回顾目前人类干细胞的基因不稳定性及未来展望.docx
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回顾目前人类干细胞的基因不稳定性及未来展望
简明回顾：
人类干细胞中的基因组不稳定性：
目前的情况及将来的挑战
ABSTRACT
人们已经认识到，基因组的不稳定性是基于干细胞的疗法进行扩展的最重要障碍之一。
最近几年，不断积累的证据表明人类干细胞在体外培养条件下经历了多种生物学变化程序，包括染色体数量和结构上的异常，点突变端粒长度的变异，以及表观遗传上的不稳定。
随着这一领域向前发展，对与人类基因组可塑性有关的风险因素的认识，非常有力地支持将广泛基因组筛查作为质控平台的一部分，以证明基于干细胞产品的安全性。
本文中，我们做了一次及时而广泛的回顾，回顾这一领域的现状及正在出现的趋势，最终，强调了采用新调控标准的必要性，这种调控标准可以使治疗性应用的开发途径更为安全有效。
INTRODUCTION
再生医学的广阔天地为使用干细胞和/或其子代来替代被疾病损伤的组织带来了令人兴奋的前景，这种取代要么是通过细胞整合（移植成活）到目标组织中，以及/或者是利用细胞产生可溶性信号分子的能力。
干细胞可以源自多种组织，也就是可以来自胚胎组织及成体组织。
首先从胚球内侧细胞团中分离出了人类胚胎干细胞（hESCs）[1]，已知的是它自我更新的能力以及它的多能性，它可以产生胚胎的三个胚层（内胚层，中胚层，外胚层）能产生的所有细胞类型。
hESCs为替换治疗，疾病建模，以及药物筛查带来了巨大的希望，但最近几年人们发现了相当多的关于染色体畸变的令人心烦意乱的数据，这些数据还伴有显著的伦理争议，它们妨碍了对这些细胞的研究及临床应用。
2006年Takahashi与Yamanaka揭示了用异位共表达已知的转录因子将体细胞重编程为胚胎样状态的可行性[2]。
这种方法避免了子宫外胚胎损伤，对获取这些被称为诱导性多能干细胞（iPSCs）的热情，一定程度上掩盖了与重编程过程相关的高突变率[3]。
按现有的了解情况，hESCs和人iPSCs（hiPSCs）在基因，表观遗传，以及转录水平上有微妙的区别。
不过，这种区别是意味深长的，或仅仅是，打个比方说，不同培养环境所造成的结果，这个问题还悬而未决。
此外，最近几年里，人类成体干细胞，比如造血干细胞（HSCs），间质干/基质细胞（MSCs），神经干细胞（NSCs），表皮干细胞或皮肤干细胞，在整个成年期的组织里不同的微环境中被发现，为能够支持组织的维持与再生的静止期祖细胞提供了另一种来源。
这些多能干细胞中的某些类型，比如HSCs或MSCs，也可在新生组织中发现，比如胎盘或是脐带血。
但是，如同在多能干细胞中的那样，不断出现的证据表明这些细胞在体外培养扩张期间，基因异常和转换表现出时间依赖性累积现象。
在这种情况下，非常值得注意的是，不考虑细胞类型，体外扩张期间的质量控制对干细胞治疗方面在临床上更安全地实施十分关键。
欧洲药品管理局在其“对基于干细胞药物的反思”一文中强调了与操作步骤及多能细胞和体细胞培养有关的致癌潜能，并做了一份关于进行细胞遗传学分析以及评估参数的建议，这些评估参数包括端粒酶活性，增殖能力，以及衰老状态[4]。
关于国际干细胞银行的提议要解决同样的议题[5]，它设想建立一个关于标准化优良操作的全球性网络，以便干细胞的存储与分配。
在这件事上，美国食品与药品管理局（FDA）的失职情况还在不断恶化，越来越多的诊所往往在没有什么控制力的司法权下进行操作，并用一些未经证明的疗法来应对无数的病理情况（见[6]）。
在某些例子中，缺乏健全而可靠的科学追踪，引起了致命的后果[7]。
这里，我们对评估基因完整性的方法做了一个简要总结，然后对已经报道的各种发现做了一个最新的，全面的回顾，因此深入关注了hESCs，hiPSCs以及人类成体干细胞中的基因组不稳定性问题。
我们也讨论了研究的瓶颈以及未来的趋势。
评估基因组完整性的常用方法——简要回顾
最常用来评估基因组完整性的技术，从本质上都是基于细胞遗传学分析和DNA分析的。
传统的核型被认为是发现非整倍体（异倍体），多倍体，以及其它大型染色体失衡。
通常这涉及到对有丝分裂中期静止的染色体进行吉姆萨染色显带，然后可以用普通光镜进行分析。
吉姆萨染色的染色体的核型可以根据人类遗传学国际命名体系（ISCN）来描述[8]。
尽管已经对传统的核型方法进行了一些优化，但这些步骤仍然十分漫长，需要熟练的人员来进行，受限于较低的平均分辨率（一般＞3Mb），这种黑白染色方式难以解析复杂的重组，并且这种方法需要获取数量很多的中期细胞。
除此之外，现在已经清楚某些亚核型变异不可忽视，因为从临床角度来看它们可以有严重的含义。
综合起来考虑，这些缺点促使，特别是通过使用高分辨率非同位素技术，促使了分子细胞遗传领域的重大进步。
一个例子就是原位杂交荧光技术（FISH）。
FISH技术出现于20世纪80年代早期[10]，从本质上来说它依赖于使用直接或间接探针，通过对有丝分裂中期的染色体（分辨率1~2Mb），间期核（50kb到1Mb），或DNA纤维（10~500kb）进行荧光测量，来发现特定的DNA目标序列。
由于其高敏感性，高性价比，以及高度可重复性，FISH在生物和医学中迅速获得了广泛的承认，并证明了其对各种目的而言的巨大价值[11]。
其中一些例子包括非分裂细胞中的染色体畸变分析，3D染色体组织研究，基因图谱绘制，DNA复制/重组研究，疾病特征及诊断。
但是，FISH有一个主要的缺陷就是只能发现已知的基因畸变，限制了它在基因组范围上的应用，这使得它不能对染色体畸变做广泛的筛查。
通过与受到不同标记的DNA探针杂交并成像，使得人们可以观察到人类所有的24条染色体（22条常染色体，X和Y染色体），每条染色体都是一种单独的颜色，并且只用一步完成，这种性质极大地克服了上述的FISH缺陷。
这使人们开发出了一些新的基于FISH的技术，比如光谱分型（SKY）[12]，以及多重FISH（M-FISH）[13]。
这两种技术的成像获取模式都与FISH不同：
SKY依赖于通过特制的多频光滤波器来进行单步成像获取，而M-FISH用的是一套荧光染料特异性光滤波器。
这些技术的限制包括必须要有中期细胞，一般分辨率较低（大约1~3Mb），不能发现染色体内重组。
另一种很受欢迎的技术是比较基因组杂交（CGH）[14]，这项技术近些年在肿瘤学研究和发现胚胎期与新生期基因组畸变方面提供了无与伦比的认识。
CGH使用测试基因组和对照基因组，它们用不同的荧光染料标记（比如，测试组染成绿色，对照组染成红色），然后与中期染色体完全杂交。
然后对每条染色体，检测测试基因组相对于对照组的荧光率，得到关于基因材料得到DNA区域（绿红比上升）或丢失DNA区域（绿红比下降）的信息。
但是，CGH有一些限制，也就是它的分辨率较低（5~10Mb），它无法发现平衡重组，比如倒位，或对等重组（reciprocal），或罗伯逊易位。
CGH的原理也与微阵列技术联合（阵列-CGH），利用细菌人造染色体（BACs）（150~200kb大小），cDNAs（0.5~2kb），聚合酶链式反应（PCR）产物（0.1~1.5kb），以及寡核苷酸（25~80bp）充当调查探针[15~18]。
阵列-CGH技术的最大分辨率是一个与长度，分布及探针间空位有关的函数，使用BACs的分辨率在50~100kb，使用寡核苷酸探针的分辨率在1~10kb。
其它基于阵列的平台使人们可以发现单核苷酸多态性（SNP），并且除了可以提供拷贝数量变异（CNVs）的信息，还有一个好处就是显示杂合性的丧失，或是片段性单亲二倍体。
我们现在处于一个节点，下一代测序技术正在成熟，那将使得人们可以在bp精度上测绘重组的情况，尽管价格不菲，并且更依赖计算机的力量（见[19]回顾）。
在日益扩展的干细胞领域，这些技术的应用已经集中于识别和描述环境获得性异常，并将继续这样下去，揭示出维持基因组所面临的真正巨大的挑战。
hESCs中的基因组不稳定性
hESCs正被越来越多地认为是一种有用的工具，用于替换受损组织，以及广泛种类疾病的潜在治疗。
对它们的使用有争议，主要是因为现在要获取hESCs需要，举例来说，从多余的离体授精胚胎中，或是流产胎儿中，破坏人类的胚球。
这种引出细胞的方法，加剧了关于植入前胚胎的道德身份方面的激烈观点争论。
那些反对破坏胚胎的人，其观点的基础往往是象征或者可能性，他们的依据是植入前的人类胚胎有潜能发育成完整的人，因此应当有相等的权利，利益以及道德上的身份。
这种争论的另一方认为，胚球只不过是由一堆未分化细胞组成，没有可识别的神经系统，因此发育阶段还十分不成熟，谈不上有什么利益或是权利。
根据这些细胞在治疗上的潜力，研究者，政策制定者以及伦理学专家们应当在不同的观点之间寻找尽可能普遍的基础。
除了伦理学上的考虑，在将干细胞移入临床应用之前，还有其它一些障碍不得不解决。
越来越多的证据表明干细胞在离体培养期间出现染色体异常，这催生了一个疑问，即这些细胞应用在人体上有多安全。
这种忧虑十分重要，因为正常的核型不仅可以保证离体状态下hESCs特性的维持，也能避免在活体状态下的负面作用。
基因上异常的细胞一般在培养适应期间出现，往往表现出生长速率增高，更倾向于获得恶性转变[20]。
看起来，hESCs表现出偏倚性倾向，更容易在12号染色体（特别是12p）[20~27]，17号染色体（特别是17q）[20,22,23,25,27~30]，20号染色体（特别是20q）[20~22,25,27~29,31]，以及X染色体[20,22,25,28,32]上形成非整倍体（主要是增多）（Fig.1）。
已经发现12号染色体的三倍体能增加hESCs的增殖潜能，促进细胞分裂，伴有多个纺锤体，并引起活体组织中的肿瘤样组织[26]。
另一方面，已经知道20q11.21的一段大小从0.5到4.6Mb片段的复制[21,23]能影响诸如ID1和BCL2L1这样的基因，后者编码抗凋亡蛋白BCL-X，最近发现其是这种复制有强烈选择优势的原因[31,34]。
20q11.21的获得性突变也常在各种人类肿瘤中发现[35,36]。
X染色体的丢失有过报道[28]，但获得突变更多见[20]。
在近期的报导中，将染色体计数，FISH，以及SKY联合运用揭示出在hESCs（及hiPSCs）中有18~35%的嵌合非整倍体共存，这种现象的培养不依赖于传代数，培养技术，或是实验室[37]。
嵌合体似乎是以随机的形式出现，似乎要么引起表型异质性，要么后代产生非整倍体细胞，引起这种细胞丧失多能性，以及致癌性的增高[37]。
在另外两项研究中，使用了诸如CGH或SNP阵列这样的高分辨方法，确定了不同染色体中大小从20kb到3Mb的大量拷贝数变异，这些拷贝数变异影响肿瘤相关基因，并引起基因表达分布情况的变化[22,38]。
那些基因上异常的细胞似乎也迅速出现了分化，这意味着发现突变的工作应当继续，不止在多能状态中进行[39]。
有趣的是，某些hESC细胞系似乎比其它细胞天然地更容易获得突变。
这种偏倚突变的易感性似乎与胚胎来源或是与这些细胞暴露的环境条件有关[24]。
后者包括使用的饲养层类型，培养基的组成，用于细胞传代，以及冻融的技术[30,40,41]。
用物理上的缺氧环境（~2%）来取代大气含氧环境（21%，叫做正常氧含量），也与基因异常数量减少有关[42]。
另外，在微载体上扩张的hESCs密度很高，已经显示出能保持其多能性与正常核型达数月之久[43,44]。
在这一点上，寻找一个可靠的能识别老化与基因异常hESCs的生物标志物，能够推动培养条件的进步，并确认这种进步，因为它可以减少细胞遗传分析的工作量。
在这种尝试中，Herzfeld等人[45]识别出了肿瘤坏死因子CD30是一个合适的候选标志物，因为它在核型异常的hESCs中，相对于在正常的培养细胞中，是过度表达的。
之后，两项独立的研究对这个数据的解释提出了挑战，因为其从本质上显示了存在于敲除血清替代物（KnockOutSerumReplacement,Invitrogen,Carlsbad,CA）培养基中的抗坏血酸是诱导CD30表达的唯一因子，它通过增强CpG启动子的去甲基化实现这一点[46,47]。
在这些例子中，CD30的表达引起凋亡受抑制，增强了生长，并可参与支持那些累积了基因损害的细胞生存下去[47]
线粒体基因组的完整性，以及同质与异质点突变和大规模突变对线粒体在生物能量方面的影响，到目前来说关注较少。
但是，这两者之间正在表现出越来越多的相关性。
据报道，在9个晚代（late-passage）hESC细胞系中，大约22%携带有异质性突变，其中大部分不是同义突变，并且位于线粒体基因组的编码区域[29]。
在另一项研究中，受筛检的16个hESC细胞系，全部有大规模线粒体DNA（mtDNA）删除，平均突变负荷为23%，这种突变出现得很快，传3~6代即可发现，终末分化后也可发现[48]。
从临床上hESCs的应用前景来看，上述的这些发现强调了定时而全面的基因分析的必要性，这种分析能深化我们对这类细胞的现有生物学知识，并帮助我们改进培养条件。
尽管有本节提出来的这些障碍，hESCs还是在缓慢地走向临床应用。
在Geron公司于
2011年11月停止目标为hESC源性少突细胞祖细胞对脊髓损伤治疗安全性的一期临床试验后[50]，进步的细胞技术目前正在引导FDA-批准的使用hESCs的临床实验（见49）。
上次实验停止2年后，生物技术公司BioTime的子公司AsteriasBiotherapeutics获得了Geron的资产，看起来似乎这家公司会在接下来数年内进一步推进hESC基础性实验[51]。
iPSCs中的基因不稳定性
在2006年和2007年Yamanaka的团队作出的开创性贡献中，他们通过异位共表达四种转录因子[2,52]，将体细胞重编程到类hESC状态。
但是，旨在探索hiPSCs和hESCs之间相似性问题的大量后续文章很快发现要想实现一种完全安全，有效，以及成熟的治疗用产物还需要时间，因为人们发现了两者之间大量的差异。
hiPSC细胞系中细胞遗传失衡的出现，似乎独立于重编程的步骤，其干细胞相关性基因和肿瘤相关基因没有富集，但失衡的类型和频率与hESC培养中发现的情况类似[53]。
与hESCs中的方式一样，在hiPSCs中12和20q染色体的三倍体也是主要的异常，但与前者不同的是，17和X染色体的三倍体很少见到[53~55]（Fig.1B）。
另一项研究显示与中代hiPSCs，成纤维细胞以及hESCs相比，在早代hiPSCs中从头产生了CNVs并且数量很多[56]。
这些CNVs大部分是不利的，在培养过程中随时间而被淘汰掉，小部分会留存下来。
观察也发现在每个iPS细胞外显子组中大约有6个点突变，特别是在肿瘤相关基因中，提示需要引入全外显子组或基因组测序来充当重编程后一种有效的质控程序，以确保不存在有害的点突变[57]。
hiPSCs的全部点突变负荷都来自亲代细胞中已有的突变（19%），离体传代时出现的突变（7%），以及源自细胞重编程过程本身（74%）[3]。
与这些发现一致的是，hiPSCs似乎也会很快形成畸胎瘤，侵袭性比hESCs更高，无视其培养的位置或是移植成活的位置[58]。
两项新的研究观察到在重编程和传代早期，通过向生长基质中添加抗氧化剂来降低氧化压力，可以减少hiPSCs中的基因组不稳定性[59,60]。
监视重编程期间mtDNA突变的发生也十分重要。
在近期的工作中，一些hiPSCs细胞系被发现藏有同质性和异质性突变，这些突变在其亲代细胞中未被发现，其中非同义突变与同义突变之比等于或大于1[61]。
尽管这些变化的大部分是单倍群特异性（haplogroup-specific），还是有一小部分突变被发现与癌症有关，或是之前专业数据库中没有识别出来的[61]。
有趣的是，人们也发现甚至是在那些藏有染色体畸变的，较老的重编程细胞中，线粒体超微结构也是可以重建的[62]。
与上述的基因异常不同，从定向细胞诱导而来的hiPSCs也与一种有缺陷的表观遗传回复突变有联系，这样一些发现激起了对它们在表观遗传上安全性的质疑。
首先，hiPSCs似乎在某种程度上保留有其来源组织的一些表观遗传标志，因此其分化潜能有倾向性[63]。
其次，重编程因子的化学计量法也影响细胞的表观遗传状态[64]。
第三，在hiPSCs中已经发现了基因组印记或肿瘤生成相关性DNA甲基化修饰的某些改变，这些改变可能引起异常的分化或是转化[65,66]。
这就是说，hiPSCs要想成功进入快速发展的再生医学领域，将在很大程度上依赖于执行严密的质控标准，并依赖于以非结合性分子为基础的（builtonnonintegratingmolecules）重编程技术的进步。
我们预言，以，比方说，蛋白质和RNA[67]，或是化学诱导为基础的，新的不依赖结合性的策略，将会解决目前重编程方法产生的问题，目前的重编程方法的基础是通过病毒系统将转基因整合到基因组中。
成体干细胞中的基因组不稳定性
人类脂肪源性干细胞/基质细胞（hASCs）表现得对基因组变化更有恢复能力，甚至是在培养时间较长的情况下也是如此（6个月）[81]。
在早期传代中偶尔会发现少数着丝粒旁变异或端粒/亚端粒变异，但在后继培养中消失。
更近时期的数据较少提示这种稳定性，显示出在标准培养环境下细胞扩张，会逐渐增加非整倍体细胞的累积（8号，11号，以及17号染色体），后者最快在第2代就可以观察到[82]。
在脐带血源性CD34+干细胞/祖细胞的例子中，脐带血含有健康供体的HSCs，在体外培养时，最快在第7天也能观察到核型异常，不过没有证据表明这种异常跟肿瘤生成转变有关[83]。
在用内皮祖细胞做的另一项研究中，传代早期（2~4代）也发现了四倍体和非整倍体[84]。
在某些例子中已经观察到基因组的损伤有供体-年龄依赖性增长，伴有功能能力及DNA修复能力的下降，特别是通过非同源性末端连接（NHEJ）途径丧失了保真性和功效[85,86]。
据此，增殖能力的下降及核型异常伴细胞类型转变的出现，似乎在从老年供体（一般是大于60岁）获得的人类成体干细胞中更为频繁[71,87,88]。
人们已经做了多种研究，以解决缺氧预处理对人类成体干细胞基因组不稳定性的影响，得出的常常是矛盾的结果。
有些作者指出低氧条件下（5%O
2）传代早期（P1~P7）结构不稳定性增强，非整倍体事件增加[87]。
其他人描述了生理O
2浓度（1~7%）显著降低或避免了染色体畸变[89~92]。
Rodriguez-Jimenez等人[93]揭示了低氧环境（1%O
2）通过表观遗传染色质失活以及减少SP1结合，抑制了错配修复系统，从而最快6小时后，在小鼠NSCs和人类BMMSCs中增高了微卫星的不稳定性（MSI）。
相同的是，我们的团体也提供了相同的证据，表明人类BMMSCs和hASCs在2%O
2条件下，与正常氧条件相比，DNA修复机制出现了协同性下调，并继发性增加了MSI[94]。
我们也观察到hASCs对低氧环境的反应比BMMSCs慢得多，依据是DNA修复基因表达的变化情况，以及线粒体的表现。
成体干细胞中低氧对端粒酶基因表达的调控也被探究过。
这些细胞一般是端粒酶低活性/阴性[95]，但报导的结果截然不同[96]。
Tsai等人[92]的研究显示在缺氧条件下（1%O
2）扩张到100PDs的人类BMMSCs，与在常氧环境下扩张的细胞相比，其端粒酶活性和端粒长度要高得多。
像细胞传代这样的常规过程，当延伸到接近融合期时，细胞会产生广泛地接触，发生并加速衰老，这独立于端粒的缩短和p53的活化[97]。
前路的挑战
尽管干细胞研究的广阔领域内最近这些年有各种显著的进步，但还需要彻底了解全部的细节，弄清楚哪种体外操控措施增大了细胞的突变负荷。
有件事是确定的：
单纯把临床上对细胞的应用限制在较低的传代数有助于缓解特定的副作用风险，但这种做法本身不应被视为保证了基因组的完整性。
重要的是认识到基因组的突变在任何培养环境下都会自发发生，比致力于寻找不突变的基因组更重要的是将临床上有害的突变和无害的突变区分开来。
举例来说，潜在的有害突变可能仅在短时间内能被观察到，并与细胞的生理过程比如分化有关[98]。
控制基因组的不稳定性以及抑制有害突变，可能是将干细胞治疗转向临床的最主要的障碍，需要发展出新的策略以充分监测和/或缓解这种现象。
近期的成就向这一目标迈进了一大步。
举例来说，细胞工程技术复杂程度的不断发展，使得人们可以进行快速而精确的基因组编辑与突变纠正，带来了令人激动的景象，并且肯定将极大促进细胞基础性疗法的临床应用。
其中一些例子包括锌指核酸酶，或转录活化因子样效应器核酸酶，它可以充当一种定制化的工具，用以在目标位点上产生位点特异性双链断裂，后面接上NHEJ和同源重组（见[99]）。
就突变测绘而言，最近提出了一种流程，用基于表达的数据做细胞核型分析（e-karyotyping）。
这一技术的理论基础是这样一个事实，基因组区域的改变会驱动位于其中的基因表达情况的改变，或是其紧密邻近区域表达情况的改版。
这一技术的分辨率取决于细胞类型，以及微阵列的平台，但仍然与细胞遗传学方法有可比性（粗略约10Mb）。
在细胞培养期间，评估端粒长度变异的专用而标准化的测试似乎在不久的将来也会出现，有些例子涉及到FISH[101]和实时PCR[102,103]。
从临床的角度来看，使用大规模平行测序方法（massiveparallelsequencingapproaches）以获取特定恶变的起始与进展的更为详细而全面的发生情况，变得越来越有用。
近期在基于细胞的疗法安全性评估方面的进步使得研究者们可以追踪从原始的恶变前克隆到完全确定的克隆谱系这样的进化轨迹。
一个解释性的例子就是接受了自体同源或同种异体以治疗急性髓性白血病和脊髓发育不良的患者，疾病复发的风险增高。
在近期一份文献中，从健康供体细胞中通过外显子组测序，成功地识别出白血病前体细胞克隆[104]，这强调了使用分析工具的必要性，这种工具可以在单细胞水平检验潜在危害性损伤的特性与存在。
在这种环境下，理解作为肿瘤起始细胞起源基础的基因决定因素，及其与正常干细胞的假定等级关系，就十分有趣了。
从生物工程的观点来看，迫切需要快速找到一种更有力而标准化的平台，从而在生产规模上培养干细胞。
特别是，这个目标可以通过使用更有效的生物活化因子配置，以及避免使用不太确定的培养基及受污染的异种源性成分来实现。
在这种背景下，当细胞在血清成分不固定（serum-free）的基质中培养时，核型异常出现的频率更高[45]，这要求人们继续努力以改进现有的成分明确的培养基。
出于同样的原因，有必要进行系统性研究以了解培养环境的耗氧特点，以及氧对不同细胞类型产生的生理影响，特别是在非生理性氧分压或波动性氧分压的环境下（比如，在细胞操控期间）。
甚至，文献中观察到的许多矛盾，可能是由于缺乏专用的氧分压控流罩（pO
2-controlflowhoods），氧分压测定不精确，细胞类型，以及供体特征所造成的。
此外，值得注意的是在过去25年里，在独立研究框架下做的培养中，18%~36%实际上是受到污染的，或是被混淆的（misidentified）[105]。
这一令人不安的发现，最近重新被指出[105~108]但常常被一些团体忽略，要求人们进行严肃而协同的工作，以核实细胞系的识别，避免不一致或是有缺陷的结果。
上面提到的许多问题，都强调了有必要在各种细胞疗法间建立一套标准而一致的国际程序，这套程序关注的方面有，举例来说，培养条件，分化，产品的标记与储存。
此外，尚不完全清楚在这种一致性的标准框架下，调控力量将如何针对有望出现的各种细胞治疗方案的不同模型来调整其指导方针。
我们预言，可能需要某种程度的调控弹性，以适应不同的细胞类型及其固有的变异性，以适应细胞调控的不同程度，或用来适应不同间隔时间的细胞储存需求。
还需要弄清楚的是为了保证基因组稳定性能够维持，或者至少保证就算最终出现某些损伤，也不会在患者身上引起安全风险，所能接受的传代数上限。
为了讨论这些问题，我们认
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