果成功地构建出牙髓牙本质复合体样结构。

2010年，在成骨诱导分化实验显示:

体外矿化诱导DPSCs40d后，骨涎蛋白（bonesialoprotein，BSP）和骨钙素（osteocalcin，OCN）免疫荧光染色阳性，可见骨小梁结构；随后将此骨样组织回植入免疫缺陷小鼠背部皮下，4周后形成发育良好的板状骨，表明DPSCs在特定矿化条件下有成骨能力[2]。

目前最常用的培养骨髓间充质干细胞的方法是密度梯度离心法。

此方法培养的骨髓间充质干细胞纯度较高，培养周期短，采用此法分离培养骨髓间充质干细胞。

牙髓干细胞常用的培养方法是免疫磁珠分选法[73]。

2011年，霍永标的文章看出台湾地区在内的多家牙齿细胞库的建立更是使得牙髓干细胞的研究从实验室研究走向临床应用[74]。

2012年，赵珊梅的实验结果证实了[75]报道中经过抗生素处理的炎症牙髓干细胞的原代培养成功率（80%）显著高于未经过抗生素处理组的成功率（30%）。

因此，多种防止细菌污染的措施被应用到口内直接拔髓及原代培养操作过程中。

在成脂分化中，多采用成脂诱导