革兰氏染色的机理和步骤.docx
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革兰氏染色的机理和步骤
1.革兰氏染色的机理和步骤
机理：
G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。
主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。
G+的CW:
肽聚糖层厚，脂质含量低。
乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。
G-的CW：
肽聚糖层薄，脂质含量高。
乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。
步骤：
①涂片：
在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。
②固定：
将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。
③初染：
用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。
④媒染:
以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。
（细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用）
⑤脱色（关键步骤）：
以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。
⑥水洗，吸干。
⑦复染：
?
?
（第2张）复染30s，水洗吸干。
⑧干燥镜检。
2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。
芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。
3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。
答：
培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。
（第2张中的图）
还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N低，经培养基后PH明显上升。
PH调节：
①加入缓冲剂--------常用:
一氢二氢磷酸盐，K2HPO4呈碱性，KH2PO4酸性，只在一定的PH范围内调节（6.4--7.2）
②大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。
③培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。
④过酸：
治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源：
NaNO3、Pr、NH3·H2O；增加通风量。
⑤过碱：
治标-----H2SO4、HCl中和，治本----加适量碳源:
G类，脂类;减小通风量。
3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？
抗生素法（青霉素法）：
适用于细菌。
原理：
青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B在基本培养基上休眠状态存活下来，从而达到浓缩营缺型目的。
制霉菌素法适用于真菌，其可与cm上？
（第1张）醇作用，引起cm损伤，因为它只能杀死生长繁殖着的真菌，所以......
菌丝过滤法:
基本培上，野生型霉菌，？
菌的孢子能萌发并长成菌丝，而缺型孢子一般不萌发，或不能长成菌丝，因此培养一段时间后，用灭菌脱脂棉或滤纸滤去菌丝，收集滤液，重复数遍后可除去大部分野生型，从而……
4、生产蛋白酶的枯草芽孢杆菌发生遗传变异，使得产量性状下降，你如何解决？
写出具体实验方案。
答：
将一定量的枯草芽孢杆菌培养液，做一定浓度的稀释，涂布在含有酪素蛋白质的基本培养基上，37°C培养一段时间后，取出培养基，观察单菌落形成的透明圈大小，取透明圈直径与菌落直径之比较大的菌落，挑取培养做进一步的鉴定，即可得到高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌。
5、以磺胺为例，说明化学治疗机的作用机制。
答：
机理:
磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，（磺胺类药物取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢紊乱，从而抑制B生长），磺胺的抑菌作用是因为许多细菌需要自己合成叶酸而生长，磺胺对人体细胞无毒性，因为人体缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶-----二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。
（磺胺类----与正常代谢产物竞争酶的活性中心，干扰了酶的功能，从而干扰代谢的正常进行）。
6、画出生长曲线。
（第1张）
1、微生物的共性？
哪个最基本?
答：
①体积小，面积大（最基本）②吸收多，转化快③生长旺，繁殖快思适应性强，易变异⑤分布广，种类多。
2、比较G+，G-B在CW结构，组成，对溶菌酶，青霉素的敏感性4方面的异同点。
结构
成分
对溶菌酶
青霉素
G+
单层，组分简单，厚
肽聚糖（90%）磷壁酸（10%）
敏感
生长期的G+对其敏感
G-
多层，组分复杂，薄
内壁层：
肽聚糖外膜：
脂多糖，磷脂，脂蛋白
敏感
不敏感
3、表型延迟现象？
如何克服？
答：
表型延迟：
表型的改变落后于？
（第四张）改变的现象，分为
①分离性延迟;突变的？
经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。
②生理性延迟;杂合状态→纯合状态，仍不能表现出来，（如营缺型）通过中间培养（CM，培养过夜），可使突变？
稳定下来，克服表型延迟。
4、培养B常用的斜面培养基是什么？
简述配制程序。
答：
牛肉膏蛋白胨培养基
①称量;按配方依次准确称量②融化:
取少量水于烧杯中，加1%的蛋白胨，加热溶解，加0.5%的牛肉膏，加热溶解，加0.5%的NaCl,热熔，加水补充到所需体积。
③调PH至7.6左右。
④加琼脂固体2%，热熔。
⑤分装入试管，加塞，包扎，高压灭菌⑥搁置斜面（斜面长度不超过试管一半）⑦无菌检查：
将灭菌的培养基放入37°C的温室中培养24-28h，以检查灭菌是否彻底。
5、啤酒酵母在分批发酵中的生长曲线分哪几个时期？
在菌种扩培时，哪个时期做种子？
为什么？
答：
延滞期，对数生长期，稳定期，衰退期。
对数期做种子。
利于缩短延滞期。
6、菌种衰退的根本原因？
防治措施？
答：
？
的自发突变。
措施：
①减少传代次数②创造良好的培养条件③采用不易衰退的菌种传代④采取良好的菌种保藏措施
4、菌种衰退的根本原因，防止措施。
如何区分衰退和饰变？
答：
根本原因：
？
的自发突变。
（②传代次数的影响，是负突变株比例占优势，③培养条件）
防止措施见上题。
区分：
衰退：
指随着菌体的不断生长，负突变菌株的数量占整个菌体数量的比例增大，最终导致菌株的生产性能大幅下降的现象。
①原有形态性状不典型，②生长速率下降③代谢产物生产力下降④对宿主侵袭力下降⑤抵抗力下降
饰变:
遗传物质结构不发生变化，而只在转录与转译水平上的表型变化，可以同一条件继续培养，观察子代的情况。
饰变特点：
暂时性，不可遗传性，表现为全部个体的行为。
变异：
遗传性，群体中极少数个体的行为。
5、gone？
突变的特点？
答：
①自发性②非对应性③稀有性（突变率10-6~10-9）④独立性⑤可诱发性（升高10~10^5倍）⑥稳定性⑦可逆性（原养型<=>突变型）
6、v（第三张）的特点。
答：
①形体微小，能通过细胞滤器（0.22um），电子显微镜下才能看见②不具有细胞机构，主要成分NA，Pr③V只含有一种核酸，DNA或RNA④无核糖体，即无产能酶系，也无Pr,NA合成酶系，专性活细胞内寄生⑤无个体生长，也不进行二分裂，以NA,Pr等“元件”装配，实现大量繁殖。
⑥离体下以无生命的生物大分子状态存在⑦对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。
7、？
月元病毒的致病机理。
答：
月元病毒是一种Pr侵染颗粒，仅有Pr组成，称作PrP。
细胞型PrP----PrP^c对蛋白酶敏感，无凝聚能力，而致病型PrP---PrP^sc对蛋白酶有一定抗性，可凝集成纤维状组织，PrP^sc进入细胞后，与PrP^c结合，形成PrP^sc---PrP^c复合体，PrP^c构型发生改变，转化成PrP^sc，PrP^sc数量呈指数增加，其潜伏期长，对中枢神经损害严重。
估菌计数法及其特点（笔记P31）
乳糖操纵子（P30）
1、
营养价值
融化温度（℃）
凝固温度（℃）
常用C（%）
琼脂
无
96
40
1.5~2.0
明胶
氮源
35
20
5~12
2、伴孢晶体？
它在何种B中产生？
答：
伴孢晶体：
苏云金芽孢杆菌等少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体（δ肉毒素）称为伴孢晶体。
对约200种昆虫无为鳞翅目幼虫有毒杀作用，可制成B杀虫剂。
3、霉菌菌落的特征？
答：
①质地疏松，呈絮状，网状，绒毛状，地毯状。
②形态大，分为局限性生长（青、曲）和蔓延性生长（根毛）③菌落干燥（孢子）
④颜色丰富，正反颜色常不一致，中心与边缘常不一致。
⑤各种霉菌，在一定培养基上，形成的菌落大小，形状，颜色相对稳定，为分类依据之一。
4、利用磷酸盐或碳酸钙如何维持PH稳定性？
答：
①磷酸氢二钾略呈碱性，磷酸氢二钾略呈酸性，两物质以等摩尔浓度溶液PH为6.8，其缓冲能力一般在6.4~7.2范围内有效。
磷酸氢二钾+H阳离子---->磷酸氢二钾+K阳离子
磷酸二氢钾+K阳离子+OH-→磷酸氢二钾+H2O
②大量产酸的菌株，加入碳酸钙调节，碳酸钙难溶于水，不会使培养基PH过度升高，但可不断中和微生物产的酸，同时放出二氧化碳，而降培养基PH控制在一定范围。
5、单倍体酵母细胞经?
?
（第5张）诱变后，得到一系列的突变株，欲从中分离筛选出一株（Leu-）,请设计合理的试验程序。
答：
淘汰型野生型→（制霉菌素法）→检出→鉴定（滤纸片法）
将单倍体酵母细胞突变株，制成菌悬液，均匀涂布于完全培养基上，长成单个菌落之后，以逐个检出的方式接种于完全培养基上，并影印到基本培养基上，在适宜条件下培养一段时间，在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的，即为营养缺陷型菌株。
将此菌株检出离心，水洗之后制成适当浓度的菌悬液，与基本培养基均匀混合后，倾注于平板中，干燥凝固之后，在板上划分几个区，在区中加入蘸有色AA的滤纸片，经培养后，在纸片周围有浑浊的生长圈的，说明为色AA营养缺陷株。
6、MR,V.P.实验的原理。
答：
MR：
用来检测由G产生的有机酸，如甲酸，乙酸，乳酸等，细菌代谢糖产酸，PH降低，甲基红指示剂由橙色（PH=6.3）变成红色（PH=4.2）
大肠杆菌---阳性：
利用乳糖产生乳酸，培养后PH<4.5
大肠杆菌---阴性：
早起产有机酸，后转化有机酸→乙醇，丙酮酸。
②V.P.用来测定细菌利用G产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。
丙酮酸经缩合→乙酰甲基甲醇（经碱性、氧化）→二乙酰。
二乙酰与蛋白胨中精AA中胍基作用，生成红色化合物，产气肠杆菌---阳性，大肠杆菌---阴性。
7、什么叫生长曲线？
单细胞微生物的典型生长曲线分几期？
划分依据？
答：
生长曲线：
将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得到一条反应在整个培养期间菌数变化规律的曲线。
分为延滞期，对数期，稳定期，衰亡期。
根据生长速率常数划分，即单位时间内分裂次数的不同。
8、为什么诱变时，要制成充分分散的单细胞或单孢子悬液？
对放线菌进行诱变育种时，宜处理其孢子还是菌丝细胞？
为什么？
答：
使每个细胞均匀接触诱变剂，减少表型延迟现象，并避免长出不纯菌落。
多使用单核无性孢子，由于孢子生理上处于休眠状态，单核区基中了大部分的DNA，减少分离表型延迟，提高突变效果。
培养基原则：
①目的明确②适宜的营养物质③浓度及配比合适④控制PH条件⑤控制氧化还原电位⑥原料来源经济节约⑦灭菌处理
1、青霉素的作用机制？
答：
原理：
β-内酰胺环的结构与肽聚糖单体五肽尾末端的D-Ala-D-Ala二肽结构相近，因而可竞争性的抑制转肽酶的活性，抑制单体间交联，形成缺损的CW。
青霉素对生长旺盛的G+有明显的抑制作用，对休眠期的无抑制，对G+的作用比G-强得多。
2、筛选抗代谢结构类似物突变株的意义是什么？
答：
在含有较高浓度终代谢结构类似物的培养基中，野生型细胞不能生长，而遗传性的解除了反馈抑制或反馈阻遇的抗代谢结构类似物突变株则能生长，突变株在终产物累积的情况下仍然可以不断合成这一产物，所以采取一定的方法，筛选到抗代谢结构类似物突变株，即可获得终产物的高产菌株。
3、酿酒酵母生活史。
（同P15）
4、烈性噬菌体？
生活史包括几个过程？
答：
感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并引起宿主细胞迅速裂解的噬菌体。
吸附→侵入→增殖（NA复制，Pr的生物合成）→装配（成熟）→裂解（释放）
5、缩短延滞期的措施
答：
①利用遗传学方法改变种的遗传特性，使延滞期缩短，②利用对数生长期的细胞做种子，③尽量使接种前后使用的培养基组成不要相差太大④适当扩大接种量
6、计算代时（G），繁殖代数（n），生长速率常数（R）
答：
见第七张
7、诱变育种？
举例①非电离辐射诱变剂②电离辐射诱变剂③烷化剂④插入诱变剂⑤间接引起碱基置换的诱变剂
答：
诱变育种：
指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后从中选取少数符合育种目的的突变株的方法。
①紫外线②x射线，γ射线③EMS，NTG④吖啶类颜料，ICR类⑤碱基类似物（5-BU等）
（直接引起：
①亚硝酸G:
C<--->A:
T,②羟胺:
只引起G:
C<--->A:
T③烷化剂G:
C<--->A:
T）
8、什么是鉴别培养基？
利用EMB培养正常大肠杆菌和沙门氏菌时，菌落现象？
为什么？
答;鉴别培养基：
用于鉴别不同类型微生物的培养基，在培养集中加入能与目的菌的无色代谢产物发生颜色反应的指示剂，从而用肉眼就能将该种微生物的菌落与外形相似的其他微生物菌落相区分的培养基。
伊红和美蓝在低酸度时结合形成沉淀，起产酸指示剂作用，大肠杆菌强烈分解乳糖而产生大量混合酸，菌落被染成深紫色，还可看到绿色金属闪光。
沙门氏菌不能利用乳糖，菌落无色通明。
1、微生物的产能方式有？
与食品发酵工业密切相关的微生物的代谢方式有哪几种？
答：
微生物产能方式分为：
发酵，有氧呼吸，无氧呼吸。
与食品发酵工业密切相关的发酵，实质是底物水平磷酸化，，底物氧化不彻底，产能水平低，为厌氧条件，兼性厌氧菌在有氧的条件下，从发酵→呼吸作用，对发酵作用抑制（巴氏效应）
2、高压蒸汽灭菌法的操作步骤和注意事项？
答：
步骤：
①取出内层锅，外层锅加水至与三角搁架相平②放回内层锅，放入带灭菌物品，加盖并将盖上排气软管插入内层锅③打开加热开关，并同时打开排气阀3-5Min④关上排气阀，温度升至121℃计时，控制热源119-123℃15-20min⑤关上开关，断电后压力降0开盖取物⑥无菌检查
注意；①切勿忘记加水，水量不可过少②三角瓶，试管口不要与桶壁接触③切勿忘记打开排气阀排锅内空气④压力降为0才能打开排气阀，开盖
3、培养基应包括哪几种营养物质？
如何控制PH？
答；碳源，氮源，能源，生长因子，无机盐，水
治标过酸----NaOH、NH3·H2O,过碱----H2SO4、HCl
治本酸---加氮源，增大通风量，碱----加碱？
（第8张）源，减小通风量
加缓冲剂：
加碳酸钙
4、如何延长对数生长期？
答;补充营养物质，调整PH，取走代谢产物，改善物化条件，调整营养配比，C/N比4/1时，菌体大量繁殖。
5、简述烈性噬菌体一步生长曲线制作过程，并绘制曲线图。
答:
适量噬菌体接种于培养好的高浓度敏感细胞中，②经数min吸附后，将培养物高倍稀释，或加入抗V抗血清，中和给定时间内未吸附的噬菌体，从而使因吸附噬菌体建立同步感染③适温下继续培养，定时取样，测样品中V的效价。
感染T横坐标，V效价纵坐标，绘制定量描述烈性噬菌体生长规律的试验曲线。
（曲线见第9张）
6、利用物理化学诱变剂对微生物进行诱变的目的有哪些？
中间培养的目的？
用简图表示利用EMS对微生物进行诱变育种的过程？
答：
诱变育种目的：
①获得高产菌株②抗性突变种③营养缺陷型突变株（检致癌物，高产次代产物）
中间培养为了克服表型延迟现象。
EMS（甲基磺酸乙酯）----烷化剂----直接引起碱基置换
（烷化后的碱基引起碱基配对错误，也能使嘌呤整体直接从DNA链上脱下来，产生一个缺口，在与缺口相对应的位点上，就能配上任何碱基，从而引起转换或颠换）
选择出发菌株→前培养，制作菌悬液→EMS合适剂量诱变处理→中间培养→初筛培养基涂布→划线分离→菌种鉴定
7、简图表示两亲株细胞（A+B-、A-B+）进行原生质体融合的操作示意图，并对主要步骤作简要说明。
答：
见第9张
常用培养基：
细菌---牛肉膏蛋白胨培养基（PH7-7.5）
放线菌---高氏1号培养基（PH7-7.5）
酵母菌---麦芽汁培养基（PH4.5-5,5）
霉菌---查氏合成培养基（PH4.5-5,5）
1、放线菌的培养：
28℃，3-5d，PH=7~7.5染色：
碳酸复红染1min
观察：
（链霉菌）菌落干燥紧密，正反颜色不一致，边缘有辐射状皱褶，小不蔓延，不易挑起。
2、酵母菌培养：
25~28℃，24h，PH=4.5~5.5，染色：
美蓝--活体染色
观察：
（酿酒酵母）菌落较B的大且厚，多为乳白色，表面湿润，粘稠，边缘整齐，易被挑起。
3、霉菌培养：
28℃，5~7天，PH=4.5~5.5，染色：
乳酸碳酸棉签染液。
观察：
见第10张
4、酵母菌①大小测定：
测微尺，酵母培养物制成水漫片，高倍镜测出宽长与目镜测微尺的格数，再乘以目镜微尺每格代表长度。
②计数：
血球计数板：
死菌+活菌总数，1ml总菌数=5中方格总数/5*中方格数*10^4*稀释倍数
平板菌落计数法：
只活菌
5、革兰氏染色:
机理+步骤（04真题①）
6、MR，V.P.试验（02真题⑥）
吲哚试验---检验水解色AA，水解色AA（经水解）→丙酮酸+吲哚
大肠杆菌---阳性，产气肠杆菌---阴性
柠檬酸盐试验----检测柠檬酸盐是否被利用
大肠杆菌---阴性（绿色），产气肠杆菌---阳性（蓝色）
硫化氢试验---是否分解含硫有机物
大肠杆菌----阴性，产气肠杆菌----阳性（黑色沉淀）
1、大肠杆菌Escherichiacoli食品卫生重要指示菌，合成VB，大肠菌素
2、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis淀粉酶，蛋白酶
3、苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensisδ-肉毒素，生物农药
4、酿酒酵母（真）Sacharomycescerevisiae酒类酿造
5、灰色链霉菌（放）Streptomycesgriseus链霉素
6、产黄青霉Penicillumchrysogenum青霉素
7、米曲霉Aspergillusoryzae酱，酱油
8、黑曲霉A.niger淀粉酶，柠檬酸
9、黄曲霉A.flavus蛋白酶
10、米根霉Rhizopusoryzae制曲酿酒，乳酸
11、总状毛霉Mucorracemosus腐乳，豆豉（强蛋白质分解能力）
属名：
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