空间代谢组之样本准备.docx

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空间代谢组之样本准备

继空间代谢组推出以来（新品首发：

错过了空间转录组，不要错过空间代谢组！

），很多老师咨询小迈，怎么准备样本？

有什么要求？

石蜡样本可以做吗？

别急，我们先通过文章看一下样本怎么准备（太长不想看也可以直接翻到最后有样本准备指南哦）。

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一、摘要

提出了一种新的组织样本包埋和处理方法，该方法提供了与许多不同的组织学，分子生物学和分析技术的下游兼容性。

该方法基于将新鲜冷冻的标本低温嵌入到由羟丙基甲基纤维素（HPMC）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）组成的水凝胶基质中，并使用冷冻切片机进行切片。

预期水凝胶在组织学或分析上不会干扰标准组织特征方法。

评估了该方法与包括基质辅助激光解吸电离（MALDI），解吸电喷雾电离（DESI）和二次离子质谱（SIMS）在内的各种质谱成像方法的兼容性，证明了通用方法对基于提取的分子生物学技术（如RT-PCR）的适用性。

通过这种通用的样品制备方案将多种分析方法进行整合，可以在系统生物学水平上研究组织并将结果直接与组织形态和细胞表型联系起来。

二、研究方法

试剂：

明胶，聚N-羟丙基甲基丙烯酸甲酯，聚乙烯吡咯烷酮（PVP），羟丙基甲基纤维素（HPMC），中低粘度羧甲基纤维素纳（CMC），2,5-二羟基苯甲酸（DHB），三氟乙酸（TFA），聚乙二醇辛基苯基醚，特非那定，氢溴酸右美沙芬和盐酸苯海拉明购自Merck（Darmstadt，Germany）。

异戊烷，异丙醇和乙腈（ACN）购自FisherScientific（Waltham，MA，USA），氯沙坦钾盐购自CambridgeBioscience（Cambridge，UK），均为分析纯或更高。

样本：

成年雄性HansWistar大鼠（约重260g），组织解剖后使用干冰冷却的异戊烷速冻，肾脏先在干冰冷却的异丙醇中速冻，然后在干冰冷却的异戊烷中洗涤以除去过量的异丙醇。

组织切片：

在CM3050S冷冻切片机（LeicaBiosystems，Nussloch，Germany）上以10µm的切片厚度进行切片。

用超纯水将样品固定在样品架上。

将腔室保持在-20°C，样本保持-18°C。

在进行用于分析RNA实验的切片之前，先将冷冻切片机腔室和所有易耗品彻底清洗以除去RNase，然后再用乙醇清洗。

进行组织切片，厚度为10µm。

将用于解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI），成像质谱流式（IMC），RNA原位杂交（RNA-ISH），免疫组化（IHC）的组织切片解冻放于防脱载玻片（ThermoScientificWaltham,MA,USA），将用于基质辅助激光解吸电离（MALDI-MSI）和二级离子质谱成像（SIMS-MSI）的切片解冻放于ITO镀膜导电载玻片（BrukerDaltonik,Bremen,Germany）。

将用于DNA和RNA提取的组织切片收集到无RNAse的试管中。

三、研究结果

1.DESI-MSI包埋介质评估

对不同包埋介质进行DESI-MSI评估，HPMC+PVP包埋速冻组织块，分析物几乎没有观察到移位，而-80°C冰箱冷冻样品显示极性分析物大量渗入到包埋介质中（图a）。

无论采用何种冷冻方法，明胶均显示出极性分子和结构脂质的大量移位。

Na-CMC显示出与HPMC+PVP相当的分析物移位，但包埋介质在样品表面上的沉积导致部分离子抑制（图像上显示为较暗的阴影），H＆E染色的切片上观察到了包埋介质较强的背景染色。

HPMA促进极性分析物移位，与正离子模式下的发现相符。

HPMC速冻样本腺苷一磷酸AMP和谷胱甘肽GSH很少移位，但样品在-80°C冰箱冷冻有大量渗出。

包埋介质在负离子模式下均未检测到明显的聚合物信号。

与在-80°C冰箱中缓慢冷冻相比，当将样品速冻时，所有包埋介质均显示出较小的极性分析物移位，而磷脂使用任何一种冷冻方法均较少移位。

DESI-MSI包埋介质评估

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2.包埋介质和冷冻方法的组织形态和质谱成像

与没有进行包埋的切片相比，HPMC+PVP与速冻相结合可改善切片的形态。

与传统OCT包埋获得的切片质量相似，HPMC+PVP速冻组织显示出较好的组织形态和染色特性，-80˚C冰箱冷冻会破坏切片的形态，H＆E染色的切片显示出明显的冰冻缺陷，其中包括组织破裂和冰晶形成的大裂缝，妨碍了对标本的显微镜分析。

-80°C冰箱完全冷冻大约需要15-20分钟，而速冻为1-2分钟，因此受损的组织质量是由样品缓慢冷冻导致形成大的冰晶损坏组织。

明胶速冻显示出与组织形态有关的结果：

组织核心显示出良好的形态完整性，但外层显示出由热包埋介质引起的实质性组织损伤。

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大鼠肾皮质H＆E染色（a:

不包埋，b:

OCT或HPMC+PVP包埋，c:

-80˚C冰箱冷冻，d:

速冻）

为了最大程度地减少分析物的移位，样品收集到速冻之间的时间应保持尽可能短，最好在1分钟以下。

肾脏，肝脏和脾脏共同包埋，使用质谱成像评估HPMC+PVP速冻方法的重复性，在相邻区域上DESI-MSI以25µm的较高空间分辨率成像结果证实了极性分析物（例如GSH或FA（18：

2））移位少，同时可以清楚地识别较大的形态特征，例如肝区带或红髓、白髓（图a，b）。

MALDI-MSI成像以10µm的空间分辨率进行，可以清晰地描绘出分析物的分布，甚至可以描绘成小的形态特征，例如肾皮质的管道系统（图c）。

成像评估（DESI-MSIa:

100µm，b:

250µm，PI（38:

4）红色，FA（18:

2）绿色，Glutathione蓝色，c:

MALDI-MSI10µm）

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3.优化的包埋方案流程

将两种聚合物PVP和HPMC称重并溶解在去离子水中，使其最终浓度为2.5％（m/m）PVP和7.5％（m/m）HPMC。

将混合物在4°C下放置过夜，以使两种聚合物完全溶解，并使形成的泡沫沉降。

在组织包埋之前，将包埋介质在冰上预冷却约30分钟。

当直接在干冰冷却的异戊烷中快速冷冻时，组织块往往会破裂，而在干冰冷却的异丙醇中速冻使组织块以稍慢的速度冷冻（约2分钟），随后转移到干冰冷却的异戊烷中约30秒洗去过量的异丙醇更好。

组织块完全冷冻后，可以将其转移到干冰上，以使异戊烷蒸发，再转移到-80°C的冰箱保存。

4.真空包装的质谱成像评估

对照样本解冻后不进行任何处理（未真空包装NVP），实验样本解冻并立即在氮气中干燥，然后保存在真空袋（真空包装VP）中，以避免由于冷凝水引起的分析物移位。

通过多元统计方法分析DESI和MALDI数据集评估真空包装的影响，在负离子模式下进行的DESI分析显示出差异的TIC图像（图a）。

主成分分析（PCA）显示，最大的差异来源（89.6％）是组织和背景之间的差异，而与组织类型无关，前三个PC覆盖了96％的数据差异（图b）。

使用k均值聚类（5个聚类）说明了组织切片周围的光晕（图c）。

当样品解冻后立即干燥并保存在真空包装的玻片中时，分子扩散和光晕仅限于包埋介质和组织轮廓之间的间隙，缺乏真空包装导致更显著的扩散效果（图d），发现小的极性分子（例如牛磺酸和谷胱甘肽）从组织切片中扩散出来。

MALDI-MSI分析还采用正离子模式进行，在VP和NVP样品的平均谱图之间未发现明显差异，PCA分析显示，VP和NVP样品之间也没有较大差异（图e）。

通过k均值聚类显示了组织外部分析物的低水平移位，如肾脏组织中的簇5所示，真空包装的样品显示出组织切片内分析物的空间分布更好的保存性。

（图g）。

质谱成像评估结果

5.免疫组化评估包埋介质

通过IHC确定和验证蛋白质表达模式是组织学的常用方法，使用成像质谱流式（IMC）对包埋介质进行评估。

与未包埋的对照相比，HPMC+PVP或OCT包埋的样品均未发现抗体结合的干扰（图a，b，d）。

抗体标记之前的大量固定和清洗步骤去除了包埋介质。

明胶不会直接干扰结合，但显示明胶对胶原蛋白1存在背景染色，背景掩盖了组织边缘（图c，g）。

使用IHC染色证实了抗胶原蛋白-1背景染色问题，尽管不如使用IMC显著。

这种差异与不同的样品制备流程有关，在自动IHC染色平台较苛刻的样品制备条件下，从组织边缘和载玻片上去除了大多数明胶。

此外，染色的明胶片经常从载玻片上脱落并覆盖组织切片，从而掩盖了光学扫描。

免疫组化IMC评估（a:

不包埋，b:

HPMC+PVP包埋，c:

明胶包埋，d:

OCT包埋，e-h:

组织边缘放大结果）

6.包埋介质对DNA和RNA质量影响

通常将代谢物分布信息与基因表达模式联系起来，以将观察到的代谢物变化与潜在的生化途径相关联。

为了评估新开发的包埋介质（HPMC+PVP）与分子遗传学实验的兼容性，将从HPMC+PVP包埋的肾脏切片中提取的DNA和RNA与包埋在OCT，明胶中或未包埋对照切片中的DNA和RNA进行了比较。

使用Agilent2100评估提取的RNA的纯度和完整性（RIN值），发现HPMC+PVP包埋样品中提取的RNA具有与未包埋对照中提取的RNA相似的纯度和质量。

与明胶包埋的样品相反，来自OCT包埋的样品的RNA与对照相比无显著差异。

但是，OCT的一个样品和明胶的两个样品均低于RIN的默认设定质量阈值5（图a），表明潜在的RNA降解。

使用管家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶（Gapdh）和肽基脯氨酰顺/反异构酶B（Ppib）作为靶标，在RT-PCR实验中证明了使用逆转录酶将RNA转录为cDNA和扩增的能力（图c）。

与未包埋的对照相比，包埋在HPMC+PVP和明胶中的样品对扩增没有任何干扰，而OCT的相对定量值则明显较低（图b）。

包埋介质对DNA和RNA质量影响

小结

MSI质谱成像的真正意义在于其非靶向性，允许在单次实验同时成像数千个分子。

结合形态学，蛋白质组学和基因组信息，可以对健康和疾病分子相互作用网络提供独特的见解。

当前的研究清楚地证明了以共同包埋方式收集这些数据集的可行性。

当前，大多数实验室收集，保存和分析样本，由于并非可以完全控制和复制冷冻机到质谱仪整个过程的所有步骤，因此单个成像数据集通常会遇到批处理效应，这可能会干扰所研究的生物学问题。

同样，由于单个组织切片的成像可能仍需要数小时（尤其是在高空间分辨率下），因此，进行有力的研究需要数周的长时间，进一步增加了批次效应。

相比之下，所提出的方法可以构建新鲜的冷冻组织，从而保证在整个样本队列中进行相同的样本处理和可比较的分析结果。

样本准备Tips

您可以直接送新鲜组织由我们进行切片，也可以切片之后送样，以下是空间代谢组样本准备指南。

一、组织样本

1、无需包埋的组织（一般为含水量比较少的组织，如脑肝肾心肺脾等）

取组织样本（不超过载玻片大小26*76mm），尽量保证组织的完整性，用铝箔做一个锡箔纸小船，将组织平放于锡箔纸小船内（注意将要切的平面朝向锡箔纸小船底部使之保持平放）。

将放好组织的锡箔纸小船置于液氮溶液上15-30s，待看到组织完全变白，即可取出锡箔纸小船。

将样品于-80°C冰箱保存，干冰进行运输。

2、需要包埋的组织（一般为含水量比较多的组织，含水量多的组织为了保证切片时切片的完整性需要进行包埋，如眼球、大多数植物组织）

取组织样本（不超过载玻片大小26*76mm），尽量保证组织的完整性，配制包埋剂，可选1%~2%羧甲基纤维素（CMC），10%-25%明胶或HPMC+PVP，不能用OCT作为包埋剂（离子化时会抑制离子电离且出现干扰峰）。

先加1mL的包埋剂（包埋剂中尽量不要有气泡）平铺在包埋盒中，将组织置于包埋剂中，并调整好组织的位置（组织在包埋盒中放置的位置与后续切片的平面有关），再加适量包埋剂覆盖在组织上，确保组织完全被覆盖，随后将包埋盒置于干冰乙醇浴中冷冻。

待包埋剂完全变白后（该冷冻过程约3-5min），即可取出包埋盒于-80°C冰箱保存，干冰进行运输。

二、切片

1、福尔马林固定石蜡包埋、染色剂如HE染色等处理后的样品，对质谱检测有一定影响，不建议进行空间代谢组检测；

2、切片厚度大约在8~20微米，切片大小不超过15*65mm，切片应做好标记，对比样品可放置于同一张载玻片，切片间应留有一定空隙，每份样品提供至少3~6个切片以备用；

3、切片流程如下（可参考）：

经-80°C冰箱取出的组织放于-20°C冰箱或切片机里-20°C平衡1小时。

将样品放到样品托头上并且调整好样品的角度和方位，然后把样品托头固定在切片机可定位样品头上，按照切片机使用说明书操作进行切片，将切好的切片用预冷的毛刷转移到预冷的玻片上，将玻片背面贴紧手背，用手背的温度将组织切片融化至透明，透明后通过手指摩擦玻片背面，通过背面的温度将玻片正面组织上的水分蒸干，组织会由透明变白。

切完后将含有组织的玻片用真空干燥仪器干燥20min。

然后放入-80°C保存，干冰进行运输。

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