生物化学实验总结教案.docx

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生物化学实验总结教案

一改良lowry法测蛋白含量

用分光光度计，测蓝色产物的A，波长650nm

二

（1）血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳

一、目的与要求

1、掌握CAM电泳的基本原理

2、学习CAM电泳的操作技术

电泳

带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。

电泳分离蛋白质的原理:

蛋白质分子表面带有的电荷;蛋白质分子量的大小

二、实验原理：

以乙酸纤维素薄膜作为支持体的一种电泳方法。

缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在缓冲液中均带负电荷（血清蛋白的pI大多在7.5以下）。

带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。

按泳动快慢顺序，由正极到负极依次为

清蛋白1-2---球蛋白

三、操作步骤：

1.装置电泳箱。

2.点样：

浸于巴比妥溶液中的乙酸纤维素薄膜，滤纸对折轻轻吸干----半干燥态。

铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，在距膜端1.5~2cm处垂直点样。

3.放入电泳槽。

点样端位于负极，保持膜直；不下垂。

4.通电：

180伏，50-60min。

断电后，取膜。

5.染色：

氨基黑染色10min（轻轻振晃）。

6.浸洗：

依次浸洗液浸洗3次，每次5-10min

四、注意事项：

1.区分电泳箱正负极，玻璃片密封，集体电泳。

2.沾适量样本垂直点样，点在距膜端1.5-2cm处，一定要标记好，注意保持膜半干燥。

3.点样处放在电泳箱的负极端，并保持膜水平。

4.浸洗液依次漂洗染色膜。

5.先切断电源再取膜

二

（2）凝胶柱层析分离血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶

一、目的与要求

掌握凝胶层析的原理、熟练掌握实验操作

二、实验原理

凝胶层析法是指混合物随流动相，经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。

大分子物质直径大于凝胶网孔，不能进入凝胶内部，沿凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，流程短、流速快，首先流出层析柱。

（血红蛋白红色）

＊小分子物质直径小于凝胶网孔，能自由出入凝胶网孔，因而流程长、洗脱时间长，最后流出层析柱。

（DNP-胰糜蛋白酶黄色）

三实验步骤及注意事项

装柱

垂直固定凝胶柱，加入蒸馏水，打开出口，排净气泡，

关闭出口。

将凝胶轻轻搅动均匀，连续地倒入柱中，待凝胶沉降

约2-3cm后，打开出口，调节流速约10滴/min，继续装柱至15-20cm高，

关闭出口。

装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。

垂直固定凝胶柱，加入蒸馏水，打开出口，排净气泡，

关闭出口。

将凝胶轻轻搅动均匀，连续地倒入柱中，待凝胶沉降

约2-3cm后，打开出口，调节流速约10滴/min，继续装柱至15-20cm高，

关闭出口。

装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。

加样

慢慢打开出口，使洗脱液缓缓流出，至液面与床面几乎平齐

（不可使床面干掉），关闭出口。

用长滴管将样品小心加至柱床表面，

避免将凝胶冲起。

打开出口，使样品溶液进入凝胶内，当样品溶液

恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭出口。

洗脱

沿管壁缓慢滴入蒸馏水，使高出床表面3～5cm，打开出口，

开始洗脱，直至两条色带分开。

仔细观察样品在层析柱内的分离现象。

回收

凝胶用过后，用5个柱长的蒸馏水洗后回收。

凝胶面上必须始终保持有一定的洗脱液

注意事项：

1、装柱时，将小烧杯内的凝胶轻轻搅动均匀，连续地倒入柱中。

2、加样分离时的滴速要控制好，凝胶面上必须始终保持有一定的洗脱液，以免凝胶柱裂开。

3、加样完用缓冲液（蒸馏水）洗脱时，沿管壁缓慢滴入蒸馏水。

4、凝胶用过后，用5个柱长的蒸馏水洗后回收。

三．胰岛素和肾上腺素对家兔血糖浓度的影响：

实验目的与要求

v了解激素（hormone）对血糖浓度的影响

v掌握血糖（bloodsugar）的测定方法

全血：

由血浆和血细胞组成，血细胞分为：

红细胞、白细胞、血小板。

血浆（plasma）：

全血经抗凝处理后得到的液体成分，含有凝血因子、纤维蛋白原等

血清（serum）：

全血凝固后析出的液体不含纤维蛋白原

邻甲苯胺法测定血糖浓度

☆分光光度计的使用

1、打开分光光度计，预热20-30min。

☆2、调节旋钮至需要的光波长。

（邻甲苯胺法测定血糖620nm，

3、检查拉杆是否在分光光度计的休息状态。

T档拉杆1档空白管调T100%：

T档拉杆1档半调T0%：

比色皿

1、分清光面、毛面

2、用溶液润洗2-3次，装至2/3体积

3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面

4、蒸馏水冲洗3-5次，倒扣放置。

一、目的与要求

掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理及方法

二、原理

☆血样中的葡萄糖在酸性条件下加热-3H2O生成羟甲基糠醛，经过邻甲苯胺变成醛亚胺（蓝色），颜色的深浅与葡萄糖含量成正比，用比色法测定待测血样吸光度值，与经同样处理标准葡萄糖溶液比较（标准管法），即可求得血样中葡萄糖的含量.

Lambert-Beer定律

A1=K1C1L1

A2=K2C2L2

A1、A2分别是标准管和待测管的吸光度

C1、C2分别为标准管和待测管的浓度

L1、L2分别为标准管和待测管的比色杯的光径∵L1=L2；K1=K2　　所以A1/A2=C1/C2

1、动物的准备:

家兔两只，禁食一晚。

测量体重并记录。

2、血样的采集

1）采血前的准备：

加好抗凝剂（草酸钠），润洗采血针

2）心脏内取血3-4ml【胰-1/肾-1】

3）皮下注射胰岛素0.5ml/kg，1小时后心脏抽血

1%肾上腺素0.4ml/kg，半小时后心脏抽血

4）心脏内取血3-4ml【胰-2/肾-2】

3、血浆的制备:

血样采集后，2000rpm离心5min，取上清。

4.标准管法测定血糖含量（每组4支大试管）

注意事项

☆1、离心机使用前必须配平：

质量配平和位置配平

烧杯放在称上后调零，然后放塑料管和待测管，向塑料管中加入平衡液质量配平

2、微量移液器的使用（量程，枪头）

3、邻甲苯胺试剂中含冰乙酸，谨防腐蚀分光光度计

4、电磁炉使用前10min打开；绝对不可干煮；

加热完成后，用夹子取出试管，绝对不可用手拿

5、注意兔子的抓取、固定、心脏采血、皮下注射方法

☆离心机使用：

质量配平和位置配平，设置转速和时间

☆微量移液器的使用（量程，枪头）0.5-1020-200,100-1000,,1000-5000

结论：

胰岛素使血糖降低和肾上腺素使血糖升高

四．血清甘油三酯含量测定

实验目的:

掌握血清甘油三酯化学法测定的基本原理及主要技术方法。

了解血清甘油三酯含量测定的正常值与临床意义。

实验原理

☆甘油三酯皂化（KOH）到甘油，氧化（过碘酸）到甲醛，显色（乙酰丙酮）到黄色带荧光产物

☆比色：

取出试管自然冷却，420nm测吸光度，记录各管吸光值。

注意事项

抽提时摇匀静置，待完全分层后才能吸取上层液，

吸取上层液时不能吸入下层液；

试管使用时必须要干燥；

验完成后，试管和比色杯必须用皂粉洗干净，

不能有油污，将水甩干，倒置晾干；

枪头必须清洗干净，甩干

临床应用

餐后甘油三酯会增高，检查时一定要空腹抽血饮酒可引起血清甘油三酯浓度急性、短暂性升高，抽血前几天禁止饮酒正常人血清甘油三酯水平有随年龄增高的趋势

血清甘油三酯水平升高多见于糖尿病、肾病综合征、急性胰腺炎、原发性高甘油三酯血症及动脉粥样硬化等

五．

（1）改良Mohum法测定鼠肝谷-丙转氨酶（GPT）活性

实验目的

掌握GPT活性测定的基本原理熟悉GPT活性测定的具体操作方法了解血清GPT活性测定的临床意义

二、实验原理：

丙氨酸+α-酮戊二酸在GPT谷氨酸+丙酮酸在2、4-二硝基苯肼生成丙酮酸二硝基苯肼在NaOH生成丙酮酸二硝基苯腙（棕色）

在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准的丙酮酸溶液比较

注意事项

1保温温度和时间要精确，即酶发挥催化作用的环境要一致。

2掌握酶活性单位的概念和计算方法

3微量移液器的使用

ALT测定的临床意义

肝细胞中ALT最丰富，当肝脏疾病致肝细胞受损时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。

测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。

显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死；中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎；轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。

饮酒、油腻饮食、过劳等因素也会导致ALT短暂增高

思考题：

标准管法只要3支试管就可以，为什么该实验多了一支对照管，对照管起什么作用？

答：

因为肝匀浆自身有丙酮酸活性，所以要用对照管调零

五

（2）琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

实验目的

了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中的竞争性抑制作用

竞争性抑制作用

三个特点：

1.抑制剂竞争性与酶活性中心结合2.酶与抑制剂结构相似3.竞争性抑制是可逆抑制。

抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力以及抑制剂和底物浓度比。

加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。

实验原理

实验中反应生成的FADH2会使氧化型的甲烯蓝变成还原性的甲烯白

注意事项

o注意区分肌肉与筋膜；

o家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多；

o12ml缓冲液要分次加入，不可一次性加入；

o碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干；

o滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度；

o滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可；

o观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝；

o实验完成后试管要用皂粉清洗。

六SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS全称十二烷基硫酸钠）

掌握SDS-PAGE分离混合蛋白质的原理了解并熟悉SDS-PAGE的实验方法和操作技术

实验原理

1、不连续电泳的浓缩效应：

分离胶在下浓缩胶在上

2、蛋白分子的电泳速度只与分子大小相关

操作步骤

1、☆制胶：

按讲义表格配置凝胶。

装好装置（低玻璃面向自己），用抢验漏，放分离胶，放水压平，放入烤箱，拿出放浓缩胶，放满，插梳子，放入烤箱后拿出拔梳子，放入电泳槽，低玻璃面对面，缓冲液漠过低玻璃面。

注意：

必须将试剂充分混匀后才灌入胶板中；加入TEMED、APS后要尽快灌胶，避免凝固

☆2、上样（会操作）3、电泳：

在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，注意正负极，电泳时，浓缩胶电压100V，分离胶电压180V，电泳40min。

4、染色：

考马斯亮兰染色，15min

5、脱色：

5min，观察条带。

注意事项

未聚合的丙烯酰胺（Acr）和N,N΄-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。

注意用电安全，必须先断电，再取出凝胶管，考马斯亮蓝染色、脱色，染液回收

七质粒DNA的提取

☆琼脂糖凝胶电泳

配胶：

加热完全溶解后，加入EB后稍作冷却，倒至制胶槽中，黑边与插梳子一端对齐。

制一块胶有空隙的朝上。

（带手套）

注意事项

微量移液器的使用：

调节和读数；

☆离心机的使用：

质量配平，位置配平；

琼脂糖凝胶的配制、使用过程中用到溴化乙锭（EB）是强诱变剂，具有高致癌性注意自我防护；

制备质粒过程中，操作必须缓和，不可剧烈荡，避免机械剪切力对DNA的断裂作用。

八聚合酶链式反应（PCR）:

不考操作考理论

基本原理：

在体外模拟体内的DNA复制，目的DNA片段在体外高效、快速、特异地扩增。

PCR体系

模板DNA（template）

寡核苷酸引物（primer）

单脱氧核苷酸（dNTP）

DNA聚合酶（polymerase）

合适的缓冲液（buffer）系统

☆PCR过程

变性（denaturation）——DNA双链解链变为单链95℃左右

退火（annealing）——DNA复性，引物与模板结合55℃

延伸（extension）——引物沿5'→3'端延伸合成新链72℃

注意事项

1各种试剂的用量均非常微小，注意微量移液器的使用，避免不当操作造成的误差；

2、不要在管壁上做标记，以免影响PCR仪的导热性3、注意琼脂糖凝胶电泳中EB的污染

4、所用的PCR扩增管、枪头都要灭菌。

5、每次实验都要设置阴性和阳性对照。

6、根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现非特异性扩增产物