柠檬酸裂解酶 甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析.docx

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柠檬酸裂解酶甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

柠檬酸裂解酶甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

作物学报ACTAAGRONOMICASINICAxx,38:

2024−2033:

///zwxb/

ISSN0496-3490;CODENTSHPA9

E-mail:

xbzw@

DOI:

/

甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

李长宁1,2农倩1谭秦亮1ManojKumarSRIVASTAVA2杨丽涛1,2,*李杨瑞1,2,*

1

广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁530005;2中国农业科学院甘蔗研究中心/农业部广

西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西作物遗传改良生物技术重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室,广西南宁530007

摘要:

ATP柠檬酸裂解酶为细胞质中乙酰辅酶A合成途径的关键调控酶,在生物体正常生长发育中有重要作用。

本研究通过Race和电子克隆技术获得编码甘蔗ACL蛋白2个亚基的基因SoACLA-1和SoACLB-1,其编码框长度分别为1272bp和1827bp,编码423个和608个氨基酸,推测的氨基酸序列与其他物种具有高度相似性,都优先与禾本科植物聚于同一进化分支。

2个基因在ATP-grasp功能域、柠檬酸结合位点、组氨酸磷酸化位点和ATP结合、CoA结合、磷酸化区域等,序列高度保守。

实时荧光定量PCR结果表明,2个基因均受外源AB

A、水分胁迫、水分胁迫加ABA处理诱导表达,且叶中表达量显著高于根系,其中又以水分胁迫处理下的表达量最高,2个基因表现出协同表达模式。

SoACLA-1和SoACLB-1的表达与AB

A、ROS含量具有相关性,说明它们可能参与了ABA调控的植物对逆境胁迫反应的代谢过程。

关键词:

甘蔗;ATP柠檬酸裂解酶;克隆;脱落酸;表达

CloningandExpressionAnalysisofATP-CitrateLyaseGenesfromSugarcane

LIChang-Ning1,2,NONGQian1,TANQin-Liang1,ManojKumarSRIVASTAVA2,YANGLi-Tao1,2,*,andLIYang-Rui1,2,*

1

AgriculturalCollege/StateKeyLaboratoryofConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-Bioresources,GuangxiUniversity,Nanning530005,

China;2SugarcaneResearchCenter,ChineseAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofSugarcaneBiotechnologyandGeicImprove-ment,MinistryofAgriculture/GuangxiCropGeicImprovementandBiotechnologyLaboratory/GuangxiKeyLaboratoryofSugar-caneGeicImprovement,Nanning530007,China

Abstract:

Acetyl-CoAplaysanimportantroleinthecytosolofplantcellsforthesynthesisofadiversesetofphytochemicals,andthecytosolicacetyl-CoAisfromthereactionofcitrateandCoAcatalyzedbyATP-citratelyasecoupledwiththehydrolysisofATP、Inthisstudy,twogenesencodingtwodistinctsubunitsofACLwereidentifiedfromsugarcanebyRACEandinsilicocloningtechnigues,namedSoACLA-1andSoACLB-1,whichcontained1272and1827bpopenreadingframes,andencoded423and608aminoacids,respectively、SequenceanalysisindicatedthatbothaminoacidssequencesshowedhighhomologywithACLsfromotherspeciesandwerecloseclusteredwithACLsfromgramineousplantsinthephylogeictreeconstructedbysoftwareusingaNeighborhood-Joiningbootstrapmethod、Bothsequencesshowedhighconserva-tionintheATP-graspdomain,citratebindingsite,activebindingsiteofhistidinephosphorylatedbyATP,potentialATP-binding,phosphorylatedsiteandCoA-bindingsitewhenparedwithACLsfromotherspecies、Quantitativereal-timePCRresultsindi-catedthatSoACLA-1andSoACLB-1werebothinducedbythetreatmentofcontrol+ABA,waterstress,waterstress+ABA,andtheirexpressionlevelswerehigherinleavesthaninroots,withthehighestexpresslevelinwaterstresstreatment,SoACLA-1andSoACLB-1showedasynergeticexpressionpattern、TheexpressionofSoACLA-1andSoACLB-1wasclosecorrelatedwiththeABAandROScontents,indicatingthatACLmaybeinvolvedinstressresponsivemetabolicprocesstriggeredbyABAinplants、Keywords:

Sugarcane;ATP-citratelyase;Cloning;ABA;Expression

本研究由广西自然科学基金创新团队项目,国家国际合作项目,广西科技攻关项目和广西农业科学院创新团队项目资助。

*

通讯作者:

李杨瑞,E-mail:

liyr@;杨丽涛,E-mail:

litaoyang61@

第一作者联系方式:

E-mail:

lcn560@

Received:

xx-04-27;Accepted:

xx-07-05;Publishedonline:

xx-09-

10、URL:

:

///kcms/detail/

第11期

李长宁等:

甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析2025

乙酰辅酶A作为关键的代谢中间产物联结着至少5个亚细胞单位中的生理生化进程,在生物体正常生长发育中扮演着重要角色。

质体中,acetyl-CoA为脂肪酸[1]和硫代葡萄糖苷[2]等的合成前体;线粒体中acetyl-CoA与三羧酸循环偶联,合成ATP和氨基酸骨架;微体中acetyl-CoA主要来自脂肪酸β-氧化,可作为能量来源;细胞核和胞质中acetyl-CoA作为乙酰基供体参与组蛋白和转录因子甲基化修饰,在真核生物的染色体结构调节和基因表达调控中发挥重要作用[3-5]。

此外,胞质acetyl-CoA可通过羧化、缩合和乙酰化作用,参与众多物质合成,调节生物体各项生理活动[6-8]。

有报道证实,胞质acetyl-CoA对玉蜀黍赤霉菌有性和无性世代的转换有影响[9]。

由于acetyl-CoA不能自由通过细胞质膜,因此,它的产生和积累在各细胞器中独立进行,但又不能完全割裂[10-12],如胞质代谢中,ATP柠檬酸裂解酶催化柠檬酸和CoA生成草酰乙酸和acetyl-CoA,而柠檬酸为线粒体内TCA循环中间产物且通过线粒体膜上的载体向胞质中转运供应,ACL活性强弱对胞质acetyl-CoA积累至关重要。

研究表明,ACL有同聚肽和杂聚肽2种结构,在一些菌类和哺乳动物中ACL由单个基因编码,其余生物体中则分别由不同基因编码的A和B2个亚基组成[13]。

拟南芥AtACLA由AtACLA-

1、AtACLA-2和AtACLA-3基因编码,且都位于第1染色体上;AtACLB则由AtACLB-1和AtACLB-2基因编码,前者位于第3而后者位于第5染色体上[13]。

拟南芥ACL是一种A4B4结构的异源八聚体蛋白,AtACLA和AtACLB分子量约为45kD和65kD,全蛋白分子量约为500kD,研究证实,通过ACL催化生成,是胞质中acetyl-CoA来源唯一途径[13]。

拟南芥AtACLA-1反向遗传转化研究表明,其活性的抑制可导致植株微型化、细胞体积缩小、质体畸形、叶片表面蜡质沉积和脂肪酸含量减少,淀粉、花青素超量积累,ACLA和ACLB表达量和ACL活性降低,表型变化程度与ACL抑制程度正相关,并引起相关胁迫基因的响应[14],这表明ACL对植物正常生长发育必不可少,并在应对逆境胁迫反应中发挥重要作用。

近年来,对植物ACL的研究,集中在其活性与油脂积累的关系[15-17],而对植物激素、逆境胁迫条

件下该基因的应答研究鲜见报道。

作为重要的糖料作物,对甘蔗代谢调控的研究越来越多[18-20],然而对甘蔗ACL基因目前尚无报道,本研究拟克隆编码甘蔗ACL两个亚基的基因,并探索其的进化保守性和表达特性,为进一步研究该酶的调控机制提供依据。

1材料与方法

试验材料与处理

选用甘蔗品种桂糖21,将蔗种以单芽方式种植于泥沙混合培养基质上,3周后,选取长势一致植株移栽至含Hoagland营养液的桶中,桶规格约为21cm×19cm,每桶盛5L营养液且每3d更换一次,为防止根系缺氧,使用充气泵每隔1h充气一次,每次10min,待长势恢复后进行处理,分别设:

对照;对照+ABA;水分胁迫[waterstress,WS,营养液中含25%的PEG-6000];水分胁迫+ABA。

喷施至叶面湿透无滴水,在处理后的0、3、6、9、12和24h采集叶样和幼嫩根系分装速冻于液氮中,于–80℃冰箱中保存用于后续试验。

测定项目与方法

采用酶联免疫吸附法测定甘蔗内源脱落酸含量,试剂盒购于中国农业大学,按其说明书操作;使用羟胺氧化法测定超氧阴离子自由基

产生速率[21]

;使用Trizol试剂提取甘蔗总RNA;使用Formentas和Clontech公司试剂盒合成cDNA

第一链,产物分别用于实时荧光定量PCR和基因全长获取。

SoACL扩增以NCBI中与拟南芥AtACLA-1相似性极高的甘蔗EST序列为模板,设计引物F:

5′-GGCTCCAATCACGACCTTC-3′和R:

5′-TGCTGCCCAACCTTTCTG-3′,分别结合RACE试剂盒提供的接头引物UPM,通过3′-及5′-RACEPCR反应以获得SoACLA-1的3′-和5′-末端序列。

反应体系含2×GoldStarBestMasterMix25μL、cDNA2μL、10μmolL–1正反向引物各1μL、以ddH2O补齐50μL。

反应程序为95℃预变性10min;95℃变性30s;60℃退火30s;72℃延伸2min,36个循环;72℃最后延伸10min。

3′-和5′-RACE产物经拼接后,在其编码框

2026

作物学报

第38卷

首尾设计引物F:

5′-ATGGCGCGCAAGAAGATCC-3′和R:

5′-TTATGCTGCAGCCATGATGC-3′进行扩增以验证序列准确性。

采用电子克隆方法获得甘蔗SoACLB-1基因完整编码框,重叠群判断标准为序列间重叠碱基数大于40且相似性大于95%。

拼接所用EST为CA069900、CA0716

59、CA073108、CA0758

67、CA0784

29、CA0789

59、CA0867

17、CA0983

87、CA0989

82、CA1095

15、CA1219

69、CA1556

78、CA1559

67、CA156105、CA1563

46、CA1563

71、CA1570

78、CA1572

61、CA170609、CA173000、CA1732

86、CA1754

36、CA1774

70、CA1788

22、CA1872

40、CA1899

17、CA1954

83、CA1998

62、CA2028

64、CA2050

30、CA2132

50、CA2143

46、CA2199

29、CA2207

89、CA2238

21、CA231005、CA2341

64、CA2383

14、CA2414

10、CA2436

68、CA248206、CA2518

12、CA253200、CA2562

49、CA2587

55、CA2594

45、CA2626

45、CA2690

73、CA284753和CA289719,拼接完毕后,在其首尾处设计引物F:

5′-ATGGCAACTGGCCAACTTTTT-3′和R:

5′-TCACTTGGTGTACAGGACATCCTC-3′进行扩增验证序列准确性,反应体系和程序同上。

回收、纯化所有PCR产物,连接pMD18-T载体后转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒DNA验证后,由生工生物工程公司测序。

生物信息学分析选用BlastP搜索蛋白质相似性;由ExPASy分析蛋白质基本理化性质;由程序分析系统进化树;使用ClustalW2程序进行蛋白质多序列比对并通过Espript进行渲染;通过NCBICDD数据库分析蛋白质保守结构域。

实时荧光定量PCR以甘蔗GAPDH基因为内参,其引物序列为F:

5′-TGGTGCTGACTATGTCGTGGA-3′,R:

5′-CATGGGTGCAT

CTTTGCTTG-3′;SoACLA-1引物为上述3′-和5′-RACEPCR引物组合;SoACLB-1扩增引物为F:

5′-CCCGTTTCGGTGGAGCAAT-3′,R:

5′-GGCGTGAGGTTCCTGTCA-3′。

反应体系含10μL2×All-in-OneqPCRMix、2μLcDN

A、4μmolL–1的正反向引物各1μL、6μL双蒸水。

程序为95℃预变性10min;95℃变性10s,60℃退火20s,72℃延伸20s,40个循环。

反应完成后进行融解曲线检验,采用2−ΔΔCt法计算相对表达量。

相同处理时间内的指标用DPS软件以Duncan’s新复极差法检验各处理平均数差异显著性。

2结果与分析

SoACL基因克隆

测序结果表明,SoACLA-1基因3′-和5′-RACE产物长度分别为1223bp和533bp,除去接头引物及重叠序列后,SoACLA-1全长cDNA为1594bp,其5′末端包含起始密码子且符合Kozak法则,3′末端具典型poly加尾信号,包含长度为1272bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,5′和3′端非翻译区长度为95bp和227bp,将该基因在NCBI上注册,获得登录号JQ292843。

SoACLB-1开放阅读框为1827bp,经测序与电子克隆获得的SoACLB-1序列相比,二者长度一致,编码的608个氨基酸100%吻合,证实电子克隆结果真实可

图1甘蔗SoACL基因扩增产物电泳图

ElectrophoresisresultsoflifiedproductsofSoACLgenes

A~B:

SoACLA-13′-和5′-RACE扩增结果;C~D:

SoACLA-1和SoACLB-1编码框扩增结果。

AandB:

3′-and5′-RACElifiedresultsofSoACLA-1;CandD:

openreadingframelifiedresultsofSoACLA-1andSoACLB-

1、

第11期

李长宁等:

甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析2027

靠,该基因经注册获得登录号为JQ923438。

别为和。

疏水性预测发现,SoACLA-1第338位甘氨酸疏水性最强,分值最低的是第7和第9位的精氨酸和络氨酸;SoACLB-1第406位的半胱氨酸疏水性最强,最弱的是第495位的天冬酰胺。

2

种蛋白平均亲水系数分别为–和–。

ACL多序列比对结果表明,在ATP-grasp功能域保守氨基酸残基、柠檬酸结合位点和组氨酸磷酸化位点,

蛋白序列生物信息学分析

BlastP比对结果表明,SoACLA-1和SoACLB-1与AtACLA-1和AtACLB-1的一致性/相似性分别为81%/91%和93%/98%,均分别高于与拟南芥其他家族成员相比的百分数。

Expasy工具分析显示,2种蛋白预测分子量分别为kD和kD,等电点分

图2ACL蛋白序列多重比对

Fig、2SequencealignmentofACLproteins

利用ClustalW2进行氨基酸序列比对,以PDB数据库HsACL为二级结构模板通过ESPript渲染,深色背景表示一致序列。

下标箭头、菱形和三角形的氨基酸分别为ATP-grasp功能域保守残基、柠檬酸结合位点和组氨酸磷酸化位点,下标i、ii、iii的下画线区域分别代表ATP结合、磷酸化和CoA结合区域。

SoACLisalignedwithACLproteinsfromHomosapiensandArabidopsisthaliana、AlignmentisperformedusingClustalW2andcolorwithESPript,anddarkbackgroundsrepresentidenticalsequences、Thearrows,diamond,andtrianglesbelowtheresiduesshowidentityforconservedintheATP-graspdomain,citratebinding,andactivesite,respectively,withHisphosphorylatedbyATP;underlinesubscripted

byi,ii,andiiiindicatepotentialATP-binding,phosphorylated,andCoA-bindingsites,respectively、

2028

作物学报

第38卷

ATP结合区域、磷酸化区域和CoA结合区域等,序列均高度保守,其余序列相似性也极高。

比较有趣的是,蛋白为杂聚肽结构的拟南芥和甘蔗ACL与同聚肽结构人的ACL相比,A亚基和B亚基间比人的ACL缺省60个氨基酸残基。

进化关系分析的聚类结果表明,杂聚肽结构ACL蛋白的A亚基和B亚基分别聚于一大类,同聚肽结构的ACL聚于另一大类。

SoACLA-1与同属C4植物的玉米的ZmACLA聚于同一个小的进化分支,且与同属禾本科植物的高粱,水稻和二穗短柄草的ACLA进化关系也较近。

SoACLB-1具有与SoACLA-1类似的聚类关系。

&产生速率和ABA含量变化O−2

C

A、WS、WSA处理均导致甘蔗叶片及根系超

&）

产生速率显著上升,但氧阴离子自由基,CA处理在12hO−2

产生速率达到极值,24h后有所下降,可仍比对照高

&产生速率在处理期间一直

出%,WS处理的O−2

图3ACL蛋白系统发生树

Fig、3PhylogeictreeofACLproteins

分支上的数字表示Bootstrap验证中该分支可信度百分比,蛋白名称前2位为物种缩写,全称见英文注释,括号内为登录号。

ThenumericvaluesineachnoderepresentpercentageofhomologyamongstACLsverifiedbybootstrap,theaccessionnumberofeachpro-teinislistedinthepacket,andfirsttwocharactersbeforetheproteinnamesindicateabpeviationsofspeciesasfollows:

Ac:

Aspergillusclavatus;Ag:

Anophelesgambiae;Am:

Ailuropodamelanoleuca;Ao:

Aspergillusoryzae;Ap:

Acyrthosiphonpisum;At:

Arabidopsisthaliana;Bd:

Brachypodiumdistachyon;Ci:

Cionaintestinalis;Co:

Capsasporaowczarzaki;Cp:

Caviaporcellus;Cr:

Chlamydomonasreinhardtii;Cs:

Camelliasinensis;Dd:

Dictyosteliumdiscoideum;Dg:

Drosophilagrimshawi;Dm:

Drosophilamelanogaster;Dp:

Dictyosteliumpurpureum;Ec:

Equuscaballus;Gm:

Glycinemax;Gu:

Glycyrrhizauralensis;Hs:

Homosapiens;La:

Lupinusalbus;Mb:

Monosigapevicollis;Mm:

Musmuscul