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分子生物学文献翻译剖析
在旱地土壤中产甲烷古菌活性对养牛业的影响
维维安radl1,5，安德烈亚斯gattinger1,5，艾莉卡时ˇ一´可娃´2,3，安娜NEˇmcova´2,3，Jiri Cˇuhel2,3，米洛斯拉夫的ˇimek2,3，让查尔斯munch1,4，迈克尔schloter4和Dana elhottova´2
1土壤生态学，慕尼黑工业大学，上施莱斯海姆，慕尼黑，德国；2生物中心，土壤生物学研究所，Cˇ艾斯克´不得ˇjovice，捷克共和国；3生物科学，南波西米亚州大学，Cˇ艾斯克´不得ˇjovice，捷克共和国；4gsf国家研究中心环境与健康，土壤生态，Neuherberg学院，德国。
在本研究中，我们测试的假设是动物的行走与作为越冬牧场土壤中的甲烷有机物有关。
因此，捷克共和国指出，在波西米亚南部的一个农场中，甲烷排放量和产甲烷菌种群对牛有不同程度的影响。
在春天，甲烷排放与动物影响的梯度相一致。
分析应用磷脂，该古细菌量最高的影响，发现部分（SI）对其有影响，其次是温和的影响（MI）没有影响。
对于产甲烷菌的实时显示甲基辅酶M还原酶（MCRA）基因的定量PCR分析观察到了相同的趋势。
检测单不饱和脂肪酸异戊烯基侧链的碳氢化合物（i20:
1）表示的乙酸分解的存在影响牛产甲烷菌。
这个结果是由mcrA基因序列分析证实得到的，这表明，所分析的克隆的33%属于甲烷。
克隆序列的大部分（41%）与未培养瘤胃有关。
由此可得到的假设是，相当大的一部分来自放牧本身产生甲烷的区域。
相比于春天采样，在秋天，古细菌的生物量和mcrA数显著减少主要用于截面MI基因观察。
可以得出结论，5个月后没有牛的影响，严重影响了部分保持其产甲烷的潜力，而在温和的冲击后甲烷生产潜力。
期刊名称（2007）1，443，452–；DOI:
10.1038/ismej.2007.60；网上公布19七月2007
学科类别：
微生物生态学和自然栖息地的功能多样性
关键词：
多样性；甲烷排放；甲基辅酶M还原酶
引言
农业对于在土壤和植物生物量的二氧化碳（OCA，2006）气体减排和系统隔离提供了巨大的潜力。
在这方面，山地草原在低投入农业系统中被认为是作为温室气体甲烷（CH4）（胡¨tsch等人。
，1994）和只有微弱的来源的氧化亚氮（N2O）（莫西尔等人。
，1991）。
然而，当草原用作牧场放牧时这些减排潜力可以改变。
例如，克莱顿等人（1994）发现，
一个放牧的牧场的N2O排放量比不放牧的草地高三倍，并且推测踩踏和排泄的相互作用会刺激这个过程。
动物踩踏时通过土壤压实造成土壤通气减少，从而增强的反硝化率（menneer等人，2005）。
此外，踩踏可以使丰富的有机碳物质从粪便进入土壤，刺激微生物代谢，从而增加在较低的土壤深度氧的需求（Sˇimek等人，2006）。
厌氧环境和可用的有机碳可能有利于甲烷碳。
事实上，一些研究表明，在施用有机肥后，甲烷排放量的时间会增加。
虽然在畜牧业中甲烷通量变化对土壤强度有影响，在这样的环境中的古菌群落中，甲烷的结构和功能的数据可能会丢失。
因此，这一客观研究的目的是确定畜牧业中对甲烷排放量对土壤的丰富性和多样性在产甲烷社区室外越冬的影响。
特别是，对以下假设进行了测试：
（1）牛越冬放牧导致土壤功能的变化，可导致甲烷的排放而不是甲烷的下沉，
（2）排放量与动物的影响有关及（3）牛的粪便作为瘤胃产甲烷菌接种和刺激土传病原菌的生长和活动。
对于产甲烷古菌生物量的特征，我们使用了磷脂（PLEL）方法（gattinger等人，2002，2003年）。
该方法的分类分辨率相对较低，但其坚固性对不同土壤基质不一样，这已被证明（白等人，2000；瓦辛格尔。
等人，2000；瓦格纳等人，2005）。
此外，实时定量PCR和克隆库的分析甲基辅酶M还原酶（MCRA）基因，这对甲基辅酶M还原酶的A亚基编码，进行了更详细的调查研究对于产甲烷的结构。
这种酶催化还原甲基辅酶M导致释放甲烷（埃等人，1988）。
mcrA基因的存在限制产甲烷古菌（thauer，1998）；因此，它的数量作为一个土壤中的产甲烷生物量估算。
在本研究中，我们表明，在越冬时使用的急剧变化的草原土壤的性质，这反过来又影响土壤产甲烷菌的数量和活性。
材料和方法
试验场
在南波西米亚捷克共和国（纬度481520N，东经141130E）对位于博罗瓦农场附近过冬的牛进行了调查。
约4公顷的面积已被约90头母牛从1995年（详情见ˇimek等人，2006）用于越冬（十月/十一月至四月/五月）。
土壤是沙质壤土，分类为雏形土，含有60–80%砂，14–32%淤泥和6–14%粘土（根据美国农业部的分类系统）。
植被是一种多年生的混合物草，三叶草和其他双子叶植物。
长期平均年降水量是650mm和年平均气温71C（从位于气象站7公里实验农场测得的数据）。
在冬季结束的时候（4月至5月），有一个由于对畜牧业的可见梯度的影响。
对越冬场所的影响程度与整个牧场不相同。
我们研究了这种梯度的三个部分：
最受影响的地区位于牲口棚的附近（有1/4严重影响），影响较小的区域是梯度的中间部分（有1/4温和的影响）和不受影响的地区在越冬区的相对侧（部分1/4没有影响）。
在春天，研究区域的特点如下：
硅完全被植被破坏，通过粪便破坏了土壤结构和饱和度；温和的影响是通过部分植被破坏和保留了土壤表面的粪便；影响小的是通过覆草和保留了不可见的粪便。
甲烷通量的测量和土壤取样
该实验进行了两次，在春季（2005年5月11日），从动物从越冬区域移在秋季（2005年10月18日），从它们回来之前。
在每个区域的不同部分随机选择了一些区域进行了气体流量测量和土壤取样独立的区域可以重复在这项研究中。
甲烷通量决定在中间部分使用（断面积0.076m2，体积15dm3 ）。
在测量之前立刻推进到土壤3厘米处。
每个区域有一个橡胶隔膜立即插入之后进行安装。
顶部的气体样品在60分钟后被收集在室内。
初步调查显示，气体浓度在封闭区域是线性增加的。
在每个部分采集九种气体样品，存储在预先抽真空的3.5ml的小玻璃瓶中，立即送到实验室进行分析。
使用惠普5890系列II气相色谱仪（休利特帕卡德，帕洛阿尔托，CA，USA）装备用2M PorapakN列在7501c，和火焰电离检测器进行甲烷数量的测定。
仪器的校准用CH4的标准混合物，对于甲烷气体从玻璃瓶转移时的损失其结果正确的。
与气体采样相比较，真实的土壤样品是从四个区域获得的（0–20厘米深），通过采集七个附属样品，从直径为3厘米的土壤区域随机采取。
土壤立即通过5毫米的网格进行均匀化筛分。
对样品进行核酸和磷脂的分析并立即分别存储在 801c和41。
由于在分析的这些区域观测到很不均匀，因此重复测量了大多数气体。
土壤分析
在1051度进行干燥，土壤的PH值使用在1:
2.5（w/w）土壤/水悬浮液中的玻璃电极测量。
土壤中的无机氮（NH4þ，NO3）通过从1M氯化钾提取使用的土壤（新鲜现场潮湿的40克溶液比：
200毫升（ZBı´RAL等人，1997）测量。
总有机碳测定采用重铬酸湿式氧化法（杰克逊，1958），采用凯氏定氮法测定总氮含量（ZBı´RAL，1995）。
总生物量和古细菌的测定
采用PLFA法和PLEL法
从新鲜土样中提取的脂类相当于10克干重（干重），根据布莱–代尔方法描述（zelles和白，1993）。
由此产生的脂质材料分离成中性脂质，糖脂和在二氧化硅的磷脂键合（spe-si；BondElute，分析化学国际，美国）分别通过洗脱氯仿和丙酮甲醇。
磷脂的等分试样分数相当于2.5克干重为磷脂脂肪酸（PLFA）分析。
在温和的碱性水解后，oravecz等人进行了详细描述（2004年），所得到的脂肪酸甲酯利用自动识别系统在毛细管气相色谱分离（Agilent6850，氢火焰离子化检测器，tsba50，MIDI公司，纽瓦克，德，美国）。
另一部分的磷脂馏分相当于7.5克土壤干重采用PIEL法分析根据gattinger等人的分析（2003年）。
在乙醚核心脂质形成后，醚连接类异戊二烯释放后裂解醚键与HI和还原脱卤
在冰醋酸锌。
由此产生的类异戊二烯烃溶解在100毫升标准溶液内（十九烷甲基酯）进行气相色谱-质谱联用在操作条件进行了光谱分析（gattinger等人，2003）。
PLFA / PLEL个别化合物数据（用1 nmol克土壤干重表示）被添加到获得的总磷脂浓度链，土壤中微生物总量（zelles，1999）。
PLFA/PLEL化合物总浓度磷脂链的百分比表示，给出了一定微生物组的相对丰度估计（zelles，1999）。
以下简称为不同PLEL派生的类异戊二烯烃：
i20:
0表明饱和和单不饱和i20:
120个碳原子的类异戊二烯链i40:
0；表示一个类异戊二烯链的40个碳原子。
从土壤中提取DNA
从500mg土壤中提取DNA被格利菲斯等人描述（2000年）。
提取物的数量和质量采用分光光度法测定（纳米微滴，peqlab，埃朗根，德国）。
实时定量PCR的mcrA基因
实时定量PCR（qPCR）在ABIPRISM7700序列检测系统进行（珀金埃尔默，福斯特市，CA，USA）。
反应混合物含有5毫升的qPCRROX和GoGreen（qbiogene，伊尔基希，法国），1.5毫克牛血清蛋白（西格马-奥德里奇，德国），每种物质5mol（卢顿等人，2002），5%二甲基亚砜（西格马-奥德里奇，斯德海姆，德国），0.5毫升的DNA模板和水的最终体积25毫升。
由初始951度变性15min和941度变性1min4放大到在721度 和521度各 1分钟。
标准曲线是通过使用10倍的稀释部分稀释马氏甲烷八叠球菌mcrA基因序列建立的。
计算出的PCR扩增效率使用的数据来自标准曲线和下面的公式：
[10（_1/slope）]_1。
DNA的提取物质影响废弃物质，对每个样品进行稀释。
每个样品进行四个独立的测定。
通过放大熔融的PCR产物的质量曲线和确认用1.5%溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。
mcrA基因的克隆和测序
从第四提取物中提取五十微克的复制为模板对于mcrA基因的扩增。
对以上所描述的反应进行了混合和放大，除了聚合酶以外（Taq聚合酶，Invitrogen公司，卡尔斯鲁厄，德国）。
纯化的PCR产品从四个重复汇集和克隆TA克隆试剂盒（Invitrogen公司），按照制造商的说明。
反应中PCR产物中Ca 50纳克，缓冲液1毫升，2.5毫升的无菌蒸馏水，2毫升矢量（PCR2.1）和T4连接酶1毫升。
白色的殖民地，包括插入，接种50 MLML 1卡那霉素Luria–金氏培养基，一夜之间长大和用于质粒分离（Qiagen质粒抽提试剂盒，QIAGEN，希尔登，德国）。
插入质粒选择正确的大小用EcoRI消化后（MBI fermentas，维尔纽斯，立陶宛）。
随机挑取五十四个克隆并在ABI3730 DNA测序仪测序，使用BigDye终结者化学（应用生物系统，福斯特市，CA，USA）根据制造商的说明。
推导出的氨基酸MCR的A亚基的序列（141位）是利用程序expase对齐分析。
计算距离阵使“protdist”（PHYLIP：
http:
//evolution.genetics.washington.edu/ PHYLIP.HTML）和PAM Dayhoff 001矩阵作为氨基酸替代模型。
系统发育推导的MCR序列聚类分析使用邻接距离矩阵重构和物种的输入的随机分析。
1000集的bootstrap值进行计算。
对于一个社区样品完整性的估计，稀疏曲线生成使用该软件分析稀疏（http:
//www.uga.edu/~strata/software/Software.html）。
推导了氨基酸序列表明超过98%相似性被认为是一个操作分类单元（OTU）（juottonen等人，2006）。
获得的序列被提交给国家生物信息数据库和中心，可以在下面找到评价数：
DQ994833–dq994886。
统计分析
所有的统计分析采用SPSS软件版本12（SPSS公司，芝加哥，IL，USA）。
方差分析（ANOVA）进行确定治疗之间的意义其次是所有成对多重比较程序（学生––纽曼柯二氏试验）。
Kruskal–沃利斯单向anovawas应用情况数据分布的正态性检验失败。
结果
通常土壤特性和CH4通量
表1是三部分土壤性质的研究。
各部分所有的变量表现出显著的差异。
有机碳（Corg），总氮（NT），铵（NH4þ）和和pH梯度从NI到MI依次增加，清楚地反映了排泄物对牛的影响。
SI部分比其他部分表现出更高的总磷脂浓度。
在春天观察到三部分的差异比秋天采样（牛前进入该地区）更为明显（牛离开越冬区之后）。
表2是CH4的现场测量排放量。
在两个采样中，CH4排放量对三个部分牧场上动物的影响不同，在Si区最高和在Ni区最低。
Ni区甚至出现了一个甲烷汇集。
然而，该区域的差异只是在春天统计的采样中显著。
甲烷排放量的测定Si和MI区域在秋季比春季低。
古细菌的生物量
从Si区到Ni区古细菌的浓度有所下降（图1a）。
在春天，PLEL浓度从28下降到0.5nmol PLEL类异戊二烯G 1土壤干重，在从28下降到1 0.7nmolg 土壤干重的同样是真实的相对古细菌数量（%值），其最高值观察到在Si区域（5.3%和4.7%）和最低值在Ni区域（0.4%和0.7%）。
绝对和相对的古细菌在Si区保持相当恒定的数量，而观察到部分是一个显著的减少的在Mi区域从春季到秋季采样。
对于所有的样品，i20:
0是最丰富的，这是一个普遍的Euryarchaeota生物标记（gattinger，2001）。
i20:
1异戊二烯链，以前检测过（gattinger等人，2002），检测在大量的粪便（数据未显示），Si区域样品（春季和秋季）和Mi区域样本（只有春天）。
产甲烷菌的数量和多样性
McrA基因的量化作为古PLEL浓度（图1b）透露了类似的模式。
在SI区域，每克的d.w.土壤的目标分子数目介于3.8和4.2106副本，明显高于在其他区域中观察到的。
对于MI和NI区域，每克d.w.土壤有4.9和2.3105分子，在春天分别检测。
在秋天，这种值下降，而且每克大约低于检测限的1000个目标分子在d.w.土壤中。
随后qPCR逐步稀释，土壤DNA揭示没有源萌发抑制物质聚合酶链反应在原始核酸提取物（数据没有显示）。
继qPCR和PLEL的结果，在SI区域只有mcrA基因片段，在克隆和测序时有较明显的甲烷。
对于这种分析随机的选择了五十四种克隆。
少数的分析表明克隆数量可以覆盖mcrA的多样性。
McrA无性系的系统发育分析揭示存在的两个主要聚集（图2a）。
第二组属于培养产甲烷菌的序列。
绝大多数在此群集放映序列分别为Methanothermus、Methanosaeta和甲烷八叠球菌和代表15%、11%和33%的分析序列（图2b）。
仅从落后瘤胃甲烷菌的群集包含了有序列。
从SI区域的二十二个序列（总数的41%，图2b）和三个序列从落后瘤胃正在形成此群集。
图1（a）和（b）
图2（a）和（b）
探讨
旱地土壤，包括草原土壤，通常描述温室中的甲烷气体（胡¨tsch等人，1994；卡斯塔尔迪等人，2007）。
然而，在本研究中，饲养在越冬牧场牛可能导致在土壤性质的巨大变化，主要是由于排泄物的回收和踩踏（oenema等人，2001），这反过来又刺激甲烷的产生。
在春天，动物从牧场移除后，微生物生物量，SI区域的有机碳和氮总值均高于MI和NI区域，显示了土壤性质的变化程度和土壤微生物群落之间明确的影响。
虽然，在秋天（5个月后的动物被移除）量值在SI区域较高，明确的观察MI区减少。
herna´费尔南德斯等人（2007）和合作者推测，动物粪便刺激土壤微生物生长，然而高投入是维持微生物生物量含量升高的必要环节。
古细菌生物量的测量显示与总的微生物生物量中观察到的趋势相同。
在NI区域，PLEL的浓度为0.6和0.8 nmol克干物质在秋天贡献0.4%和0.7%的总磷脂。
这些值的范围先前报道的数据是从有光的或未精耕地土壤中获得的（gattinger等人，2002）。
在SI区域，价值远远超过确定的范围到目前为止任何陆地（gattinger等人，2007）或湿地土壤（白等人，2000；瓦辛格尔等人，2000）。
瓦辛格尔等人（2000）表明，古细菌数量反映原位和体外CH4生产/排放的潜力，即使线性相关无法建立。
这个结果不令人惊讶的是古生物量是不可能作为甲烷的理想指标，仅仅是一个社区的一部分能带动这一过程。
mcrA基因提供了进一步的测定来检测古细菌的功能。
到现在为止，没有已报道的mcrA基因量化的数据在陆地环境，在这方面比较难做。
然而，它必须考虑到所测得的值可能是所使用的引物和核酸的提取效率（夏尔马等人，2007），虽然一些协议进行了测试使用的土壤从相应的农场样品中，表明本研究所选择的协议是最高和最可重复的值。
因此，它是非常重要的定量数据。
第二，独立的PCR标记，这显示出类似的趋势相比分子数据。
总的来说，mcrA基因数表现出相同的趋势被描述为古细菌的磷脂中的在SI最高值和在Ni和最低的部分。
同时减少了PLEL浓度在MI区域从春季到秋季采样，减少mcrA基因拷贝数的下降。
此外，虽然能提供准确的诊断每单位土壤基因数的测量，它是将这些值转换成细胞更难密度和生物量或土壤质量和土壤体积的关系。
一个转换细胞密度需要复印基因组数和基因组的大小（夏尔马等人，2007）。
mcrA基因的定量可能好于古甲烷生物量的指标；然而，它不仅代表了潜在的的社区，也基于DNA水平。
这种说法可以由秋天分析证实对于SI区域，其中产甲烷量值仍然很高，即使一个严格的减少甲烷排放量的观察。
系统发育分析表明存在不同的产甲烷在SI区域。
大多数的检测甲烷类群也发现在施用牛粪耕地土壤（gattinger等人，2007）。
约41%的序列形成了一个单独的集群表现出密切的关系（97%基于DNA序列）对未培养瘤胃（龙冈等人，2004）。
此外，33%类似，这是众所周知的在牛瘤胃中出现（贾维斯等人，2000）。
因此，相当大的一部分检索到的克隆可以被认为是SI区域作为典型的瘤胃殖民者。
血脂正常出现在甲烷八叠球菌膜（i20:
1侧链；gattinger等人，2002）也被检测到大量的新鲜粪便取样从越冬区（数据未显示）。
PLEL在两个取样分析最高显示完成脂质的浓度在SI区域。
这些研究结果支持这一假说即牛的粪便的产甲烷菌可以转移到草地土壤。
在另一方面，一般被认为是有些无处不在的产甲烷菌的发生是在有氧和缺氧的温带土壤区（利德斯等人，2001；Ramakrishnan等，2001）。
在NI区域，这些血脂也被检测到，虽然量少。
结合从物化所获得的数据，甲烷排放，磷脂核酸分析提供了有力的证据对以下现象：
越冬期间，牛的大部分时间呆在SI区域，在那里他们排泄粪便。
作为一个尿液输入结果，土壤pH由弱酸性上升至碱性。
pH8被称为是最佳的产甲烷菌的活性（比曼和suflita，1990）。
提供的从牛易得的有机物粪便，土壤产甲烷菌如甲烷SPP被刺激生长和活动。
此外，迄今未知的，rumenborne古细菌随着从已知的产甲烷的代表组包括甲烷物种从牛肠道转移到土壤。
在陆地栖息地，这些微生物会发现生长和产甲烷活动的条件。
类似的现象也描述了用于接收大量耕地土壤牛粪（gattinger等人，2007）。
然而，在这种情况下，甲烷排放量远远较低，大概是因为显着的甲烷氧化活性。
对于低的甲烷氧化活性结果不明显。
在一方面，它是已知的，高浓度氨，起源于我们的实验牛尿的，可以抑制甲烷氧化（胡¨tsch等人，1993；快和王，1994）。
另一方面，可以说土壤中铵和甲烷是如此之高，甲烷氧化菌不受高浓度铵抑制，即使遭受氮的限制，从而降低了他们的活性（Chan和帕金，2001）。
此外，在SI区域，厌氧微生动物增加所致踩踏和排泄物，也可能影响本微生物组。
在任何情况下，甲烷氧化低亲和力甲烷氧化菌、厌氧甲烷氧化可以发挥重要的作用在SI区域。
然而，目前的研究还没有解决这个方面。
对于中度影响的MI区域，我们假定发生同样的现象，但是在一个较小的程度上。
只有在春天，在牛离开越冬区，一个重要的产甲烷生物量被观察到，如所表示的mcrA基因数量高。
这大概是因为发生了合适的土壤生态特性（pH值和有机C），导致一个独特的产甲烷。
然而，6个月后没有牛的影响，产甲烷量下降基因检测不到，mcrA随着pH值和有机C含量明显降低，这与NI区几乎相同。
由于土壤特性的变化，一个甲烷排放很小的观察在MI区域进行在春季采样。
相反，在Si区域，甲烷区持续的生物量，通过丰富的mcrA基因表示，在6个月的牛释放期间。
有机碳和pH值保持在高水平提供合适的栖息地产甲烷古菌。
然而，通过假设（Plaza等人，2007）和合作者，高易降解有机物含量引入了在土壤中通过动物的排泄物，这在增加微生物的活动。
一旦这种营养源不再可用，在新的环境条件的适应和减少代谢活性。
此外，丰富的厌氧菌的磷脂的生物标志物在春天比秋天高，由于整体的氧气供应可能改变在春天复苏的压实的土壤。
然而，SI区域表现出强烈的聚集物的形成在夏季（数据未显示）。
这是不是令人惊讶的高pH值和高碳土壤的浓度是已知的Boix—fayos等人，2001）。
牛的影响对土壤团聚体形成的粪便是众所周知的（削等人，1999）。
不仅碳含量高本身也由此增加微生物生物量和活动可以促进土壤聚合（Martens和弗兰肯伯格，1992）。
在集料内部，具有低的氧浓度可能是产甲烷微生物良好的栖息地在夏天这种生存条件是不利的。
在MI区域，植被恢复在牛的释放期是非常明显的。
显然，产甲烷古菌是不是很适应。
为了澄清微生物活性和甲烷的生产之间的关系，mRNA研究表明基因的诱导用mcrA表达是必要的。
结果这项研究是基于DNA的研究反映更多的遗传潜力比实际的活动。
可以得出结论，至少在6个月没有牛的影响，以前的严重的受影响的部分保持其产甲烷，而产甲烷受到温和的冲击影响。
致谢
本研究由DAAD学术交流中心资助（德国学术交流计划）由捷克共和国的教育（lc06066）资助在捷克共和国科学院社（iaa600660605）的生物学中心的研究计划，土壤生物学研究所（AV0Z60660521）。
V的ˇlajchrtova´，E扎达´可娃´和科妮galonska进行了野外工作和室内分析。
感谢Kamı´r先生和夫人锦ı´R允许访问的实验图和他们在该领域的重要支持。
我们也要感谢两位匿名审稿人有帮助的意见。
参考文献
BaiQ,GattingerA,ZellesL.（2000）.Characterisationofmicrobialconsortiainpaddyricesoilbyphosholipidanalysis.MicrobEcol39:
273–281.
BeemanRE,SuflitaJM.（1990）.Environmentalfactorsinfluencingmethanogenesisinashallowanoxicaquifer:
afieldandlaboratorystudy.JIndMicrobiol5:
45–57.
Boix-FayosC,Calvo-CasesA,ImesonAC.（2001）.InfluenceofsoilpropertiesontheaggregationofsomeMediterraneansoilsandtheuseofaggregatesizeandstabilityaslanddegradationindicators.Catene44:
47–67.
CastaldiS,CostantiniM,CenciarelliP,Ciccio
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