流式细胞仪SOP.docx

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流式细胞仪SOP

一. 流式细胞术概述

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。

它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集（分选）某一亚群细胞,分选纯度＞95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司（简称B-D公司）两个厂家生产。

流式细胞仪主要有两型:

临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。

BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL,BD公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。

EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。

二.流式细胞仪主要技术指标

1．流式细胞仪的分析速度：

一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：

一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。

3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：

前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到～0.5μm。

4．流式细胞仪的分辨率：

通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

5．流式细胞仪的分选速度：

一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

三.流式细胞仪主要构造和工作原理

1、流动室及液流驱动系统

流式细胞仪主要由以下五部分构成:

①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。

流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。

流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力,鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。

   2、激光光源及光束形成系统

流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488nm,此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633nm）和/或紫外激光管。

流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。

在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束（22μm×66μm），在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。

3、光学系统

流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。

流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。

滤光片主要有三类：

长通滤片（LP）--只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片（SP）-- 只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片（BP）-- 只允许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管（PMT）,如接收绿色荧光（FITC）的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525, 接收色橙红色荧光（PE）的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575, 接收红色荧光（CY5）的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。

4、信号检测系统

 当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射（Forward Scatter, FSC）和侧向角散射（Side Scatter, SSC）,散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。

前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角散射（SSC）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管（PMT） 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。

流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长（如氩离子气体激光管,它的发射光波488nm,氦氖离子气体激光管发射光波长633nm）。

488nm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP（叶绿素蛋白）、ECD（藻红蛋白-得克萨斯红）等。

他们的激发光和发射光波长分别是：

             激发光波长（nm）       发射光波长（nm）

FITC            488                      525（绿）

PE              488                      575（橙红）  

PI              488                      630（橙红）

ECD             488                      610（红）

CY5             488                      675（深红）

PreCP           488                      675（深红）

    各种荧光信号由各自的光电倍增管（PMT） 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。

5、信号存储、显示、分析系统

（一） 信号存储

存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode（列表排队）方式存入的,采用List mode方式有两大优点:

①节约内存和磁盘空间②易于加工处理分析。

（二）信号显示和分析

由于List mode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。

1．单参数数据显示和分析  细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示，图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的；纵坐标表示细胞数。

2.双参数数据显示和分析  细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

3．三参数数据显示和分析  细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

三个荧光数据关系用分光图（prism）表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。

6、细胞分选系统

 如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴, 每秒钟形成液滴上万个。

每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。



四、BDFACSCalibur基本结构

1.电源开关：

在BDFACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。

2.光学系统：

BDFACSCalibur基本配有一支波长488nm的氩离子雷射。

以BDFACSCalibur基本型为例

ØFSCDiode只收488nm波长散射光

ØSSCPMT只收488nm波长散射光

ØFL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545nm）

ØFL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606nm）

ØFL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围（波长>650nm）

3.仪器面板：

仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。

流速控制：

LO：

样品流速：

12μl/min

MED：

样品流速：

35μl/min

HI：

样品流速：

60μl/min

功能控制：

∙RUN：

此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。

（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。

）

∙STANDBY：

无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。

PRIME：

去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。

PRIME束，仪器恢复STANDBY状态。

4.储液箱抽屉：

在主机左下方之储液箱抽屉。

可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter，及空气滤网Airfilter。

请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。

∙鞘液筒：

位于抽屉左侧，容积4升。

装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约3小时。

筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。

鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。

∙废液筒：

位于抽屉右侧，容积4升。

筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。

注意废液可能有潜在的生物传染性。

∙鞘液过滤器：

μm过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。

∙气路减压阀：

沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。

在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。

∙空气过滤网：

用于过滤冷却雷射的空气。

5.上样品区：

上样品区是样本管的上样位置。

它包括三个部分，一个是进样针SampleInjectionTube，将样本输入流动室，还有就是支撑架TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。

进样针：

是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。

进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。

支撑架：

用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。

支撑架有三个位置：

位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。

液滴存留系统：

系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。

当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。

上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。

更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。

五、开关机操作程序

5.1FACSCalibur开机

1、开启细胞仪电源。

2、开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。

3、开启计算机。

4、确认鞘流液筒有八分满的FACSFlow，确实旋紧（鞘液筒容量为4L）。

5、将废液倒掉，并在废液筒中加入200ml漂白水（废液筒容量为4L）。

6、将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。

7、排除液流管路与过滤器中的气泡。

8、取下样品管，执行PRIME功能两次。

9、使用1mlPBS，HIGHRUN两分钟。

可开始分析样品。

5.2FACSCalibur关机

关机前必要动作：

清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。

1、将样品支持架左移，取2mlFACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真空系统抽取约1ml的液体。

2、将样品支持架回正，按HIRUN，然后让FACSClean清洗管路10分钟。

3、按Standby，取下样品管，执行PRIME功能两次。

4、取2mldH2O，重复上述步骤1-3。

5、注意最后只留约1mldH2O在试管中。

6、按STANDBY五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护雷射光源。

）

7、倒掉废液，并回填200ml漂白水。

8、将减压阀放在「VENT漏气」位置。

将鞘流液筒充填至八分满。

9、退出软件“File”→“Quit”（如有对话选项，选择“Don‘tsave”）。

10、确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。

关闭计算机。

“Special”→“Shutdown”

六、FACSCalibur的日常维护

FACSCalibur的设计将仪器的维护工作减至最少，但是，为了保证仪器的正常运转和测定结果的可靠，仍需要进行一些必要的常规维护。

清洗液的选择

FACSCleanFluid：

流式细胞仪的常规清洗用液，直接使用，可有效去除仪器管路内的样本、染料等造成的污染。

漂白剂——NaClO溶液：

流式细胞仪的常规清洗用液。

目前市场上的漂白剂有效氯浓度多为5-10%。

μm滤膜过滤后备用。

FACSRinseFluid：

流式细胞仪的清洗液，直接使用，可有效去除仪器管路内积聚的蛋白成分。

表面活性剂——Triton等：

使用浓度约为1%，μm滤膜过滤后备用。

使用表面活性剂时，注意上样管中不要加满，也不要反冲，防止操作不当造成液体进入气路，或进入压力控制器。

蛋白酶液：

测定血样以后，可以使用蛋白酶液清洗上样管，有效去除加样针、流动池中附着的蛋白成分。

μm滤膜过滤后备用。

蒸馏水：

为了防止管路内残留有清洗液，形成结晶或造成管路接口的腐蚀，在使用清洗液清洗完毕后，一定要用蒸馏水，再次冲洗管路。

μm滤膜过滤后备用。

每日维护

实验结束后，请于关机前清洁加样针的外管和内管，防止加样针堵塞或有染料残留。

在使用了一些荧光染（如PI、AO、TO等）后，也需要立即进行加样针的清洁。

1.准备一只上样管，加入3ml漂白剂（可以直接使用过滤后未稀释的漂白剂）；另一只上样管，加入3ml蒸馏水。

2.打开支撑臂，放好有漂白剂的上样管。

3.加样针外管跑1ml。

4.流速选择HI档，合上支撑臂，加样针内管跑5-10分钟。

5.取下有漂白剂的上样管，换上有蒸馏水的上样管。

6.打开支撑臂，加样针外管跑1ml。

7.流速选择HI档，合上支撑臂，加样针内管跑5-10分钟。

8.按下STANDBY按钮。

9.检查上样管内剩余的蒸馏水，应不超过1ml。

10.关机以后，有蒸馏水的上样管应保持原位，防止加样针有结晶形成。

有时某些样本中含有大量蛋白成分，这些蛋白成分在上样针中会有残留，如果不能有效去除这些成分，积聚过多，会影响实验检测。

这时建议在处理完含有蛋白成分的样本后，使用含有去蛋白成分的洗液清洗加样针。

1.上样管中加漂白剂，清洗加样针（步骤见上文）。

2.上样管中加蒸馏水，清洗加样针

3.上样管中加FACSRinseFluid，清洗加样针

4.上样管中加蒸馏水，清洗加样针

5.清洗结束后，上样管中剩余1ml蒸馏水。

每月维护

流式细胞仪使用一段时间后，在鞘液管路、废液管路和流动池中会有残留的碎片、污染物等，因此，需要定期清洗管路，要求至少每个月做一次，如果处理样本量很大，或经常使用附着性染料（如PI、AO等），则需要增加管路清洗频率。

清洁管路时使用含有效氯（NaClO）浓度为1-2%的稀释漂白剂。

注意用漂白剂清洗管路完毕后，必须换蒸馏水，再次冲洗管路，以防止管路有漂白剂残留。

1.在仪器减压后，取下鞘液筒，倒空。

如有必要，应清洗鞘液筒。

2.将鞘液滤器短路，使鞘液不流经滤器，直接沿鞘液管路进入流动池。

3.鞘液筒中倒入1-2L稀释漂白剂（注意不能使用原浓度）。

4.上样管中加入3ml稀释漂白剂。

5.流速选择HI档，RUN运行20-30分钟。

6.鞘液筒用蒸馏水清洗干净，再加入蒸馏水1-2L。

7.取下有漂白剂的上样管，换上有3ml蒸馏水的上样管。

8.流速选择HI档，RUN运行20-30分钟。

9.鞘液筒中换成鞘液，重新安装好鞘液滤器管路。

10.流动池PRIME两遍，PRIME结束后，仪器自动回复到STANDBY状态。

11.上样管中加入蒸馏水，RUN运行5分钟。

12.仪器进入STANDBY状态，可以进行样本检测。

定期维护

需要定期进行仪器检查和清洁，这里主要谈一谈空气滤网的清洁：

空气滤网位于鞘液筒上方，可以用吸尘器或水洗的办法清洁。

空气滤网需要定期检查，发现滤网脏了，就需要清洗了。

1.外抽取下空气滤网。

2.清洁滤网，如果水洗处理，应等滤网完全干了以后，再进行安装。

3.装回滤网，将其慢慢推回原位。

安装时注意滤网的方向，气流由下往上通过。

七、FACSComp

FACSComp简介

FACSComp是BD公司自动设置仪器的应用软件，它不仅可通过标准微球（CaliBRITEbeads）来监测仪器的工作状态，还可以为人类外周血淋巴细胞免疫分群的应用提供常规的、自动化的仪器设置。

流式细胞仪包含了一些灵敏的光电元件，为了保证实验结果的一致性，最好每天用CaliBRITEbeads来运行FACSComp软件。

7.1.1FACSComp运行条件

硬件

●BD公司生产的FACSCalibur、FACSort或FACScan系列流式细胞仪，若做四色，则必须具备配有FL4荧光探测器的FACSCalibur或FACSort；

●FACSComp在PowerMacintosh和Quadra650上都能运行；

●FACSComp可以支持自动进样系统，但要求LoaderManager3.2或更高的版本存在。

软件

●PowerMacintoshAcqLibPPC或更高BDPACDriver1.0.2；

BDPACInit或更高；BDPAC1.0.2；

●Quadra650BDMAC3.0

●Macintosh系统软件，7.6.1或8.1；

●对于HLA-B27的调试，需HLA-B27软件3.2或更高的版本；

●对于FACSLoader，需LoaderManager3.2或更高的版本；

试剂

●CaliBRITEBeads

CaliBRITEbeads是已知光散射和荧光强度的标准塑料微球，大小在5-6um左右。

BD公司生产的beads包括下列5种：

无荧光标记的beadsFITC-标记的beadsPE-标记的beads

PerCP-标记的beadsAPC-标记的beads

每一种beads都有一个相应的6位编码（lotID），例如，12493N。

其中最

后一位代码决定了下列值：

1．FSC和SSC的最小separationvalues（unlabeledbead的后缀）

2．FL1，FL2和FL3的最小separationvalues（FITC，PE，PerCP-bead的后缀）

3．FL4PMT的靶值（APC-bead的后缀）

4．FL4的最小separationvalues（PerCP，APC-bead的后缀）

●鞘液

用鞘液稀释CaliBRITEbeads制成新鲜悬液。

●HLA-B27试剂盒

如你准备做HLA-B27的调试，需用HLA-B27试剂盒中的calibrationbeads制备悬液，其中beadslotID的后缀决定了FL1的靶值而HLA-B27reagentlotID的后缀决定了样本分析时marker所在的位置。

7.1.2FACSComp的文件类型

FACSComp软件可以生成下列类型的文件：

●SummaryReportFile

无论是对于Lyse/WashAssay还是Lyse/NoWashAssay，都会生成两个SummaryReportFile：

atextfile文本文件和apictfile图象文件。

本文件包括每一个参数的channelseparation，灵敏度测试的结果，以及当前的FACSComp的仪器设置。

SummaryReportFile的保存位置是：

BDFile：

FACSCompFile：

DDMMYYfolder。

●HLA-B27SummaryReportFile

HLA-B27调试后同样生成两个SummaryReportFile：

文本文件和图象文件，文本文件包括调节FL1和FSC之后仪器的设置。

保存位置是：

BDFile：

FACSCompFile：

DDMMYYfolder。

●CalibrationFile

FACSComp每一次运行结束都会生成一个新的calibrationfile，这个文件包括所有的仪器设置以及灵敏度测试的总的结果（TRUE代表所有的参数都通过，FALSE代表一个或几个参数不通过）。

这个新生成的文件会自动覆盖原有的文件，因此每一次只会有一个CalibFile和一个CalibFile.LNW存在。

保存位置是：

BDFile：

InstrumentSettingsFile。

Lyse/Washcalibrationfile中仪器的设置可应用于SimuSET，Retic-COUNT；而Lyse/NoWashcalibrationfile中仪器的设置可应用于MultiSET，TriTEST，ProCOUNT和FASTIMMUNE。

●HLA-B27CalibrationFile

在进行HLA-B27调试之前，必须通过一次成功的Lyse/WashAssay，而每一次调试结束后，都会生成一个新的HLA-B27calibrationfile。

保存位置是：

BDFile：

InstrumentSettingsFile。

●LeucoCOUNTCalibrationFile

FACSComp可以对Lyse/NoWash的设置加以修饰生成LeucoCOUNTcalibrationfile，因此，若要保存LeucoCOUNTCalibFile，必须通过一次成功的Lyse/NoWashAssay，并且在参量设定时选择LeucoCOUNT。

保存位置是：

BDFile：

InstrumentSettings