分子生物学实验指.docx

分子生物学实验指.docx

《分子生物学实验指.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验指.docx（22页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

分子生物学实验指

DNA分离

核酸包括DNA、RNA两种分子在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。

真核生物的染色体DNA为双链线性分子；原核生物的"染色体"、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核自由RNA分子多数在3'端带有ploy（A）结构。

至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。

95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。

RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中。

RNA以rRNA的数量最多（80%~85%）,tRNA及核内小分子RNA占10%~15%，而mRNA分子只占1%~5%，mRNA分子大小不一,序列各异。

总的来说，DNA分子的总长度一般随着生物的进化程度而增大，而mRNA的分子量与生物进化无明显关系。

分离纯化核酸总的原则：

①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。

为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求,因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。

核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。

核酸的纯化应达到的要求：

①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时,应去除RNA分子，反之亦然。

实验过程中注意事宜:

①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；③减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。

机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌,使溶液快速地通过狭长的孔道；细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。

这些操作细节在实验操作中应备加注意。

机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。

对分子量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子,威胁相对小一些。

高温,如长时间的煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。

核酸提取过程中,常规操作温度为0~4℃,此温度环境降低核酸酶的活性与反应速率,减少对核酸的生物降解；④防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。

其中DNA酶,需要金属二价离子Mg++的激活,使用金属二价离子整合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、拧檬酸盐,基本上可以抑制DNA酶的活性。

而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活,所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。

核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸,去除盐类、有机溶剂等杂质,纯化核酸等。

核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。

对于在某特定细胞器中富集的核酸分子，事先提取该细胞器，然后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。

实验1样品处理～白细胞分离制备

采血液～0.5ml→加红细胞裂解液0.8ml→混匀，3000r/min～5000/min离心5min→弃去上清液→再加红细胞裂解液0.5ml→混匀，重复离心5分钟→如此重复数次，直至沉淀为白色（白细胞）备用。

或取lml新鲜抗凝血1500rpm离心l0min弃血清。

加入3~4倍体积的红细胞溶解液（RCLB）[10mmol/LTris-Cl（pH7.6）,5mmol/LMgCl2,10mmol/LNaCl]，3500rpm离心l0min,重复3次收集白细胞（白色沉淀）[若用生理盐水洗涤，再加入固定液（甲醇:

醋酸为3:

1）,可长期保存，用生理盐水洗涤白细胞,除去固定液，即可提取DNA]。

或2ml冻藏血中加入2mlPBS（PBS（0.8%NaCl、0.02%KCl、0.144%Na2HPO4、0.024%KH2PO4、pH7.4）,混匀,3500rpm离心l0min，弃去上清。

加入2mlRCLB混匀,3500rpm离心l0min,弃上清，重复1~2次，收集白细胞（白色沉淀）。

实验2基因组DNA的提取分离

一、实验目的

了解DNA的存在状态，增加感性认识，学习、掌握DNA的制备一般方法技术。

二、实验原理

利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。

加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。

在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。

一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。

而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下）,并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。

在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。

尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。

各种生物材料的细胞核含有丰富的DNA，是提取DNA的好材料。

制备过程中，为了防止DNase的作用，在用于提取的缓冲液中均含有1mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螫合剂，以除去保持DNase活性所必须的Mg++离子。

为防止DNA的变性和降解，操作要尽可能在低温下进行。

三、实验步骤

分离的白细胞

↓提取DNA

加2.5倍（W/W）DNA提取液

（pH8.3的0.2molL-1的Tris缓冲液，内含0.25molL-1NaCl0.025L-1EDTA和0.5%SDS）

↓

↓充分混匀3-5min

加0.3ml60℃热饱和酚（1molL-1Tris.HClpH8.0）

↓充分混匀3min

加0.2ml氯仿：

异戊醇（24：

1v/v）

↓充分混匀3min

4℃离心（10kr/min），15-20min

仔细小心的收集上层水相到另一1.5ml离心管中

↓

加等体积氯仿：

异戊醇（24：

1v/v），4℃离心（10kr/min），15-20min

收集上层水相到另一管中

↓

加1/3体积的3mol醋酸钠（pH5.2）和1/2体积的异丙醇，轻轻倒置混匀

↓

取出DNA细丝

↓

↓加70%乙醇

↓离心2min

得DNA白色沉淀

↓加70%乙醇

↓离心2min

重复洗涤3次

↓

真空干燥（-40℃/-70℃保存）

或室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后，保存。

或向沉淀的白细胞中加入0.5ml白细胞溶解液（WClB）[l0rnmol/LTris-Cl（PH7.6），l0mmol/LEDTA，50mmol/LnaCl]。

溶解白细胞，再加入蛋白酶K（终浓度达100μg/μl）,SDS（终浓度0.5%），RnaseA（终浓度20μg/ml）。

42℃保温过夜（其间轻轻摇晃多次），60℃保温1h。

或加入0.5ml抽提缓冲液[10mmol/LTris-Cl（pH8.0），0.lmmol/LEDTA（pH8.0），0.5%SDS，20μmol/LRnaseA]，42℃保温过夜。

然后加入苯酚:

氯仿（1:

1）混合液，旋转20分钟，3500rpm离心10min，小心吸取上清液，转移至无菌的Eppendorf管中,重复1~2次，加入氯仿:

异戊醇（24:

1）抽提2次,3500rpm离心l0min，除去苯酚。

吸取上清液，加入等体积的冷异丙醇（或2倍体积的冷乙醇），颠倒几次，沉淀析出絮状DNA，用无菌玻璃棒挑出DNA，在70~75%的乙醇中洗涤2次，除去异丙醇。

抽真空干燥至无乙醇气味。

－20℃冰箱保存备用。

实验3真核RNA的分离提取

一、实验目的

了解RNA的存在状态，增加感性认识，学习、掌握RNA的制备一般方法技术。

二、实验原理

RNA提取与DNA提取在技术路线上有许多相同的地方，如组织破碎、核酸酶的抑制、RNA与蛋白质或次生代谢产物所形成的复合体的有效分离等。

但是，RNA提取比DNA提取更需特别小心，因为只要存在有极微量的RNA酶就可能降解RNA。

此外，水溶性细胞次生代谢产物如多糖、多酚，在RNA提取过程中易与RNA结合形成粘稠难溶的胶冻状复合物而导致RNA的大量损失，或与RNA形成褐色复合物导致RNA完全无生物不活性。

传统方法通常采用去污剂，如SDS或CTAB或用LiCl沉淀法，或用热与冷酚抽提，或用胍基化合物并结合CsCL密度梯度离心，或单用胍基化合物，或用蛋白酶K，或综合以上方法中的部分处理办法等。

现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。

分离的总RNA可在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。

所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。

所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。

凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。

DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。

试验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。

但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。

Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。

配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。

除DEPC外，也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。

此外，为了避免RNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。

三、实验步骤

取新鲜组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加液氮2-3ml，研磨成细粉

将冻干细粉转移到1.5ml离心管中

↓提取RNA

加3.5倍（W/W）RNA提取液:

60℃热饱和酚（内含1molL-1Tris.HClpH8.0）,

pH5.0的0.2molL-1NaoAc（内含10%SDS）。

即:

酚∶NaOAc∶SDS=3∶3∶1

↓充分混匀3-5min

60℃保温5min。

↓

4℃离心（10kr/min），15-20min

仔细小心的收集上层水相到另一1.5ml离心管中

↓

加等体积氯仿：

异戊醇（24：

1v/v），轻轻倒置混匀

↓4℃离心（10kr/min），15-20min

收集上层水相到另一管中

↓

加1/8体积的2.5molL-1LCl和2.5倍95%乙醇，轻轻倒置混匀

↓－20℃过夜

4℃离心（10kr/min），15-20min，弃上清夜

↓

沉淀用pH5.0的3molL-1NaoAc洗涤，离心5000g×5min，弃上清液

↓

沉淀用70%乙醇洗涤，离心5000g×5min，弃上清液

↓

重复洗涤3次

↓

真空干燥（-40℃/-70℃保存）

或室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后，保存。

实验4DNA/RNA的定量与纯度的测定

一、实验目的

学习、掌握紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理和方法。

二、实验原理

DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。

因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。

如用1cm光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。

RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。

DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。

若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。

OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

三、实验步骤

1.将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中[pH8.O,1Ommo1/L的Tris缓冲液,内含〈1mmol/LEDTA〉]或悬浮溶解在灭菌水中（依据DNA含量加水）。

2.用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值：

OD260/OD280，纯DNA的此比值约为1.8～2.0。

纯RNA的此比值约为大于2.0。

3.根据：

每毫升1微克的纯DNA的OD260值=0.020，计算所得DNA的纯度；

每毫升1微克的纯RNA的OD260值=0.025，计算所得RNA的纯度；

并讨论纯度较低的原因和解决办法。

260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。

一般的，只看OD260/OD280（Ratio，R）。

DNA:

OD260/OD280比值应接近1.80，若R值大于1.8。

说明存在RNA，可重新用RNaseA处理,酚:

氯仿:

异戊醇（23:

24:

1）抽提。

若R值小于1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化（也可加入1/8体积的3MNaAc（pH5.2）与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。

RNA:

OD260/OD280比值在1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。

当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。

当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。

注意事项

1.有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶/RNA酶。

2.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制，RNA均用DEPC处理的水。

3.用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。

实验5DNAAgarose电泳鉴定

一、实验目的

学习、掌握琼脂糖凝胶电泳原理和技术方法。

二、实验原理

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。

该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。

当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Ethidiumbromide,EB）染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。

琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。

琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5-500bp）效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。

聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。

聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。

目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

三、影响因素

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。

在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

1、DNA的分子大小

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

2、琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。

DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。

凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。

分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3、DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。

相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。

如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

4、电源电压

在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。

但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

5、嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。

6、离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。

在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶）,电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液）,则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸]，TBE（Tris-硼酸和EDTA），TPE（Tris-磷酸和EDTA）,一般配制成浓缩母液，储于室温。

四、实验步骤

1.制备Agarose凝胶板：

用1×TBE/TAE电极buffer配制0.7%～0.8%的Agarose，沸水浴融化，冷却至～60℃，铺板，湿度盒中保存备用。

2.制备样品：

取出3～5μl悬浮溶解的DNA,加5～6μlloadingbuffer,混匀，根据DNA浓度确定使用量。

3.点样：

将制备DNA样品用10μl移液器小心慢慢的加入样品槽中，不得溢出悬浮。

4.电泳：

采用60V恒压2～3h。

5.染色：

电泳结束后，小心取出凝胶板，将Agarose凝胶小心轻轻移入1%EtBr水溶液中。

注：

EtBr是致癌物质，应特别仔细谨慎。

6.结果：

紫外灯下观察DNA条带，照相记录图谱。

在0.8%的电泳胶上电泳，以Marker作对照，经EB染色后与DNA的亮度比较,估算DNA的浓度。

若电泳后DNA条带型整齐无拖尾，则说明所提DNA无断裂，纯度质量较高。

实验6RNA变性电泳鉴定

一、实验目的

学习、掌握变性凝胶电泳原理和技术方法。

二、实验原理

用琼脂糖凝胶电泳分离检测RNA比用聚丙烯酰胺凝胶电泳方便，但所得RNA区带较聚丙烯酰胺凝胶电泳宽。

RNA琼脂糖电泳需在变性条件下进行，以除去RNA分子中的二级结构。

常用的RNA琼脂糖凝胶电泳有3种方法：

乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。

羟甲基汞变性电泳可其具有较大的毒性，故逐渐被人们所淘汰。

由于RNA对RNA酶很敏感，因此用于RNA电泳的试剂和器皿均应按前所述采取措施，以防RNA酶的污染。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA的装置有圆盘电泳和垂直平板电泳。

圆盘电泳多用于分析微量样品或分析已被分离开的微量RNA带。

垂直平板电泳则适用于分级分离RNA，并同时比较多个样品。

电泳所用凝胶浓度随被分离RNA的分子大小而变化，通常浓度为3～10%。

在分离较大的RNA分子时，需要用低浓度大孔径的聚丙烯酰胺凝胶。

但低浓度的聚丙烯酰胺凝胶机械强度低，难以操作，故有人设计加入0.5%琼脂糖以增加凝胶强度，用这种方法可以分离较大的核糖体RNA。

三、实验步骤

1.制备agarose凝胶板：

用MOPS～甲醛电极buffer配制1%～1.2%的Agarose，沸水浴融化，冷却至～60℃，铺板，湿度盒中保存备用（不能过夜）。

2.制备样品：

3～5μl悬浮溶解的RNA,加样品处理液3～5μl，65℃加热15分钟，冰上冷却，再加3～5μlRNA-loadingbuffer,混匀，根据RNA浓度确定使用量。

3.上样：

将制备样品用10μl移液器小心慢慢的加入样品槽中，不得溢出悬浮。

4.电泳：

采用60V恒压2～3h。

5.染色：

电泳结束后，小心取出凝胶板，将Agarose凝胶轻轻移入1%EtBr水溶液中。

（注：

EtBr是致癌物质，应特别小心）。

6．结果：

紫外灯下观察DNA条带，照相记录图谱。

四、注意事项

1．所有缓冲液均应用DEPC处理。

2．甲醛气体有毒，应在通风橱中电泳。

通常甲醛为37%水溶液（12.3mol／L）使用前应检查其PH值是否大于4.0。

3．多数试剂级甲酰胺产品已足够纯，不必进一步处理。

但如果试剂变黄，则应加入DowexXG8混合床树脂，用磁力搅拌器搅拌1小时，然后用Whatmanl号滤纸过滤二次去离子。

去离子后的甲酰胺应少量分装在氮气中保存于-70℃下。

实验7DNA片段的纯化回收

——玻璃珠（GoldenBeads）纯化法

一、实验目的

学习、掌握纯化、回收DNA片段的有关方法技术，同时最大限度除去蛋白质、离子及引物小片段等杂质。

得到的DNA可直接用于连接、转化、酶切、测序等分子生物学实验。

二、实验原理

在含有各种不同大小的DNA混合物中，分离纯化特定分子量的DNA片段是基因工程技术中的基本操作。

DNA纯化的主要目的是回收得到纯化的目的DNA片段，去除影响DNA工具酶活性的物质以及其它的DNA片段。

目前纯化回收DNA片段多用商品化的试剂盒，低熔点琼脂糖和PEG回收、玻璃珠纯化回收，电洗脱法、硅胶吸附、离心柱型和直接过滤式纯化回收。

其中玻璃珠纯化回收具有快速、高效、多样和简便的特点，从而得到广泛的应用。

该方法是利用特殊玻璃微珠吸附DNA的特性,然后洗脱的方法获得高纯度的DNA片段。

纯化后的DNA产物可以直接用于酶切、补平、连接、测序、转录、转染、探针标记、PCR、突变、转基因动物等多种分子生物学实验，尤其适合在差异显示实验（Differential-Display）中回收各种大小的DNA片段。

低熔点琼脂糖凝胶法：

在琼脂糖的多糖侧链上引入羟乙基，成为低熔点凝胶。

其凝固点降为30℃，在65℃条件下可以熔化，这一温度低于大多数双链DNA的变性温度，保证DNA分子不变性，从而可以将DNA分子从凝胶中提取、纯化出来