非典型肺炎SARS实验室培训.ppt

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SARS的实验室检测,湖南省疾病预防控制中心张红2003年4月20日,确定病原的原则,要从病人中分离培养出病原。

要有血清学的支持证据，即绝大部分病人的血清应能与所分离的病原反应。

将分离病原感染动物，在动物模型上重复出与临床表现类似的特征。

SARS的病原学研究,第一部分：

排除多种传染病第二部分：

排除禽流感第三部分：

衣原体及相关研究第四部分：

冠状病毒第五部分：

国际研究进展,排除多种传染病,鼠疫（plague）;肺炭疽（anthrax）;钩端螺旋体（leptospira）;军团菌（Legionella）.结核菌（tuberclebacillus，TB）支原体（PPLO）,排除多种传染病,腺病毒（Adenovirus），流感病毒（Influenzavirus），禽流感病毒（Avineinfluenzavirus），麻疹病毒（Mealsvirus），副流感病毒（Parainfluenzavirus），出血热病毒（hemorrhagicfevervirus）；呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus）；肠道病毒（Enterovirus）,排除禽流感,对与香港病人有接触及密切接触的75人，分别采集咽拭子和血清标本进行检测；其中对67份咽拭子标本接种鸡胚，病毒分离及病原检测均为阴性；采用半加敏HI法，对75份血清标本进行甲型流感病毒H5和H9抗体测定，结果均为阴性（HI效价1:

5）；用H5引物进行的RTPCR扩增，结果为阴性；截止目前所有接触及密切接触的75人均未患非典型肺炎；结论：

福建平潭县未见禽流感及非典型肺炎出现。

流感病毒分离,广东162份病人标本同时接种MDCK细胞和鸡胚仅分离到两株乙型流感病毒但未分离到禽流感病毒（Avianinfluenzavirus）。

2002年11月2003年1月，广东地区流感监测点共采集529份标本，分离到43株流感病毒，未见禽流感病毒。

全国同期流感监测点共采集3206份标本，分离到294株流感病毒，未见禽流感病毒。

禽流感病毒血清学检测,用美国CDC提供的试剂（1997年）对中山市7例、广州市20例病人的双份血清及1份病人恢复期血清做禽流感病毒（H5N1）血凝抑制实验，除1例恢复期血清为可疑（滴度1：

20）其余54份均为阴性（HI效价10）。

此前广东省疾控中心曾对这些标本中的30份（15对）血清标本进行过同样实验,结果相同。

对另外36份恢复期血清的H5N1的血凝抑制实验，显示所有标本均为阴性（HI效价10）。

对30份健康人血清标本进行血凝抑制实验，结果显示所有标本均为阴性（HI效价10）。

禽流感病毒的分子生物学检测,对3份尸解肺组织标本用WHO推荐的禽流感病毒基因（M，NP，H5）特异引物进行RTPCR反应，结果均为阴性；对8份存在可疑血凝活性（HA）的鸡胚尿囊液和1例咽拭子标本进行H5N1流感病毒全基因组扩增，结果均为阴性。

对1例病人含漱液标本进行H5N1病毒基因扩增，仅M基因为阳性，经与国际基因库（GenBank）比较，显示为甲型流感病毒序列。

衣原体及相关研究,电子显微镜观察免疫荧光检测病原体组织培养组织培养病原体电镜观察组织培养物的免疫荧光检测药物敏感性研究血清学检测,电子显微镜观察,对所收集的来自不同地区、不同医院、死于非典型肺炎的5个病例的标本，电镜观察表明5例肺组织肺泡上皮细胞被破坏，肺泡腔充满渗出液，胞浆内均可见典型的充满衣原体颗粒的包含体，大小不等的原生小体（EB）和网质小体（RB）两种颗粒均可见到，在肺毛细血管和肺泡渗出液中也发现有衣原体样颗粒（Chlamydia-likeagents）。

在病人的心、脾、肝、肾和淋巴结等组织中均可见到典型的衣原体样颗粒和包含体。

免疫荧光检测,第四例病人脾脏压片，用6份病人血清进行免疫荧光检测，其中5份血清在脾脏细胞浆内检测到典型荧光反应，且荧光有致密灶，胞核内未见荧光分布。

用第五例病人的淋巴结涂片与13份病人血清进行免疫荧光检测，全部为阳性且荧光也局限在细胞浆内。

提示引起本次肺炎的病原体存在于细胞浆内（病毒/衣原体）。

病原体组织培养,将病人肺组织匀浆液用青、链霉素和红霉素处理后，接种10种组织培养细胞和鸡胚，观察细胞病变进行病原体的分离。

293细胞，HeLa细胞，Vero-E6细胞，2BS细胞，RDa细胞，Hep-2细胞，人胚肾细胞，人胚肺细胞，BHK细胞，MDCK细胞，鸡胚。

4种组织培养细胞病变,组织培养病原体电镜观察,经第3次传代的4种感染细胞进行超薄切片、电镜观察，也发现了典型的衣原体样颗粒（Chlamydia-likeagents）和包含体。

进行电镜检查之前，在染色的半薄切片中也可见到大量的衣原体样颗粒及包含体。

组织培养物的免疫荧光检测,用5份病人血清对组织培养细胞进行免疫荧光检测，其中2份确定为阳性，其它标本荧光较弱，结果可疑。

目前正在进行多份病人急性期/恢复期血清的免疫荧光检测。

用组织培养细胞作为抗原用衣原体抗体（包括肺炎，砂眼和鹦鹉衣原体）进行免疫荧光检测，结果为阴性。

药物敏感性研究,能抑制病原生长的抗生素：

阿奇霉素（最小有效浓度：

31.25ug/ml）盐酸四环素（最小有效浓度：

1.45ug/ml）左氧氟沙星（最小有效浓度：

5.9ug/ml）多西环素（最小有效浓度：

0.15ug/ml）利福平（最小有效浓度：

375ug/ml）红霉素（最小有效浓度：

46.88ug/ml）能抑制病原生长的抗病毒药物：

更昔洛韦（最小有效浓度：

23.44ug/ml）以上结果为体外实验结果可供临床医生参考。

血清学检测,建立了使用病人尸体组织抗原和细胞培养抗原检测病人血清抗体IgG和IgM的EIA方法。

用上述方法检测病人血清，发现多数SARS病人血清抗体明显阳性：

使用细胞培养的衣原体样抗原，检测出的抗体成份主要为IgM,8个SARS病人IgM检测全部阳性，滴度在1：

2001：

1600之间；30个SARS病人中26人IgG抗体阳性，但滴度偏低，10的为强阳性；30个普通发烧病人对照均为阴性。

使用病人肺组织内衣原体样抗原（方法同上）检测结果与细胞培养抗原的检测结果高度一致。

结论：

结合我们以前的结果（电镜在病人组织和细胞培养物中都观察到衣原体样颗粒），我们发现的衣原体样颗粒可能是引起SARS的重要病原。

因上述两种抗原尚未纯化，不能排除有其它病原体（如冠状病毒）混杂的可能，尚需做特异交叉实验来证实。

冠状病毒,从以前证实含有衣原体样颗粒的多个尸解器官、尸解器官的细胞培养和咽拭子的细胞培养物中都扩增出冠状病毒核酸。

从#3、#4、#5病例尸解肺标本和#4的脾标本中用RT-PCR扩增出和预期大小相同的DNA片段，经核苷酸序列测定为冠状病毒RNA聚合酶序列，来源于3个不同病例的病毒核苷酸序列相同，为变异非常大的新冠状病毒。

上述标本的不同细胞培养物（Vero-E6、Hela、RD、Hep2）中均检出冠状病毒核酸，PCR产物序列和从器官标本获得的序列相同。

从4份北京非典型肺炎病人咽拭子的细胞分离物中，用PCR检出其中的3份含有冠状病毒核酸，其中2份PCR产物序列和从器官标本获得的序列相同。

2.从以前证实含有衣原体样颗粒的尸解器官标本中电镜观察到冠状病毒。

从7#尸解标本的超薄切片中观察到冠状病毒。

从4#尸解标本超离心的负染片中观察到冠状病毒。

3.分离到冠状病毒并已在Vero-E6、Hela、RD、Hep2等细胞上连续传代培养。

已经分离到冠状病毒6株，从组织中分离的3株同时有衣原体存在。

4.建立了使用RD细胞培养分离的冠状病毒抗原检测病人血清抗体IgG的EIA方法。

检测SARS病人血清40份，阳性34份，北京普通发热病人对照血清30份，29份阴性，1份阳性，具有显著性差异。

结论1、形态学、分子生物学、细胞培养及血清学证据表明我们已分离培养到一种新的冠状病毒，这种冠状病毒可能是引起SARS的另一个重要病原。

在数个病人肺、脾标本中证实存在冠状病毒，在确定病因上比从咽拭子及其培养物中检出冠状病毒更具说服力。

2、发现在病人尸解标本中同时存在衣原体样颗粒和冠状病毒，是世界上SARS病原学研究的重要进展，对最终阐明和确定引起SARS的病原具有特别重要的意义,国际研究进展,国际间对非典型肺炎病因的认识,禽流感（Avianinfluenzavirus）衣原体（Chlamydia-likeagent）副粘病毒（HumanMetapneumoniaVirus）冠状病毒（Coronavirus）,国际间SARS病因学研究进展

（1）,2003年3月15日WHO组织国际间的研究网络，相继有11个国家的科学家参加，我国于4月初参加；3月18日德国科学家通过电镜从咽拭子标本观察到副粘病毒，同时香港中文大学获得Metapneumo病毒的基因扩增产物，电镜图片和基因序列均在网络公布；3月19日新加坡从病人呼吸道标本发现副粘病毒颗粒并获得较微弱的病毒基因扩增产物（香港中文大学引物）。

国际上首先发现Metapneumo病毒的荷兰鹿特丹实验室获得有关病人的标本。

国际间SARS病因学研究进展

（2）,3月20日国际上有4个实验室开始进行Metapneumo病毒检测，香港中文大学在电镜下发现副粘病毒颗粒；荷兰鹿特丹实验室检测到副粘病毒，但是Metapneumo病毒扩增为阴性；该实验室将检测试剂送到新加坡和香港，加拿大实验室将双份血清送到鹿特丹。

3月21日香港中文大学科学家用猴肾细胞培养方法获得病毒分离物，随即研制了相应的血清学诊断试剂；,国际间SARS病因学研究进展（3）,同时许多实验室的研究结果显示此次病原体与下列病原体无关，甲、乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1，2，3型，腺病毒，鼻病毒，肠道病毒，人Meta病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体。

同时证明加入病人血清可以抑制细胞病变而对照血清无效。

电镜观察到病毒颗粒为50-60nm。

同一天鹿特丹实验室发现德国3个新加坡病人呼吸道标本的HMPV病毒PCR检测为阴性。

并且在两个可疑病例的呼吸道标本接种Vero细胞和猴肾细胞发现病变。

同时英国科学家检测该两病人标本中的H3N2流感病毒。

国际间SARS病因学研究进展（4）,3月22日香港政府病毒实验室电镜发现冠状病毒样颗粒（70nm），美国从泰国病人标本得到的细胞病变产物中发现冠状病毒样颗粒（70-100nm），在同一份标本获得HMPV病毒PCR阳性结果。

与此同时加拿大，法国，新加坡等地开始使用PCR和电镜方法检测副粘病毒和HMPV病毒。

加拿大发现20nm的病毒颗粒并且发布HMPV病毒的基因进化树。

3月23日香港政府病毒实验室在8份标本中发现2份冠状病毒RNA阳性；美国报道在香港标本中发现冠状病毒，同时建立免疫荧光检测病人血清的方法并将冠状病毒的基因扩增引物在网络公布。

在新加坡和香港开始用鼻咽拭子支气管感染的方式进行非人类灵长类动物实验。

加拿大和法国分别在电镜和PCR方法发现冠状病毒。

德国，日本，新加坡在Vero细胞分离到病毒。

英国实验室在可疑病例呼吸道和尿标本检测到鸡肺炎病毒（Avianpneumovirus（4）序列。

国际间SARS病因学研究进展（5）,3月24-26日更多的实验室（德国，香港）通过电镜和PCR方法检测到冠状病毒，德国实验室获得病毒序列，在蛋白质水平与已知冠状病毒的多聚酶基因相符，更多的基因扩增产物及其序列在不同国家获得，德国，荷兰，香港，并在网络公布基因进化树。

3月27-31日继续进行猴子实验，香港和美国实验室分别证实正常人血清与新分离病毒为阴性反应。

但是有更多的实验室检测到冠状病毒。

日本从新加坡标本中获得阳性结果。

香港检测50份病人血清，其中27份与冠状病毒抗体升高，同时他们还从10个病人粪便中发现5份为病毒检测阳性，并且发现6-16天病人粪便中可以检测到病毒基因。

加拿大在病人标本中发现人类Meta病毒。

国际间SARS病因学研究进展（6）,4月1-8日用副粘病毒和Meta病毒共同感染猴子，出现临床症状。

美国用ELISA方法从发病20天病人血中检测到抗体。

香港免疫荧光方法从发病10天的病人血清中检测到IgM抗体。

小白鼠实验开始启动。

更多实验室在Vero细胞分离到冠状病毒。

又有一些血清学实验证实此次病因为副粘病毒和冠状病毒的复合感染，冠状病毒的新序列继续在荷兰、德国、香港和美国发现。

德国科学家在标本中发现衣原体。

国际间SARS病因学研究进展（结论）,许多实验室已经分离到冠状病毒，该病毒与已知的冠状病毒属病毒有所差别；2.已经在不同国家从许多SARS病人分离到该病毒；3.病毒可在Vero细胞和FRhk-4细胞引起病变并被病人双份血清所抑制；4.电镜可以在病人呼吸道标本和组织培养中看到病毒；5.病人血可以和组织培养物产生免疫荧光；6.新冠状病毒与数百份正常人血清不反应；许多病毒（TGEV,FIPV,MHV和229E）抗血清可以抑制细胞培养。

7.此外，许多实验室的序列测定结果显示该病毒可能为冠状病毒的新属；动物实验在4月18日完成。

WHO最新结论,冠状病毒变种是引起非典病原体来自13个实验室的科学家16日在日内瓦举行的会议上一致认定了变种冠状病毒的作用。

变种冠状病毒与流感病毒有亲缘关系，但它非常独特，以前从未在人类身上发现，科学家将其命名为“SARS病毒”。

国际间SARS病因学研究进展（诊断）,ELISA方法可以检测抗体，但是只能从发病20天的病人检测到，不适于早期诊断；2.免疫荧光同样需要发病10天才可检测到,并且需要细胞培养；3.实时PCR方法目前尚不成熟；4.我国研究出非典快速诊断技术,2小时即可得结果（4月16日新华网）,标本采集、运输和保藏,病毒分离标本的采集与运送,标本采集的质量及数量直接关系到能否成功分离到病原体，而标本保存与运输是否得当也对病原体分离起重要作用。

为提高病毒的分离率，在病人发病早期可每天采集咽拭子或痰液标本。

鼻咽拭子：

用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头浸入含45ml样本运输液的螺口试管中，尾部弃去。

痰液：

将痰液咳入无菌平皿中，然后用棉签刮取痰液放入含45ml样本运输液的螺口试管中。

嗽口液：

用10ml洗液嗽口存入20ml塑料管。

尸检标本：

取肺、肝、肾、心、脾、淋巴结、血凝块等组织2厘米2厘米大小，置于10ml螺口试管中。

尸解标本对于病原学研究非常重要，应尽量多采集。

每种组织至少需要1020管。

病毒分离标本的保存与上送,常用的样品运输液：

PH7.4-7.6Hanks、Eagles或0.5%水解乳蛋白液。

为防止细菌和真菌生长，在采样液中需加入青、链霉素，终浓度为每毫升1000单位青霉素和100g的链霉素，（也可用庆大霉素，其终浓度为每毫升1mg）同时加制霉菌素，终浓度为每毫升4ug。

病毒分离标本的保存与上送,标本采集后应立即进行病原分离工作，否则应保存于实验室80低温冰箱。

24-48小时内能将标本送达省CDC的可将标本置4冰箱保存,否则冷冻保存。

标本必须带冰运送至省CDC微生物实验室。

病毒分离标本的运送最好使用干冰保存。

细菌培养标本的采集与运送,细菌培养标本最好在抗感染治疗之前采集，可采集咽拭子或痰液。

咽拭子：

用无菌湿棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，再将棉签放入无菌试管中。

痰液：

直接将痰液咳入无菌平皿中。

保存运送：

做细菌分离培养的标本密封好，常温下2小时内送检。

血清标本采集与运送,须采集病人的急性期和恢复期血清：

尽早采集急性期血样，最迟不晚于发病后7天。

恢复期血样则在发病后2-4周采集。

由于非典型肺炎感染后抗体出现较晚，因此应在发病后46周采集第三份血样。

无菌采集5ml血液标本，分离血清，低温保存。

双份血清对于确定病因非常重要，强调配对尽量采集到双份血清，同时要保证采集量。

国外每位病人采集10ml血液，可分离到5ml血清。

血清标本采集与运送,详细登记有关病例的姓名、性别、年龄、发病及采样日期等信息血清标本应带冰在24小时内运送至实验室。

立即分装为多管冷冻保存，分装时最好能用两种颜色的试管盖，使急性期与恢复期血清从外观上容易分开。

血清标本可在4存放一周，长期保存置-20或更低温度保存。

标本采集后做什么,开展相关研究分装直接低温冰箱保存,生物安全与防护,实验室生物安全操作原则标本采集安全操作原则,实验室生物安全操作原则,所有感染性或疑有感染性的样品均需在生物安全P3级实验室操作。

P3实验室应装备有生物安全柜、二氧化碳孵箱、低温冰箱专用高压消毒设备、生物显微镜、高速和低速离心机、EIA洗板机、水浴等基本设备。

并根据实验要求增加相应设备，如超速离心机，病原纯化的层析系统，基因扩增仪等。

实验室生物安全操作原则,进入P3实验室工作前，应提前1小时启动P3实验室负压系统，各项安全参数符合标准时才能进入P3实验室工作。

工作结束后，在P3实验室运行情况下开启紫外消毒灯至少一小时后，再关闭实验室负压系统。

实验室生物安全操作原则,实验室工作人员进入实验室要更换P3专用防护服装，在P3实验室缓冲间依次穿好双层鞋套和衣裤，带好帽子、口罩、眼罩和双层手套，然后进入P3实验室工作区内。

工作完毕离开P3实验室工作区进入缓冲间内，按无菌操作要求，首先消毒外层手套，然后脱掉外层手套再消毒内层手套，然后带着手套按无菌操作要求依次脱掉帽子、眼罩、口罩、衣裤和外层鞋套，并将脱掉的衣物装入高压消毒袋中消毒，然后再依次脱掉内层鞋套和内层手套，置另一高压消毒袋中，消毒巾擦拭面部和双手，消毒后离开P3实验室缓冲间。

实验室生物安全操作原则,样品进入P3实验室要经过样品传递窗进入，首先打开P3实验室外的传递窗门，将样品放入传递窗内，关闭室外传递门，待安全灯亮后，打开室内传递窗门，取出样品后关闭室内传递窗门。

样品使用后，严格无菌包装后，才可经传递窗传递出P3实验室。

P3实验室内的实验废物均需高压灭菌后才能移出P3实验室，实验材料及仪器设备移出P3实验室前需经严格消毒。

标本采集安全操作原则,采集传染性非典型肺炎标本时要严格执行采集人的生物安全防护要求，采集人必须穿好防护鞋套、衣裤、帽子、眼罩、口罩和手套。

标本采集完毕后，首先消毒手套，然后带着手套依次脱掉帽子、眼罩、口罩、衣裤和鞋套，最后脱去手套，再用消毒巾擦拭面部和双手。

样品放入塑料管后加无菌外包装后才能传送。

样品采取就地检验的原则，当地医院能开展的项目在当地检测，同时将血清样本和咽拭子等相关样本送当地疾控中心检验。