生物化学与分子生物学考试中山大学.docx
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生物化学与分子生物学考试中山大学
一、名词解释
1、基因克隆：
是指把目的基因连接到载体上，构建成重组体，再转化入宿主细胞内进行复制和表达。
或：
是指在体外通过酶的作用将异源DNA连接到载体上，形成重组DNA并将其导入受体细胞，从而扩增异源DNA的技术。
2、基因文库：
是指整个基因组或某一细胞所表达的基因所有克隆片段的集合体，包括基因
组文库和cDNA文库。
常用的从基因文库中筛选目标基因的方法：
斑点杂交、扣除杂交、
免疫化学筛选法、染色体步移和差异表达基因筛选。
3、cDNA文库：
是指以所有mRNA为模板，不经选择地在逆转录酶的作用下反转合成互补的双链ＤＮＡ，即cDNA，然后把cDNA与载体连接构成重组DNA，再转化入宿主细胞扩增，建立cDNA文库。
4、管家基因：
是指某些基因表达产物是细胞或者整个生命过程中都持续需要而必不可少的，这类基因称之为管家基因。
如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等
5、散弹测序法：
又称鸟枪测序法，是指大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体，小片段测序完成后，计算机根据重叠区将小片段整合出大分子DNA序列。
6、功能基因组学：
利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因及其编码蛋白的功能，包括生物学功能，细胞学功能，发育学功能。
7、限制性内切酶：
是指能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性DNA片段，被称为分子生物学家的手术刀。
8、ＣＤKs：
即细胞周期蛋白依赖性激酶，是一类Ser/Thr蛋白激酶，与周期蛋白结合时，才具有蛋白激酶的活性，通过使靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应。
9、RT-PCR：
是指首先以mRNA为模板合成cDNA，然后再进行常规PCR扩增的PCR。
10、逐个克隆法：
对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）
11、荧光定量PCR：
是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
12、基因组：
又称染色体组，是指一个物种单倍体的染色体数目，是生物体全部遗传物质的总和，主要指真核生物的核基因组和原核生物的类核基因组。
13、基因组学：
是指对生物体内所有基因进行基因组作图（遗传图谱、物理图谱、转录图谱）、核苷酸序列分析、基因定位、基因功能分析的一门学科。
或：
指从基因组水平（分子整体水平）研究遗传的学科，主要是发展和应用DNA制图、测序新技术和计算机程序，分析生命体全部基因组的结构与功能。
14、启动子：
是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。
15、肿瘤转移：
是指恶性肿瘤细胞离开原发部位，通过各种途径到达其他器官组织，并继续生长、增殖形成性质与原发肿瘤相同的转移瘤的过程。
16、显性负突变：
是指一对等位基因中因其中一个突变或丢失所致的另外一个正常等位基因的功能活性丧失，都称为显性负突变，在某些肿瘤中抑癌基因p53的一个等位基因的失活导致另一个正常等位基因也失去活性。
17、Delta32突变：
CCR5基因发生32个碱基缺失，在细胞膜表面所产生缩短的、无功能的穿膜蛋白质，使HIV不能进入T细胞。
18、质粒：
是指存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子，具有自我复制功能，带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物，经改造后具有多克隆位点。
19、细胞周期：
是指细胞周而复始的生长分裂过程，并且呈现一定的周期，即指亲代细胞分裂结束至子代细胞分裂结束的过程，又称细胞增殖周期。
20、肿瘤标志：
是指能反映细胞恶性演变的各个阶段中表型及基因型的特性或特征，通称为肿瘤标志，包括生物学标志、遗传性标志及生物化学标志。
21、血管增生：
是指从已存在的毛细血管网上大量生成新生血管的过程，是由于细胞与细胞、细胞与基质及细胞与细胞因子相互作用的结果。
22、载体：
是指能携带和运载目的DNA进入宿主细胞的一些DNA分子，它可以使目的DNA随着宿主细胞的增生而无性繁殖或在宿主细胞中表达目的DNA。
23、PCR：
即以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为上、下游引物，在DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，按照半保留复制的机制，使目的DNA片段得到扩增的技术。
24、病毒癌基因（V-onc）：
是指一类存在于肿瘤病毒中的，能使靶细胞发生恶性转化的基因。
如v-src等。
25、SNP：
即单核苷酸多态性，是指出现在基因组DNA分子的特定位置的单核苷酸的置换，或指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。
SNP位点必须满足该位点的变异在人群中出现的频率大于1%。
在基因组中，不同个体的DNA序列上的单个碱基的差异被称为SNP。
在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP,人类基因组上的SNP总量可能超过十万个。
27、Cyclin：
是一类在细胞周期中，周期性的积累和降解的蛋白。
即会随细胞周期中的不同时期而进行合成与降解。
不同生物的细胞周期素具有共同的特点：
1）结构中含有同源序列，被称为细胞周期素盒，这是一个100-150个氨基酸的保守区域，负责或介导与CDK结合。
2）在细胞周期的特定时相与CDK结合，作为CDK的调节亚基发挥作用。
28、酶联受体：
细胞表面上的主要类型受体，其细胞质区具有酶活性，或者和细胞质中的酶结合，配体与其结合后，激活酶活性。
29、结构基因组学：
研究基因组的结构并构建高分辨率的遗传图、物理图、序列图和转录图以及蛋白质组成与结构的学科。
30、限制性片段长度多态性/遗传学标记（RFLP）：
是指用同一限制性核酸内切酶消化不同个体的同一段DNA时，会得到长度不同的限制性片段，称为RFLP（遗传学标记）。
基本原理：
特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶切后，产生分子量不同的同源等位片段，再通过电泳的方法分离和检测这些片段。
31、蛋白质组学：
在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科。
它以蛋白质组为研究对象（即一个细胞或一个组织中基因组所表达的全套蛋白质），从整体活动的角度，来揭示和阐明生命活动的基本规律。
主要包括：
（1）细胞器蛋白组学；
（2）表达蛋白组学
32、K5：
是由纤溶酶原中与血管抑素相连的联环结构域，由80个氨基酸残基组成，包括3个二硫键，分子量为16KD。
33、细胞通讯：
是指体内一部分细胞发出信号，另一部分细胞接收信号并将其转变为细胞功能变化的过程。
34、信号转导：
是指细胞针对外源信息所发生的细胞内生物化学变化及效应的全过程。
35、蓝-白斑筛选：
细菌如含编码β半乳糖苷酶的LacZ基因，能分解生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。
当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。
称之为蓝-白斑筛选。
二、简答题
1.人类基因组计划的主要内容（简述）
1）、HGP的目的：
解码生命；了解生命的起源，了解生命体生长发育的规律，认识种属之间和个体之间存在差异的起因；认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生民现象；为疾病的治疗提供科学依据。
2）、主要目的：
阐明人类基因组的全部核苷酸序列，从整体水平上破译人类遗传信息，在分子水平全面认识自我。
3）、核心内容：
是绘制人类的遗传图谱、转录图谱、物理图谱和序列图谱。
2、大规模测序的基本策略。
1）逐个克隆法：
对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）
2）全基因组鸟枪法：
在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接讲基因组分解成小片段随机测序，利用计算机进行组装。
3、引物设计的原则：
（1）引物长度一般为18-30bp；
（2）碱基随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，G+C含量应在40%-60%；
（3）避免发卡结构形成，引物自身存在的连续互补序列一般不超过3bp；
（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠；
（5）引物的碱基序列不应与非编码区域有同源性，应位于高度保守区；
（6）引物的3’端无修饰，并尽量避免第一位碱基为第一二位碱基一定要与DNA模板配对，引物5’端可以修饰。
（7）上下游引物具有相似的Tm值、TapDNA聚合酶。
4、蓝白斑试验的原理
是基因工程常用的筛选方法，可以确定目的基因是否已插入载体中，工作原理是目的基因插入后，干扰lacZ基因，因而没有半乳糖苷酶的表达，Xgal不分解，菌落呈白色。
如果目的基因插入不成功，组件上的lacZ基因表达出a片段，宿主菌表达出w片段，组合成完整有活性的半乳糖苷酶，Xgal分解出游离吲哚，菌落变为蓝色。
5、举例说明限制性内切酶命名的原则
限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案，即第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写,第2，3二个字母取自来源细菌种名的头2个字母，小写,如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。
前三个字母用斜体表示,如HindⅢ代表从流感噬血杆菌（Haemophilusinfluenzac）d株中分离到的第3个限制酶。
6、蛋白质组学在生物医学基础研究中的应用
1）、通过寻找差异表达蛋白质,以发现疾病相关的蛋白质；
2）、寻找用于诊断的疾病相关的标记分子；
3）、寻找疾病相关的蛋白质药靶,以用于药物设计；
4）、研究疾病的致病机理等。
7、Sanger双脱氧链终止法测序的原理
即DNA链末端合成终止法–Sanger法
1）、单链DNA模板与寡核苷酸引物杂交，新的DNA链在DNA聚合酶催化下从引物末端进行合成。
在反应混合物中除了有模板DNA、引物、DNA聚合酶和4种底物dNTPs之外，还加入一定比例的四种2’,3’-双脱氧核苷三磷酸ddNTPs（终止核苷）之一。
例如，加入ddATP，则所得到的合成物产生一系列嵌套的DNA片段，通过荧光标记替代发现其中每一个片段终止于序列的A碱基对。
对其他三种碱基，采用同样的方法，但需要不同的荧光标记。
2）、所有标记的DNA片段混合物经过电泳分离大小不同的片段，并对这四种标记的片段进行扫描。
然后通过某一程序判断条码的顺序并预测序列。
8、以干扰素为例，试述其细胞信号转导通路的途径
干扰素与细胞因子介导的受体结合后使受体二聚化，使得结合在受体亚基上的JAK聚集并相互磷酸化而进一步活化，同时将受体上的酪氨酸残基磷酸化，STAT借助于SH2结构域结合与受体激酶复合物的磷酸化酪氨酸残基上，得以靠近JAK激酶。
JAK使STAT的酪氨酸残基磷酸化，此时的STAT与受体的亲和力降低并与之分离，磷酸化的STAT形成STAT复合体并移到细胞核内，结合于启动子的特定DNA序列，调节基因表达。
9、理想载体应具备哪些基本条件
1）复制子：
在宿主细胞内大量复制；
2）同一限制性酶在载体上只有单一的酶切位点；
3）具有选择性遗传标记；
4）有较多的拷贝数；
5）分子量相对较小，有足够大的接纳目的基因的容量‘
6）有较高的遗传稳定性。
10、获取目的基因的方法：
1）从基因组DNA中分离获得；
2）从基因文库中筛选获得（基因组文库和cDNA文库）；
3）化学合成法；
4）PCR扩增；
5）mRNA逆转录。
11、基因工程技术与基因调控原理之间的关系。
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。
基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调控。
基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
12、为什么拮抗VEGF能拮抗肿瘤血管生成？
请举出拮抗VEGF的三种生化策略。
１）VEGF通过增强血管的通透性，引起血浆蛋白（主要是纤维蛋白原）的外渗，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供了最佳的基质。
２）VEGF与受体结合，发挥其特异性的内皮细胞分裂原的活性，诱导血管内皮细胞的增殖。
３）VEGF提高血浆活化因子和尿激酶类纤维蛋白原活化因子表达，促进蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子的活化，具有促进血管构建作用，诱导血管生成。
拮抗VEGF能抑制肿瘤血管增生。
拮抗VEGF主要围绕对VEGF的阻断，降低VEGF活性和阻断VEGF信号传导通路。
1利用抗体封闭原理阻断VEGF和其受体结合，中和VEGF的单克隆抗体已进入临床使用；
2螯合VEGF受体2的单克隆抗体进入临床3期实验；
3VEGF抗体、VEGF受体的螯合蛋白及反义寡核苷酸显著抑制视网膜和虹膜血管增生。
4利用基因治疗阻断、拮抗VEGF和受体的结合，包括以VEGF为靶点的基因治疗，以flt-1为靶点的基因治疗和以flt-2/KDR为靶点的基因治疗。
14、P53通过哪些机制介导细胞的生长阻滞
1）P53对细胞增殖其负性调节作用，它与特定DNA序列结合后可诱导细胞停滞在G1期，抑制细胞的生长。
2）当P53基因活跃表达时，其产物P53蛋白作为一种典型的转录因子可促进cipl基因的表达，产生p21，p21蛋白与CDK2酶结合，抑制该酶的活性，导致细胞不能进入DNA合成期，细胞无法进行有丝分裂，细胞分裂停止。
3）DNA损伤激活p53在细胞周期的不同阶段起不同作用，早期通过诱导p21对CDK-cyclin激酶的抑制，激活限制点，阻止细胞周期前进，直到损伤修复，晚期引发细胞凋亡。
15、K5作用的分子机制
1）K5抗血管增生的研究是建立在血管抑素基础之上，二者可能有相似的抗血管增生的分子机制
2）K5能特异性地作用于血管内皮细胞，使细胞周期停滞，并能诱导内皮细胞凋亡
3）K5选择性抑制内皮细胞迁移是其抗血管增生的重要环节
4）K5能通过抑制HIF-1和p42/p44MAPK的活性下调内源性血管刺激因子VEGF的表达
5）K5提高内源性血管增生抑制因子PEDF的表达，有利于已打破的血管增生平衡恢复正常，K5对正负血管因子的调节是其抗血管增生的主要机制
6）K5和血管抑素抑制内皮细胞增殖机制可能通过细胞外基质中某些多糖分子如整合素来发挥作用，因为整合素是维持MAPK活性所必需的
7）K5抑制炎症细胞分泌细胞因子，如血管内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子及白细胞介素-2等
8）K5降低血管通透性
16、血管增生与肿瘤转移
1）、血管生成不仅是肿瘤生长所必需，而且还是肿瘤细胞发生转移所需要；
2）、新生毛细血管的内皮细胞能分泌胶原酶和组织纤溶酶原激活物，促进基质降解，便于肿瘤细胞脱落进入血管和向邻近基质扩散；
3）、血管前期，循环中极少有肿瘤细胞，但在肿瘤血管化后，肿瘤细胞才持续出现在循环中。
17、mRNA是怎样成为cDNA文库
（1）提取mRNA；
（2）用反转录酶oligo（dT）引导合成cDNA第一链；
（3）cDNA链第二链合成（用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ）；
（4）加入合成接头，将双链DNA克隆到载体中去，分析cDNA插入片段；
（5）扩增cDNA文库，对建立的cDNA文库进行鉴定。
18、ViralVirulence:
Thecapacityofavirustocausediseaseinaninfectedhost
Virulencecanbequantitated:
1）、meantimetodeath；
2）、meantimetoappearanceofsymptoms；
3）、measurementoffever,weightloss；
4）、measurementofpathologicallesions（poliovirus）,reductioninbloodCD4+lymphocytes（HIV-1）
19、Viralgenesaffectingvirulence:
（1）Affectingtheabilityofthevirustoreplicate
（2）Modifyingthehost’sdefensemechanisms
（3）Enablingthevirustospreadinthehost
（4）Havingintrinsiccellkillingeffects
20.Hostdefensesystemsagainstviralinfectionsaremultistep,sequential,andintercommunicating.
1）、Physicalandchemicaldefense：
skin,acidpH,andsurface-cleansingmechanism
2）、Cell-autonomus,intrinsicdefensesystemsdefense：
Productionofcytokines,inductionofapoptosis,interferencewithearlystepsofviralreplication
3）、Innateandadaptiveimmunedefense：
①、Direct,amplifiedresponsebycoordinatedactionofcytokinesandlymphocytes；
②、Infectionclearedbypathogen-specificantibodies,helperTcells,andcytotoxicTcells；
③、ProductionandmaintanceofB-cellandT-cellmemorycellsimmunehost,readytorespondinstantlytothesameinfectionthatinducedthememoryresponse.
21、正常角膜没有血管的理论依据和实验依据
正常角膜，玻璃体等眼内组织中PEDF具有较高的浓度，而PEDF具有很强的抑制血管的作用。
在体外实验中，PEDF在半数有效量0.4nmol/L基础上以剂量依赖方式特异性抑制内皮细胞移行，并且半数有销量量比血管抑素，血小板反应蛋白-1，内皮抑素活性更高。
如果抽掉玻璃体体液中的PEDF，其抗血管生成的活性消失，而表现出刺激血管生成的活性。
22、试从PCR的原理和应用角度，谈谈其有何实用价值．
PCR技术即无细胞分子克隆法：
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。
通过不断重复这一过程，可以使目的基因（DNA片段）得到扩增；另一方面，新合成的DNA片段也可以做为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。
应用价值：
1）生物学基础研究：
目的基因扩增和鉴定；DNA序列测定；定点突变；基因表达分析。
2）医学临床应用：
遗传病基因诊断；致病病原体检测；癌基因检测；器官移植组织配型。
3）法医学物证鉴定：
个体识别；亲子鉴定。
4）其他：
动、植物检疫（转基因动植物检测）；生物物种鉴定；系统进化研究；分子考古学等。
补充：
PCR是一种类似DNA天然复制过程的选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性依赖于一对人工合成的寡核苷酸引物，该引物与靶序列两端互补。
PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成：
１）、模板DNA的变性：
模板DNA经加热变性后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成单链，以便它与引物结合，为下一步做准备。
２）、模板ＤＮＡ与引物的退火（复性）：
模板ＤＮＡ经加热变性成单链后，温度下降至适宜温度（一般较Ｔｍ低５
°Ｃ），使引物与模板ＤＮＡ单链按碱基互补原则退火结合。
３）、引物的延伸：
将温度升至７２°Ｃ，ＤＮＡ模板－引物结合物在ＴａｑＤＮＡ聚合酶的作用下，以ｄＮＴＰ为底物，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留的复制原理，合成一条新的与模板ＤＮＡ链互补的子链。
上述三个步骤成为一个循环，新和成的ＤＮＡ分子继续作为下次循环的模板，每完成一个循环需２－４分钟，经多次循环（２５－３０次）后就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
以ＰＣＲ技术为基础，与其他相关的分析技术方法相结合，衍生了许多新型的ＰＣＲ分析技术，如不对称ＰＣＲ、反向ＰＣＲ、实时荧光定量ＰＣＲ等。
23、病毒的分子生物学特点
包括基本结构和辅助结构，基本结构为核衣壳，由衣壳和病毒核心组成，辅助结构为包膜。
其中病毒核心分为核酸，病毒基因组，病毒衣壳为包绕在核酸外面的蛋白质衣壳，衣壳由壳粒组成，而壳粒由多肽分子组成。
24、阐述影响肿瘤转移的因素有哪些
肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞离开原发部位，通过各种途径到达其他器官组织，并继续生长、增值形成性质与原发肿瘤相同的转移瘤的过程。
其机制极为复杂，主要与肿瘤细胞自身的特性、宿主细胞免疫状态及转移局部组织的特性有密切的关系，主要涉及以下四个步骤：
①、恶性肿瘤细胞从其瘤组织中分离、释放；
②、分离出来的瘤细胞游走并穿越细胞基底膜及细胞外基质而侵入血管、淋巴管等脉管系统。
③、瘤细胞侵入并附着在多种组织间隙；
④、瘤细胞在新的部位分裂、增值形成转移性瘤组织。
25、根据肿瘤转移的过程和分子机制分析阻止肿瘤转移的策略和手段有哪些。
1）、基因调控下的肿瘤转移：
肿瘤转移与促进基因和抑制基因之间表达失衡相关。
2）、粘附分子与肿瘤转移：
粘附因子是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白。
在肿瘤转移的每个环节均包含粘附与分离（粘附解聚）两个方面。
3）、血管生成与肿瘤转移：
肿瘤的生长和转移与血管形成密切相关、肿瘤新生毛细血管是在周边组织原有的血管基础上延伸扩展形成、肿瘤本身能诱导血管的形成。
4）纤溶酶及其调节因子与肿瘤转移：
纤维蛋白溶解酶能水解大多数细胞外基质物质，在血管形成、肿瘤细胞脱落、基质浸润、侵入和逸出循环系统、继发脏器移行和微环境改造等发挥重要作用。
5）基质金属蛋白酶及其抑制剂与肿瘤转移：
细胞外基质的溶解酶系统由一个庞大的蛋白溶解酶家族组成，称为MMPs，MMPs及其抑制剂（TIMP）在肿瘤侵袭和转移过程中担任重要角色
抗肿瘤转移的策略和手段：
1）肿瘤转移的基因治疗
☐肿瘤转移抑制基因nm23基因治疗靶点
☐基因转染改变肿瘤细胞tPA/uPA的活性以阻断肿瘤转移
☐ras基因表达阻断
2）血管生成抑制剂与抗肿瘤转移
◆抗生素、维生素D3衍生物、维甲酸类、多磺基化合物、肝素类似物及细胞外基质成分等
◆血小板因子4（PF4）：
能使FGF丧失生物活性，
◆TNP-470：
是烟曲霉素类似物。
◆血小板反应素-1（TSP-1）：
能抑制血管生长因子。
◆姜黄素：
能抑制新生血管的形成和促进微血管崩解。
3）细胞粘附因子抑制剂与抗肿瘤转移
4）MMPs抑制剂与抗肿瘤转移
26、为了实际工作需要产生了许多种PCR，请简述其名称和作用。
1）不对称PCR：
制备核酸序列测定的模板、制备杂交探针、基因组DNA结构功能的研究
2）反向PCR：
可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。
3）多重PCR：
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
4）LP-PCR：
大量临床标本的基因诊断、可同时检测多种基因成分。
5）锚定PCR：
用于仅有一个引物的扩
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