TGFβ1Smad信号通路在糖尿病大鼠心肌组织中的表达变化及干预研究.docx

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TGFβ1Smad信号通路在糖尿病大鼠心肌组织中的表达变化及干预研究

TGF--β1Smad信号通路在糖尿病大鼠心肌组织中的表达变化及干预研究

天津医科大学硕士学位论文

中文摘要

目的：

糖尿病（DiabetesMellitus，DM）系一组由于胰岛素分泌缺陷及（或）其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。

糖尿病性心肌病（DiabeticCardiomyopathy，DCM）是指糖尿病患者中不能归因于高血压、冠心病和其他已知心脏病的心肌疾病，是由糖尿病引起的心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌广泛局灶性坏死。

心肌纤维化是DCM的特征性病变之一。

转化生长因子-p1（transforminggrowthfactorbetal，TGF—p1）是促纤维化的细胞因子，是诸多因素导致心肌纤维化的最后的共同的中介之一，Smads蛋白作为TGF—p1下游的主要信号转导分子，是TGF．D1由膜受体到核内目标基因这一信号转导途径的中心环节。

艾塞那肽是近年来人工合成的胰高血糖素样肽1（glucagon—likepeptide一1，GLP一1）受体激动剂，是新型降糖药物。

近年研究发现，GLP一1受体广泛分布于胰腺外组织，对多个器官具有保护作用。

然而，艾塞那肽是否能减轻或逆转DM大鼠心肌纤维化从而发挥对心脏的保护作用尚不清楚。

本研究旨在观察DCM时心肌间质纤维化的情况及艾塞那肽干预后是否对DCM心肌纤维化有改善作用。

方法：

清洁级近交系成年雄性Wistar大鼠36只，在无特定病原体级（specificpathogen—free，SPF级）条件下饲养，随机选取10只为正常对照组（N组），饲以常规啮齿类动物饲料；其余26只大鼠饲以高糖高脂饲料，8周后以尾静脉注射STZ诱导2型糖尿病模型。

成模后大鼠存活22只，继续饲养，随机选取11只为艾塞那肽干预组（EX组），每日以艾塞那肽皮下注射，其余11只为糖尿病组（DM组），以等量生理盐水皮下注射。

至实验结束时N组、DM组与EX组大鼠分别存活10只。

实验结束时：

①记录大鼠体重（Bw），测血糖，留取血标本以检测糖化血红蛋白、胆固醇、甘油三酯及高密度脂蛋白胆固醇，记录心脏重量（HW）。

②留取心肌组织标本，对心肌组织进行：

HE染色：

光镜下观察各组大鼠心肌组织形态结构及胶原沉积情况；WesternBlotting：

检测COLI、PPARa在各组大鼠心肌组织中的表达；RT-PCR：

检测TGF．B1、Smad2、Smad3、Smad7、COLI及PPARa在各组大鼠心肌组织中的表达。

结果：

@HE染色结果：

N组大鼠心肌纤维排列整齐，走行正常，未见心肌纤维断裂、重排及心肌细胞坏死，心肌细胞间质及微血管结构正常。

DM组出现心肌细胞肥大，有的可见局灶性坏死；心肌细胞周围可见局灶性炎症细胞浸润，

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间质可见散在及灶性分布的淡伊红染色的胶原纤维。

EX组心肌结构较DM组改善，但尚未恢复正常。

②WestemBlotting：

与N组相比，DM组大鼠一tl,肌组织COLI表达增多，PPARot表达减少，差异具有统计学意义（尸<0．01）；与DM组相比，艾塞那肽干预后COLI表达减少，PPARa表达增多，差异具有统计学意义（P<0．05）。

@DM组与N组比较，TGF．131、Smad2、Smad3、COLI表达均增多，Smad7、PPARa表达减少，差异具有统计学意义（P<0．01）；EX组与DM组比较，TGF—D1、Smad2、Smad3、COLI表达减少，Smad7、PPARa表达增多，差异具有统计学意义（P<0．01）@Pearson相关性分析：

TGF．B1与Smad2、Smad3、COLI表达呈正相关（r=0．639，O．736，O．638，P<0．01），与Smad7、PPARa呈负相关（F．0．537，．0．501，P<0．01）。

结论：

①DM组大鼠心肌组织TGF．B1、Smad2、Smad3、COLI表达增多，Smad7表达减少，证实糖尿病性心肌间质纤维化与TGF．131／Smad信号传导通路的异常表达有关。

@EX组大鼠心肌组织病理改变减轻，胶原沉积减少，心肌组织TGF—B1、Smad2、Smad3、COLI、COLIII表达被抑制，Smad7表达增多，

表明艾塞那肽可能通过抑制过度激活的TGF．131／Smad信号传导通路来发挥改善心肌间质纤维化的作用。

③PPARa在DM组大鼠一tl,肌组织表达下降，EX组表达增高，提示艾塞那肽抑制过度激活的TGF．131／Smad信号传导通路可能与PPARa

的激活有关。

关键词：

糖尿病性心肌病转化生长因子．B1Smad2Smad3Smad7胶原过氧化物酶体增生物激活受体c【

Abstract

Objective：

Diabetesmellitus（DM）isachronicmetabolicdisordercharacterized

byhyperglYcemiawhichiscausedbyinsulinsecretiondefectandweakened

biologi．

caIac‘10n·Diabe‘iccardiomyopathy（DCM）isadistinct

primarydisease，independent

otnypertension,eoronaryarterydiseaseandotherknown

myocardialdiseases．char．

actenzedbYextensivefocalnecrosisinmyocardiumwhichiscausedbvmicroan．

910pathyandenergymetabolicdisorder．MyocardialfibrosisisofthefeatWes

oneof

DCM．Transforminggrowthfactorbetal（TGF。

131）isaprofibroticcytol（ineanda

commonagentthatplaysanimportantroleintheprocessofotherfactors

leadingto

myocardlal胁osis·Smadsproteinsarethemost

importantcytokinsinthedo啪．

s2re锄ofTGF·p1，whichtransfertheinformationofTGF．131frommembrane

toaim

genes·Exenatlde，anewdrugthatloweringglucose，istheagonistof

glucagon．1ike

peptide-1（GLP_1）receptor，whichwaSsynthesizedrecently．Recentstudieshavefound

thattIlerec印torofGLP-1distributed

exstensivelybesidesthepancreas，andcanDro．

tectotherorgan8·However,whetherGLP一1receptor

agonistcallalleviateorreverse

myocardlal士’brosisisstillunclear．Ourstudyaimsatobservethechangesofmyocar—

dlumstructureandthecollagenaggradationinDCM，and

establishingaGLP—Iinter—

Ventlon印uptoobservethechangesoftheseindicators，SOthatto

explorewhether

GLP-1haveaprotectiveeffectsonDCMmyocardialfibrosis．

Methods：

36cleangradeinbredWistarrats，wereraisedincagesinspeci]丘c

pathogen。

treeconditions·Selected10ofthemrandomlyaSnormalcontrolgroup烈

group），tedwithregularrodentfeedstuff,Otherswithfattyand

sugaryfeedstuff．8

眦eksl砒er,STZwasinjectedintocaudalveintoinduce2diabetes

typemellitus．22of

tne26werea11Veafterthat，andthenrandomlyselected11ofthem

aseXenatideinte卜

V嘣10ngroup（EXgroup），andweresubcutaneousinjectedexenatide

even，day；the

oth钉11啪陀subcutaneousinjectedbyphysiologicalsalineinthes锄e锄oullt．

乜VentuaI／y,therewere10ratsleftineachgroup．WhentheeXperimentwaSatt11eend．

@Recordedbodyweightoftherats，testedthebloodglucose，k印tthebloods锄Dles

totestglycosylated

hemoglobin，cholesterol，triacylglyceride，highdensitylipoprotein

choJesterolandthenrecordedtheheartweight．@Hearts锄pleswereobtainedfor：

III

天津医科大学硕士学位论文

HEstaining：

toobservethestructuralchangesofhearttissueandcollagenaggradationunderlightmicroscope；WesternBlotting：

todetecttheproteinexpressionofCOLI、PPARaineachgroup；RT—PCR：

todetectthemRNAexpressionofTGF—p1、Smad2、Smad3、Smad7、COLI、PPARotineachgroup．

Results：

（1）HEstaining：

Ngrouphadregularcardiacmusclefiber,cardiacin-terstitialandmicrangium，fracturedandrearrangedcardiacmusclefiberandnecroticcardiomyocytescannotbeseen．Therewerecardiomyocyteshypertrophyandsome·

timesnecrosisinDMgroup，besidesinflammatorycellsinfiltration，andscatteredpinkcollagenCallbeseenincardiacinterstitial．HeartdamageinEXgroupwereslighterthanDMgroup，however,itdidn’trecovertonormal．

（2）WesternBlotting：

compared

withNgroup，thereweremoreCOLIandlessPPARaespressedinDM

group（P<0．01）；whileinEXgroup，therewerelessCOLIandmorePPARaexpressedthanDMgroup（P<0．01）．（3）RT-PCR：

DMgroupexpressedmoreTGF-p1，Smad2，Smad3．COLIbutlessSmad7andPPARathanNgroup（尸<0．01）；whileEXgroupexpressedlessTGF-D1，Smad2，Smad3andCOLIbutmoreSmad7andPPARathanDMgroup（P<0．01）．（4）Pearsoncorrelationanalysis：

TheexpressionofTGF—p1waspositivelycorrelatedwiththatofSmad2，Smad3，COLI（r20．639，0．736，0．638，

P<0．01）,butnegativelycorrelatedwithSmad7andPPARa（r=-0．537，-0．501，P<0．01）．

Conclusions：

（1）TheexpressionsofTGF-[31，Smad2，Smad3，COLIincreasedinDMgroup，whileSmad7decreased，whichsuggestedthatabnormalexpressionofTGF一[31／Smadsignaltransductionpathwayplaysaroleinthepathogenesisofinter-stitialfibrosisinDCM．

（2）ThepathologicalchangesofmyocardiuminEXgroupwereslighterthanDMgroupandthedepositionofcollagenandtheexpressionofTGF—B1，Smad2，Smad3，COL1weresuppressedinEXgroupwhileSmad7wereacti-vated，whichsuggestedthatexenatideCanrelievetheinterstitialfibrosisofDMratsbysuppressTGF-131／Smadsignaltransductionpathway．（3）TheexpressionofPPARainhearttissurewasdecreasedinDMgroupandincreasedafterexenatidetreat·ment，whichsuggestedthesuppressionofTGF-pl／SmadsignaltransductionpathwaybyexenatidemayhavesomethingtodowiththeactivationofPPARa．

Keywords：

diabeticcardiomyopathyTGF-p1Smad2Smad3Smad7collagen

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PPARa

V

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符号说明

缩写英文全称中文全称

AGEsAdvancedGlycatedEndProducts糖基化终末产物

AP．1Activatorprotein-l激活蛋白1

u．SⅣ【A0l—SmoothMuscleActinc【．平滑肌激动蛋白

BMPsBoneMorphogeneticProteins骨形态发生蛋白

COLICollagenI胶原I

CO．SmadCommonmediaterSmad通用介体型SmadCTGFConnectiveTissueGrowthFactor结缔组织生长因子DCMDiabeticCardiomyopathy糖尿病性心肌病

ddH20distilledtwicewater双蒸水

DHEADehydroepiandrosterone脱氢异雄酮

DMDiabetesMellitus糖尿病

dNTP2'-deoxynucleoside-5'-triphosphate脱氧核苷三磷酸

EBethidiumbromide溴化乙锭

ECMExtraeellularMatrix细胞外基质

ERKExtracellular—signalRegulationProtein细胞外信号调节激酶

Kinase

ET-1endothelin一1内皮素．1

GLP一1glucagon-likepeptide-1胰高血糖素样肽1

IGF一1Insulin-likegrowthfactor1胰岛素样生长因子．1

IGF．1RInsulin—likegrowthfactorlreceptor胰岛素样生长因子．1受

体

I．SmadInhibitorySmad抑制型Smad

ⅢKC．．JunNH2．．terminalKinaseC．Jun氨基末端激酶MAPKMitogen-ActivatedProteinKinase有丝分裂原蛋白激酶P38MAPKP38Mitogen—ActivatedProteinKinaseP38丝裂原活化蛋白激

酶

VIll

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PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应

PKCProteinkinaseC蛋白激酶C

PPARperoxisomeProliferator-activatedreceptor过氧化物酶体增生物激

活受体

R．SmadReceptor-activatedSmad受体激活型Smad

SPF级Specificpathogen-free无特定病原体级

SSXSse卜Ser-X—Ser丝氨酸基序TGF—B1TransformingGrowthFactor131转化生长因子-p1

TIeRTransforminggrowthfactorpreceptor转化生长因子B受体

IX

天津医科大学硕十学位论文

刖吾

研究现状、成果

糖尿病（DiabetesMellitus，DM）系一组由于胰岛素分泌缺陷及（或）其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病，其患病率在全世界范围内呈高速增长的趋势，目前我国总糖尿病患病率及糖尿病前期患病率分别为9．7％和15．5％。

慢性持续性高血糖可导致全身各个组织、器官的代谢异常、结构改变以及功能障碍。

流行病学研究发现：

糖尿病病人70％以上死于心血管系统疾病，是非糖尿病人群心血管系统疾病病死率的2．3倍【2】。

其中，糖尿病性心肌病（DiabeticCardiomyopathy，DCM）与糖尿病病人心血管疾病的高发生率和高病死率密切相关。

既往研究认为DCM以心肌细胞肥大增殖为主，但是近年来的研究逐渐认识到非心肌细胞（主要是成纤维细胞）和细胞外间质（主要是心肌间质胶原纤维）在DCM中起着重要作用。

目前研究发现高血糖及其诱发的氧化应激、心脏局部肾素一血管紧张素一醛固酮系统（Renin．angiotensin．aldosteronesystem，RAAS）被激

活、内皮细胞功能障碍、胰岛素样生长因子一1（insulingrowthfactor．1，IGF．1）

升高、以及心肌细胞凋亡均可导致心肌间质纤维化的发生发展。

TGF．p1是上述诸多因素导致心肌纤维化的最后的共同的中介之一，Smads蛋白作为TGF．Bl下游的主要信号转导分子，调控影响着机体的多种生理病理过程，在心肌纤维化中作用显著。

艾塞那肽是近年来人工合成的胰高血糖素样肽1（glucagon．1ikepeptide一1，GLP一1）受体激动剂，是新型降糖药物。

GLP．1的受体除了在胰腺组织有分布外，还广泛分布于脑、肺、心脏、肾脏等【3]【41，其分布的广泛性决定了其作用的广泛性。

前期研究发现，GLP一1可降低高血糖状态下人胚肺成纤维细胞III型胶原的表达。

国外亦有研究证实GLP一1受体激动剂除发挥降糖作用外，还对多个器官具有保护作用或抗纤维化作用【5。

91。

然而，GLP一1受体激动剂是否能减轻或逆转DCM大鼠间质纤维化尚不清楚。

研究目的、方法

为观察TGF一131／Smad信号转导通路在2型糖尿病大鼠心肌组织中表达的变化情况，以及GLP．1受体激动剂艾塞那肽干预是否对糖尿病性心肌病间质纤维化具有保护作用，为治疗糖尿病性心肌病提供理论依据。

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本研究采用清洁级近交系成年雄性Wistar大鼠36只，在无特定病原体级（specificpathogen．free，SPF级）条件下饲养，随机选取10只为正常对照组（N组），饲以常规啮齿类动物饲料：

其余26只大鼠饲以高糖高脂饲料，8周后以尾静脉注射STZ诱导2型糖尿病模型。

成模后大鼠存活22只，随机选取11只为艾塞那肽干预组（EX组），每日以艾塞那肽皮下注射，其余11只为糖尿病组（DM组），以等量生理盐水皮下注射。

至实验结束时N组、DM组与EX组大鼠分别存活10只。

实验结束时：

①记录大鼠体重（Bw），测血糖，留取血标本以检测糖化血红蛋白、胆固醇、甘油三酯及高密度脂蛋白胆固醇，记录心脏重量（HW）。

②留取心肌组织标本，对心肌组织进行：

HE染色：

光镜下观察各组大鼠心肌组织形态结构及胶原沉积情况；WesternBlotting：

检测COLI、PPARa

在各组大鼠心肌组织中的表达；RT-PCR：

检测TGF．B1、Smad2、Smad3、Smad7、

COLI及PPARa在各组大鼠心肌组织中的表达。

天津医科大学硕士学位论文对象与方法

对象与方法1动物饲养和模型的建立、取材及组织学检测

1．1实验动物与主要仪器和试剂

1．1．1实验动物

清洁级近交系成年雄性Wistar大鼠36只，由中国医学科学院放射研究所提供。

1．1．2主要仪器

1）切片机：

德国莱卡公司LeicaRM2135。

2）TP．D摊片机：

天津市久圣医疗电子仪器有限公司。

3）台式离心机：

德国Heraeus公司。

4）光学显微镜：

日本Olympus公司。

5）微量加样器：

德国eppendorf公司。

6）电子秤：

天津市天平仪器有限公司。

7）日立7600A．020全自动生化分析仪。

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