整理蛋白质的测定.docx
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整理蛋白质的测定
蛋白质的化学反应及与食品成分的相互作用
1蛋白质与水的相互作用:
蛋白质的水溶性
蛋白质与水之间的作用力主要是蛋白质中的肽键(偶极-偶极相互作用或氢键),或氨基酸的侧链(解离的、极性甚至非极性基团)同水分子之间发生了相互作用。
影响蛋白质水溶性的应素很多:
(1)pH>pI时,蛋白质带负电荷,pH=pI时,蛋白质不带电荷,pH时,蛋白质带正电荷。
溶液的pH低于或高于蛋白质的pI都有利于蛋白质水溶性的增加,一方面是加强了蛋白质与水分子的相互作用,另一方面蛋白质链之间的相互排斥作用。
等电沉淀。
(2)离子强度:
μ=0.5ΣCiZi2,Ci表示离子强度,Zi表示离子价数。
盐溶:
当溶液中的中性盐浓度在0.5mol/L时,可增加蛋白质的溶解性,盐作用减弱蛋白质分子之间的相互作用。
盐析:
当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L时,蛋白质会沉淀析出,这是盐与蛋白质竞争水分的结果。
不同盐类对蛋白质的盐析作用强弱不同。
将这种强弱顺序称为感胶离子序:
(3)非水溶剂:
有些有机溶剂可引起蛋白质变性沉淀,主要是有机溶剂降低了水的介电常数,蛋白质之间的静电斥力降低。
(4)温度:
温度低于40-50℃时,随温度的增大水溶性增大,当温度大于50℃,随温度的增大,水溶性降低。
根据蛋白质的溶解性对蛋白质分类:
(1)清蛋白:
可溶于pH6.6的水中,血清清蛋白,卵清蛋白,α-乳清蛋白;
(2)球蛋白:
能溶于pH7的稀碱溶液,β-乳球蛋白;
(3)醇溶蛋白:
能溶于70%的乙醇,玉米醇溶蛋白;(4)谷蛋白:
在上述溶剂中都不溶解,但可溶于酸(pH2)或碱(pH12)。
2织构化
在许多食品体系中,蛋白质是构成食品结构和质地的基础,无论是生物组织(鱼和肉的肌原纤维蛋白),还是配制食品(如面团、香肠、肉糜等)。
还可以通过织构化加工植物蛋白使其具有咀嚼性及持水性的纤维状产品。
一般蛋白质织构化的方法有:
(1)热凝固和薄膜形成:
豆浆在95℃保持几小时,表面会形成一层薄膜,如腐竹的生产。
一般工业化蛋白质织构化是在光滑的金属表面进行的;
(2)纤维形成:
纤维纺丝。
大豆蛋白纺丝:
在pH10时制备高浓度10-40%的纺丝溶液→脱气→澄清→通过管蕊板,每平方厘米1000孔,孔径为50-150μm→酸性氯化钠溶液(等电沉淀或盐析)→压缩→成品。
(3)热塑挤压:
使蛋白质中的含水量为10-30%,在高压下10000-20000kPa,使其在
20-150s内温度升高到150-200℃。
挤压通过蕊板,一般在蛋白质中加入淀粉可改善其质地。
3凝胶形成:
蛋白质形成凝胶的机制和相互作用至今还没有完全研究清楚,但有研究表明蛋白质形成凝胶有两个过程,首先是蛋白质变性而伸展,而后是伸展的蛋白质之间相互作用而积聚形成有序的蛋白质网络结构。
影响蛋白质凝胶形成的因素有:
(1)蛋白质的浓度:
蛋白质溶液的浓度越大越有利于蛋白质凝胶的形成,高浓度蛋白质可在不加热、与等电点相差很大的pH条件下形成凝胶。
(2)蛋白质的结构:
蛋白质中二硫键含量越高,形成的凝胶的强度也越高,甚至可以形成不可逆凝胶,如卵清蛋白,β-乳球蛋白。
相反含二硫键少的蛋白质可形成可逆凝胶,如白明胶等。
(3)添加物:
不同的蛋白质相互混合,可促进凝胶的形成,将这种现象称为蛋白质的共凝胶作用。
在蛋白质溶液中添加多糖,如在带正电荷的明胶与带负电荷的褐藻酸盐或果胶酸盐之间通过离子相互作用形成高熔点凝胶。
(4)pH:
pH在pI附近时易形成凝胶。
4面团形成
小麦胚乳中的面筋蛋白质在当有水分存在时在室温下混合和揉搓能够形成强内聚力和粘弹性糊状物的过程。
水合的面粉在混合揉搓时,面筋蛋白质开始取向,排列成行或部分伸展,这样将增强蛋白质的疏水相互作用并通过二硫交换反应形成二硫键。
最初的面筋颗粒形成薄膜,形成三维空间上具有粘弹性的蛋白质网络。
影响蛋白质面团形成的因素有很多:
(1)氧化还原剂:
还原剂可引起二硫键的断裂,不利于面团的形成,如半胱氨酸;相反氧化剂可增强面团的韧性和弹性,如溴酸盐;
(2)面筋含量:
面筋含量高的面粉需要长时间揉搓才能形成性能良好的面团,对低面筋含量的面粉揉搓时间不能太长,否则会破坏形成的面团的网络结构而不利于面团的形成;
(3)面筋蛋白质的种类:
利用不同比例的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白进行实验,发现麦谷蛋白决定面团的弹性、粘结性、混合耐受性等,而麦醇溶蛋白决定面团的延伸性和膨胀性。
5乳化性质
蛋白质在许多乳胶体食品体系中起着重要的作用,如牛奶、冰淇淋、肉馅等。
蛋白质对水/油体系的稳定性差,而对油/水体系的稳定性好。
影响蛋白质乳化的因素:
(1)盐:
0.5-1.0mol/L的氯化钠有利于肉馅中蛋白质的乳化;
(2)蛋白质的溶解性:
蛋白质的溶解性越好,其乳化性也越好,但蛋白质的乳化性主要与蛋白质的亲水-亲油平衡性有关;
(3)pH:
有些蛋白质在pI时乳化性最好,而有些蛋白质在pI乳化性最差;
(4)热作用:
热不利于蛋白质乳化性的发挥。
6起泡性质
在食品体系中蛋白质起泡的现象非常常见,如蛋糕、棉花糖、蛋奶酥、啤酒泡沫、面包等。
蛋白质泡沫其实质蛋白质在一定条件下与水分、空气形成的一种特殊形态的混合物。
影响蛋白质起泡的因素有:
(1)盐类:
氯化钠一般能提高蛋白质的发泡性能,但会使泡沫的稳定性降低,Ca2+则能提高蛋白质泡沫的稳定性。
(2)糖类:
糖类会抑制蛋白质起泡,但可以提高蛋白质泡沫的稳定性。
(3)脂类:
脂类对蛋白质的起泡和泡沫的稳定性都不利。
(4)其他:
蛋白质浓度为2-8%时,起泡效果最好,除此之外还与搅拌时间,强度、方向等有关。
有时由于蛋白质的起泡而影响加工工艺的操作,要对蛋白质泡沫进行消除,常用的方法就是加入消泡剂——硅油。
7风味结合作用
蛋白质可以使食品中的挥发性风味化合物在贮藏及加工过程中不发生变化,并在进入口腔时完全不失真的释放出来。
影响蛋白质风味结合作用的因素有:
(1)水:
水可以提高蛋白质对极性风味化合物的结合作用,但对非极性风味化合物的结合没有影响;
(2)盐:
凡能使蛋白质解离或二硫键断裂的盐类,都能提高蛋白质的风味结合能力;
(3)水解作用:
蛋白质水解后其风味结合作用严重被破坏;
(4)热变性:
热变性一般会使蛋白质的风味结合作用有所加强;
(5)其他:
脱水,脂类存在。
蛋白质的测定方法
pro的测定方法分为两大类:
一类是利用pro的共性,即含氮量,肽链和折射率测定pro含量,另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。
但是食品种类很多,食品中pro含量又不同,特别是其他成分,如碳水化合物,脂肪和维生素的干扰成分很多,因此pro的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏,用标准酸液吸收,用标准酸或碱液滴定,由样品中含氮量计算出pro的含量。
由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它们的基本原理都是一样的。
一凯氏定氮法
这种方法是1883年Kjeldahl发明,当时凯氏只使用H2SO4来分解试样,来定量谷物中的pro,他只知用H2SO4分解试样,而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程,所以只使用H2SO4分解试样,需要较长时间,后来由Gunning加入改进,他改进的办法是在消化时加入K2SO4使沸点上升,这样加快分解速度,因为温度由原来硫酸沸点的380上升到400℃,提高了不到67℃所以速度也就加快了,凯氏定氮法至今仍在使用。
我们在检验食品中pro时,往往只限于测定总氮量,然后乘以pro核算等数,得到蛋白质含量,实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物,故称为粗pro。
1凯氏常量定氮法:
不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的,首先第一个步骤是消化:
(1)消化:
样品与硫酸一起加热消化,硫酸使有机物脱水。
并破坏有机物,使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出,而pro则分解氮,则与硫酸结合成硫酸铵,留在酸性溶液中。
(2)在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解,它与硫酸反应生成硫酸氢钾,可提高反应温度,一般纯硫酸加热沸点330℃,而添加硫酸钾后,温度可达400℃,加速了整个反应过程。
此外,也可以加入硫酸钠,氢化钾盐类来提高沸点。
其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解,水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大,沸点增加。
加速了有机的分解。
但硫酸钾加入量不能太大,否则温度太高,生成的硫酸氢铵也会分解,放出氨而造成损失。
为了加速反应过程,还加入硫酸铜,氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢,次氯酸钾作为氧化剂。
但为了防止污染通常使用硫酸铜。
所以有机物全部消化后,出现硫酸铜的兰绿色,它具有催化功能,还可以作为碱性反应指示剂。
(1)蒸馏:
样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨,在这操作中,一是加入氢氧化钠溶液要过量,二是要防止样液中氨气逸出。
(2)吸收与滴定:
蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收,然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液,从而计算出总氮量。
半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后,再用标准盐酸直接滴定,硼酸呈微弱酸性,用酸滴定不影响指示剂变色反应,它有吸收氨的作用。
1.操作步骤:
准确称取样品中0.50-2.00g→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20mlH2SO4→在通风橱中先以小火加热,待泡沫消失后,加大火力,消化至透明无黑粒后,将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30分钟→至到样液呈绿色状态,停止消化,冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波动珠数粒和80ml50%NaOH→立即接好定氮球→加热→至到K氏瓶内残液减少到三分之一时,取出用水冲洗→用0.1NHCl滴定。
N(V2-V1)0.014
W
计算:
总氮量%=(N(V2-V1)×0.014)/W×100
0.014----氮的毫克当量数
pro%=总氮%×K
乳制品K=6.38(N=15.7%)
小麦粉K=5.79(N=17.6%)
动物胶K=5.6(N=18.0%)
冰蛋K=6.7(N=14.8%)
大豆制品K=6.0(16.7%)K=6.25则(N=16%)
K-换称等数
各种试剂的作用:
浓H2SO4:
A:
脱水使有机物炭化,然后有机物炭化生成碳,碳将H2SO4还原为SO2,本身则变为CO2
B:
氧化
C:
pro与浓H2SO4生成NH3↑,CO2,SO2,H2O↑
D:
NH3与H2SO4生成硫酸铵
(1)CuSO4的作用(催化剂)
CuSO4为红色沉淀,当C完全消化后,反应停止,红色消失,变为兰色,即为消化达到完全,兰色为CuSO4的颜色
(2)K2SO4的作用(提高沸点)
沸点由330℃提高到400℃加速了反应过程。
(3)硒粉和过氧化氢,氧化汞都为催化剂,但为了防止污染通常采用硫酸铜
(4)50%NaOH的作用
下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:
(1)K氏烧瓶和取样量
如果称1g以上的样品,就需要K氏烧瓶最小500ml,800~1000ml的更好,这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间,加热的均匀性和完全氨化效果最好。
(2)分解剂
AH2SO4和K2SO4的添加量
有机无分解需要H2SO4量,H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同,如果试样含脂类高,则加H2SO4多,为了提高分解温度,要大量添加K2SO4,但不能太多,也不能太少,太少则氨化不充分。
K2SO4和H2SO4的添加比例是:
1g样品K2SO4:
H2SO4=7g:
12ml
这种比例在国内外都使用,是公认的
还有一种比例:
K2SO4:
H2SO4=10:
20ml
B催化剂
用作催化剂的有Hg、HgO、Se,硒化合物,CuSO4、TiO2,对Hg,HgO有毒但结果好,Se与CuSO4得到结果是一种,TiO2,的结果偏低,采用不同的催化剂则消化时间不同,HgO消化麦子为38,Se与CuSO4消化麦子55,TiO2消化麦子70,所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。
(3)热源的强度
消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大,即便盐类K2SO4加得多,如果热源弱,也是没有意义的,热源过强导致H2SO4损失,使氨回收率低,另外K氏瓶的容量大小,颈部的粗细和长短等,也与热源的强度有关。
(4)氨的蒸馏和吸收及滴定
蒸馏有两种:
1直接蒸馏(装置简便,准确性好)
2水蒸汽蒸馏
蒸馏加NaOH是50%,加的量为H2SO4量的4倍,硫酸量为12ml,则NaOH为12×4=48ml,而且一般高于这个理论值,即加到50~55ml,如果NaOH量加的不够就变成H2S,H2S是强酸,使颜色变红。
吸收液有:
1标准H2SO4用标准碱返滴定,甲醛红指示剂
2硼酸用HCl进行滴定,混合指示剂
目前都用硼酸吸收液,用硼酸代替H2SO4,这样可省略了反滴定,H2SO4是强酸,要求较严,而硼酸是弱酸,在滴定时,不影响指示剂变色范围,另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收,为保险期间一般用4%。
〈6〉实验注意事项
a.样品应时均匀的,若是固体样品应事先研细,液体样要混合均匀。
b.样品放入K氏烧瓶时,不要黏附瓶颈上,万一黏附可用少量水缓慢冲下,以免被检样消化不完全,使结果偏低。
c.消化时,如不容易呈透明溶液,可将K氏烧瓶放冷后,加入30%过氧化氢催化剂2~3ml,促使氧化。
d.在整个消化过程中,不要用强火,保持和缓的沸腾,使火力集中在K氏烧瓶底部,以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失。
e.如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,这时会形成硫酸氢钾,而不与氨作用,因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时,要添加硫酸量。
f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色,如果没有溴甲酚绿,可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。
g.氨是否完全蒸馏出来,PH试纸检查馏出液是否为碱性。
h.向蒸馏瓶中加入浓碱时,往往出现褐色沉淀无。
这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应,生成氢氧化铜,经加热后又分解生成氧化铜的沉淀,有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。
i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。
2K氏微量定氮仪法
3K氏半微量定氮仪法(2、3原理一样)
操作方法大同小异,半微量法消化后,定容100ml,然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。
N(V2-V1)0.014
W*10/100
计算总氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100
对于微量定氮仪法,仪器有了改进,样液称样少,蒸馏消化液也少,其它基本一样。
4K氏自动定氮法
原理与上面一样,仪器,采用K氏自动定氮仪:
其装置内具有自动加碱蒸馏装置,自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置,消化装置:
由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。
二水扬酸比色法:
1原理:
样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后,在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物,可以在波长660nm处比色测定,求出样品含氮量,计算蛋白质含量。
2方法(1)标准曲线的绘制
取6个25ml容量瓶编号0123456
分别加空白酸液2ml
分别加磷酸盐缓冲液5ml
稀释至总体体积至15ml
分别加水扬酸钠5ml
37C水浴15分钟
加入次氯酸钠2.5ml
37C水浴15分钟
取出试液于660nm下进行比色,绘标准曲线。
(2)样品处理:
准确称样0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化剂→电炉上加热到沸腾后→加大
火力消化→直到出现暗绿色时→摇动瓶子→K氏瓶全部消化后→冷却→加水至250ml容量
瓶。
(3)样品测定:
准确吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→准确吸2ml→于25ml容量瓶中→加
5ml磷酸缓冲液→以下操作与标准曲线绘制的步骤相同
并以试剂空白微对照,测得样液的光密度,从标准曲线查出其含氮量。
(4)计算
C×F
含氮%=---------------------------×100
W×1000×1000
C---从标准曲线中查出测定样液的含氮量(Ug)
F---样品溶液的稀释倍数
W---样品重量(g)
pro%=总氮%×K(K可为6.25,也可查)
3注意事项:
A当天消化液最好当天测定,结果重现性好,如果样液改至第二天比色就有变化。
B当在PH和试剂适当范围内加入氯源后,颜色的显色和温度有关,应严格控制反应温度。
C这种方法测定结果基本与K氏法一致。
4试剂
(1)氯标液:
称经110℃干燥2h的硫酸铵0.4719g→于烧瓶中定容10ml→此液1ml相当于
1.0mg氮标液→使用时配制成1ml相当于2.50Ug氮标液。
(2)空白酸液:
称0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化剂→与样品一样消化→定容250ml→
使用时吸收此液10ml→加水至100ml为工作液备用。
(3)磷酸盐缓冲液:
称7.1g磷酸氢二钠→加38g磷酸三钠→加20g三九石酸钾钠→加400ml水
溶解→过滤→另称35gNaOH溶于100ml水中→冷至室温→缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中→加
入水稀释至1000ml备用。
(4)水扬酸钠溶液:
称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠溶于200ml水中过滤,加水稀释
至500ml
(5)次氯酸钠溶液:
吸4ml安替富民液,用水稀释至100ml
5仪器
(1)分光光度计
(2)恒温水浴
三紫外分光光度法
1原理:
pro及其降解产物的芳香环基,在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收,在280nm下,光吸收与pro浓度(3~8mg/ml)成直线关系,因此,通过测定pro溶液的吸光度,并参照事先用K氏定氮法分析的标准样品,从标准曲线查出蛋白质的含量。
2试剂:
(1)0.1mol/l柠檬酸水溶液。
(2)8mol/l脲[(NH2)2CO]的2NNaOH溶液。
脲的2N氢氧化钠液
(3)95%乙醇
(4)无水乙醚
3仪器
(1)751型的紫外分光光度计
(2)离心机
4操作方法
(1)标准曲线的绘制:
准确称取样品.2.00g,置于50ml烧瓶中,加入0.1mol/l柠檬酸水溶液30ml,搅拌30分钟使其充分溶解,用四层纱布过滤于玻璃离心管中,以每秒钟3000~5000转的速度离心10分钟,分别吸出上清夜0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml于6个10ml容量瓶钟,每个容量瓶,8mol/l脲的氢氧化钠溶液充分摇2分钟(如果离心再次离心),取透明液于比色皿中,在280nm下测定其吸光度。
(做参比值)
以事先用K氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量微横坐标上面的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
(2)样品测定
准确称取试样1.00g→于50ml烧杯中→加0.1mol/l柠檬酸溶液30ml→搅拌10分钟→四层纱布过滤到离心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容,摇匀后于280nm下测吸光度,从标准曲线上查出pro的含量。
计算:
蛋白质=C/W× 100
C----从标准曲线上查得的pro含量(mg)
W----测定样品溶液相当于样品量(mg)
说明:
a.此法运用于糕点,牛乳和可溶性pro样品,测定糕点时,应把表皮颜色去掉。
b.温度对pro水解有影响,操作温度应控制在20~30℃。
四双缩脲法-皮尼克法
1原理:
双缩脲在碱性条件中,能与CuSO4结合成红紫色的络合物。
pro分子中含有肽链与双缩脲结构相似,也呈此反应。
本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的pro含量。
但作为铜的稳定剂,酒石酸钾钠比甘油好些。
小麦粉中的pro能直接地一边抽出一边进行定量。
2试剂
⑴甘油作为稳定剂:
取10ml10NKOH溶液,3.0ml甘油加到937ml水中,激烈搅拌,同时加入4%CuSO450ml。
⑵酒石酸钠作稳定剂,吸10ml10NKOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中,激烈搅拌,同时加入4%CuSO4液40ml。
配制以上两种溶液、试剂,必须澄清,无氢氧化铜生成,否则重配。
3方法:
样品测定
标准曲线绘制
准确称0.6g样品→使用试剂
(1)
准确称0.5g样品→使用试剂
(2)
假如用试剂
(2)
(1)准确称样→0.5g→于80ml离心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸钾钠稳定剂→盖上盖子离心10min(4000转/分)→放置1小时→吸混合液15ml→于20ml离心管中→离心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm处测定吸光度,从标准曲线上查出pro含量。
(2)标准曲线绘制
按样品测定方法,根据样品中pro含量,取离心澄清样液0.02.04.08.010.0ml于10ml容量瓶中→分别加水定容,按照样品测定其吸光度。
事先用K氏定氮法测定样品中pro含量为横坐标,以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
4计算:
蛋白质%=C/W×100
C----从标准曲线上查得得pro含量(mg)
W----测定样液时相当于样品重量(mg)
氨基酸总量测定
蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分,如水解后的产物经胨,肽等最后成为氨基酸,氨基酸是构成pro最基本的物质。
水解后的pro和水解前的pro在物理特性,化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的,其差别与水解的程度有密切关系,分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度,也就可以评价食品的营养价值。
氨基酸不是单纯的一种物质,用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵,不能普遍使用),对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中,所以需要测定总的氨基酸量,它们不能以氨基酸百分率来表示,只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸态氮)的百分率表示,当然,如果食品中只含有一种氨基酸,如味精中的谷氨酸,就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。
食品在评价蛋白质的营养价值时,除了测定pro的含量,氨基酸氮含量,还需要对各种氨基酸进行分离,鉴定,尤其对8种人体必需氨基酸进行定量定性分析。
一.单指示剂甲醛滴定法:
1原理:
氨基酸具有酸,碱两重性质,因为氨基酸含有-COOH基,而-COOH基显示酸性,又含有-NH2,-NH2则显示碱性,由于-COOH基和-NH2的相互作用,使氨基酸成为中性的内盐,当加入甲醛溶液时,-NH2与甲醛结合,其碱性消失,破坏内盐的存在,就可用碱来滴定-COOH基,以间接方法测定氨基酸的量,反应式以三种形式存在。
用碱完全中和-COOH基时的PH值为8.4~9.2。
2试剂:
(1)40%中性甲醛溶液:
以百里酚酞作指示剂,将甲醛用1NNaOH溶液中和(淡兰色)。
(2)0.1%百里酚酞乙醇溶液。
(3)0.100NNaOH标准溶液。
3操作步骤:
称约含20mg左右的氨基酸→于烧杯中(如为固体样加水50ml)→加两滴指示剂→用0.1NNaOH溶液滴定到淡兰色→加中性甲醛20ml→摇匀→静置1分钟→此时兰色应消失→再用0.1NNaOH溶液滴定淡兰色,记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。
计算:
氨基酸态氮=(N×V×0.014×100)/W×100
二.双指示剂甲醛滴定法
1原理:
与单色法相同,只是在此法中使用了两种指示剂,从分析结果看,双指示剂甲醛滴定法与
亚硝酸氮气容量法(此