细胞工程学实验指导概要.docx
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细胞工程学实验指导概要
实验一细胞培养的基本技术
一、实验目的
1、了解细胞培养室的设置、设备和基本要求。
2、掌握细胞培养用器械的清洗、消毒方法及无菌操作技术。
二、实验材料
1、实验设备：
高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净工作台、滤器、滤泵。
2、实验器材：
不同规格毛刷、烧杯、量筒、搅拌棒、瓷缸（陶瓷或玻璃）。
三、实验步骤
（一）器械的清洗
1、玻璃器皿的清洗（植物细胞培养只需①、②操作即可）：
①清水浸泡：
浸泡主要是软化器皿表面所附着的物质。
②刷洗：
将浸泡后的玻璃器皿在洗涤剂中用毛刷反复刷洗，以除去器皿表面的杂质。
烘干备用。
③浸酸：
将经过刷洗和烘干后的玻璃器皿浸泡在由重铬酸钾、浓硫酸配置而成的清洁液中，利用强氧化作用清除瓶皿表面可能残留的有机物。
浸泡时间要在6小时以上，最好过夜（用于动物细胞培养）。
④冲洗：
浸酸后的器皿从洗液中取出后，用自来水冲洗10遍以上。
再用蒸馏水、三蒸水各清洗3遍以上，取出置于烤箱内（40~50℃）烘干（用于动物细胞培养）。
2、金属器械的清洗和消毒：
金属器械不能在清洁液中浸泡，一般用洗涤剂洗刷干净后，再用自来水和蒸馏水反复冲洗干净，烘干。
3、胶塞的清洗和消毒：
细胞培养中使用的胶塞不能用清洁液浸泡。
清洗过程中，要先在水中浸泡，然后2%NaOH溶液煮沸10分钟。
自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟，最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。
注意使用后的胶塞应及时浸泡在清水中。
4、塑料物品的清洗：
塑料物品用后立即用流水冲净或浸入清水中，防止干涸。
一般不用刷洗以防划痕和损伤。
清洗干净的器皿先在2%NaOH溶液浸泡过夜，自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟。
最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。
注：
清洁液的配制（盛装于瓷缸中，用于动物细胞培养时玻璃器皿的清洁）
成分
强酸溶液
次强酸溶液
弱酸溶液
重铬酸钾（g）
浓硫酸（ml）
蒸馏水（ml）
63
1000
200
120
200
200
100
100
1000
（二）器械的消毒灭菌
造成细胞培养失败的主要原因是发生污染，特别是微生物的污染，因此对细胞培养中所用的器械进行消毒灭菌是非常重要的。
最常用的物理消毒方法有如下几种：
1、紫外线消毒：
紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。
目前，多用紫外灯直接照射培养室内空气、地面、工作台表面等进行消毒。
2、高温干热灭菌：
一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。
干热灭菌后的器皿干燥，易于存放。
但是，干热传导慢，可有冷空气存留于烤箱内，需要较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，因此需加温到160℃，保持90-120℃分钟。
消毒后不可马上将烘箱门打开，以免冷空气进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外。
3、压力蒸汽灭菌：
一般使用高压蒸汽灭菌锅进行。
为保证消毒的效果，待消毒的物品不应装得太满，以便消毒器内空气流通。
在加热升压之前，打开排气阀门，以使加热后消毒器内的冷空气排出。
冷空气排完后，关闭排气阀门，开始升压，待达到所需压力后，开始计时，一般为100KPa、121℃下灭菌15~20分钟。
消毒完毕后，不要立刻打开盖子，应先等压力自行下降到一定程度后，打开排气阀，放气后，再打开消毒器的盖，将物品取出，放入烤箱内烘干。
4、过滤除菌：
是将液体或气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的目的。
目前，多数实验室采用微孔滤膜滤器除菌，滤膜孔径为0.22~0.45μm。
（三）培养材料的消毒灭菌
采自自然界的实验材料，携带微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。
采来的实验材料先用流水冲洗10~20min或更长时间，然后在一定浓度药剂中浸泡处理（须在超净工作台上操作），进行表面消毒灭菌。
所用的药剂种类、浓度、处理时间随植物种类和取用的器官部位的不同而异，常用消毒剂的灭菌效果见表1-1。
消毒剂对植物组织是有毒的，应正确选择其浓度和处理时间，减少它对组织的伤害。
经过灭菌的材料，需用无菌水清洗4~5次，沥去水分待用。
表1-1常用消毒剂消毒灭菌效果比较表
消毒剂
使用浓度（%）
去除的难易
消毒时间（min）
效果
次氯酸钙
次氯酸钠
漂白粉
溴水
过氧化氢
升汞
酒精
抗生素
硝酸银
9~10
2
饱和浓度
1~2
10~12
0.1~1
70~75
4~5（mg/L）
1
易
易
易
易
最易
较难
易
中
较难
5~30
5~30
5~30
2~10
5~15
2~10
0.2~2
30~60
5~30
很好
很好
很好
很好
好
最好
好
较好
好
（四）无菌操作室的消毒灭菌
无菌材料进行接种或传代时，必须从各方面防止任何污染物进入容器，所以接种区的消毒至关重要。
由于接种区的污染源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸消毒灭菌（常用每立方米含2ml甲醛和1g高锰酸钾的消毒液或6ml/m3乙二醇等加热熏蒸）。
每次接种前都应进行地面卫生清洁，并用紫外灯照射20min，进行空气的消毒灭菌。
对接种用的超净工作台，每次接种前用紫外灯照射20min，同时用70~75%酒精擦洗，然后方可进行培养材料的接种。
（五）无菌操作
培养材料接种时的无菌操作过程除上述各项消毒灭菌操作外，还需完成以下无菌操作步骤，从而获得接种的无菌培养材料。
1、无菌操作前的准备工作：
工作人员无菌操作前需穿好工作服、戴上工作帽和口罩，坐在超净工作台前，将各种操作所用金属器械浸泡在盛有95%（或70%）酒精溶液的广口瓶中，点燃洒精灯，在耐热器皿（如不锈钢小盘或搪瓷盘）中加入少量酒精，将蘸有酒精的金属器械及器械支架放入耐热器皿中灼烧，待冷凉后将器械置器械支架上备用，所有操作器械每次使用后都要灭菌；用70%~75%的酒精擦拭新培养容器和继代培养容器表面，放置超净工作台上待用；再用同样浓度的酒精擦拭双手和前臂，完成无菌操作准备工作。
2、无菌操作步骤：
准备工作完成后，对来自于自然生长条件下的外植体，按前述培养材料的消毒灭菌方法灭菌后取出，放入已消毒灭菌的培养皿中，然后置于超净工作台酒精灯火焰下方，用灭菌剪刀等器械进行适当分离、切割或其它处理后备用。
在酒精灯火焰处将培养容器的瓶塞（盖）轻轻打开，瓶口在火焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，将镊子放在酒精瓶中蘸酒精，置于酒精灯火焰上灼烧后放回支架，然后迅速灼燎瓶塞（盖）数妙后塞回瓶口。
对继代培养材料的无菌操作，需在灯焰处打开瓶塞（盖），继代培养材料为液体培养细胞时直接用灭菌吸管吸取培养细胞液放入新鲜培养基中；继代材料为固体培养细胞时，用灭菌镊子挑取适量材料置新鲜培养基上；继代材料为其它组织时，用灭菌剪刀或其它器械对培养材料进行适当切割后，用灭菌镊子将其置于新鲜培养基上（中），然后迅速灼燎瓶塞（盖）数妙后塞回瓶口。
3、污染源及其表现特征
当培养材料、转接器皿、无菌操作环境等消毒灭菌不彻底时，培养材料则携带有微生物，当其被转接到营养丰富的培养基上时，微生物繁殖迅速，出现各种污染菌斑。
微生物生长时分泌出对植物组织有毒的代谢废物，致使培养材料死亡或失去使用价值。
在培养过程中，若培养材料附近出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫，则是细菌性污染。
在细菌性污染中，特别要注意一种呈乳白色的芽孢杆菌，它们出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在于培养基内，若出现应严格灭菌。
而培养基表面出现的黄色、白色、黑色等不同颜色的霉菌，属真菌性污染。
此外，需提及与微生物污染无关的酚类物质污染，因它也是培养材料常遇到的问题，它是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞中的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生醌类，这类物质呈棕褐色，使培养材料褐变，甚至接种后使培养基变褐，严重影响培养物的生长发育。
可以利用一些抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸等进行材料的预处理或预培养，或者在培养基中加入抗氧化剂或吸收酚类物质的化合物，如聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、活性碳等来减轻醌类物质的毒害。
实验二动物细胞培养基的配制
一、实验目的
1、掌握含血清细胞培养液的配制方法。
2、掌握胰蛋白酶溶液的配制方法。
二、实验材料
1、实验设备：
电子分析天平、pH计、超净工作台、滤器、滤泵。
2、实验器材：
烧杯、量筒、搅拌棒、血清瓶（分装培养液用）、0.22μm滤膜。
三、细胞培养液DMEM的配制
动物细胞培养使用的培养液一般由合成培养基和新生牛血清配制而成。
合成培养基有商品出售，即商品培养基或称干粉培养基。
根据不同的细胞种类，可以选择不同的合成培养基。
其中最常见最常使用的商品培养基为DMEM和RPMI-1640干粉培养基。
本实验仅以DMEM为例，介绍其配制方法。
1、按包装袋上的说明，将一袋DMEM粉剂用新鲜三（次）蒸馏水溶解。
2、按包装袋上的说明，将一定量的NaHCO3加入DMEM溶液中。
3、加入抗生素，使青霉素钠的终浓度达到100μg/ml，（硫酸）链霉素的终浓度达到100U/ml。
4、调培养液pH至7.0～7.2（此时培养液为鲜红色，也称樱桃红色）。
5、超净台内过滤除菌。
6、加入经灭活处理的新生牛血清，其中浓度为10%~20%（根据实际情况，血清可在细胞培养操作时加入）。
7、分装，-20℃贮存备用（不加灭活血清的培养基可于4℃保存1个月）。
四、胰蛋白酶溶液的配制
1、D-Hanks溶液的配制：
准确称取NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HPO4•12H2O0.716g、KH2PO40.06g、NaHCO30.35g，溶解于三（次）蒸馏水中，调pH至7.0～7.2，定容为1000ml。
高压灭菌后，于超净台内加入过滤除菌的青霉素、（硫酸）链霉素，使其终浓度分别为100U/ml，100μg/ml。
4℃冰箱保存待用。
2、胰蛋白酶消化液的配制：
用D-Hanks溶液将胰蛋白酶配成浓度为0.25%的工作液，过滤除菌后，-20℃贮存备用。
实验三动物细胞的传代培养及冻存
一、实验目的
1、 掌握细胞传代培养的原理及操作方法。
2、 掌握细胞冻存的方法。
二、实验原理
传代培养是组织培养的常规保种方法之一。
也是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中培养时，细胞不断生长增殖。
对于贴壁生长的细胞，单层细胞互相汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。
对于悬浮生长的细胞，细胞相互汇集成团。
这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足，营养障碍而死亡。
细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中的过程称为传代（或称继代）。
传代可获得大量细胞供实验所需。
体外培养的细胞，随着传代次数的增加，其各种生物特性会渐渐发生变化。
为此，需将培养的细胞及时冻存。
直接冻存细胞会导致细胞内外环境形成冰晶，从而使细胞内部发生一系列变化，进而引起细胞死亡。
因此，冻存细胞时常向培养液中加入适量的甘油或DMSO（二甲基亚砜），从而使冰点下降，通过缓慢冻存，避免或减少冰晶的形成。
三、实验材料
1、实验设备：
超净工作台、倒置相差显微镜、pH计、CO2培养箱、台式离心机、恒温摇床等。
2、实验器材：
吸量管、培养皿、离心管、冻存管、细胞记数板、细胞计数器、微量移液器等。
3、实验试剂：
D-Hanks溶液、含10%新生牛血清的DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶溶液、细胞冻存液。
四、实验步骤
（一）细胞传代
1、贴壁生长的细胞
（1）取80%汇合或刚汇合形成单层的细胞，吸弃旧培养液，用平衡盐溶液洗去残留的培养液。
（2）加入少量的胰蛋白酶液，37℃放置3-5分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞变圆后，用灭菌的吸量管进行吹打，使细胞脱离培养瓶壁。
（3）终止消化，吸弃消化液，加入含有血清的培养液。
（4）用吸管吸取培养瓶内的培养液溶液，反复吹打培养瓶底壁，使细胞分散。
（5）吹打获得的细胞悬液经1,000rpm离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀用培养液重新悬浮后记数。
（6）按照一定的细胞密度将部分细胞接种于新培养瓶中，补给一定量的新鲜培养液，继续培养。
2、悬浮生长的细胞
（1）将细胞悬液转入离心管内，1,000rpm,离心5分钟。
（2）弃上清，加入新鲜的培养液到离心管中，反复吹打，使细胞分散。
（3）细胞记数。
（4）按照一定的细胞密度将部分细胞接种于新培养瓶中，补给一定量的新鲜培养液，继续培养。
（二）细胞冻存：
1、配置冻存液：
即含10%DMSO及20%小牛血清的DMEM细胞培养液。
2、依照传代的方法把消化好的细胞收集于离心管中，计数后离心。
3、去除离心后的上清，加入冻存液，使细胞密度达到5×106-1×107/ml。
4、吹打细胞制成悬液，分装入冻存管中。
5、细胞分级冷冻要点——缓慢逐步降温：
4℃冰箱1小时；
-20℃冰箱1小时；
-80℃冰箱24-48h；
液氮罐中长期保存。
实验四化疗药物对肿瘤细胞杀伤的敏感实验
一、实验目的
掌握肿瘤细胞药敏实验设计与操作及结果分析。
二、实验原理
肿瘤细胞针对不同的化疗药物的杀伤，有不同的敏感性。
筛选出针对肿瘤高敏感而毒性小的化疗药物，对于指导肿瘤治疗的临床用药有重要意义。
其实验原理为：
将一定细胞数的肿瘤细胞接种于96孔培养板中，加入不同种类、不同浓度的化疗药物，作用24-48小时后，利用MTT法检测细胞存活情况，来判定肿瘤细胞对各种化疗药物的敏感性，从而筛选出针对这种肿瘤有效的化疗药物。
三、实验材料
1、实验设备：
离心机、CO2培养箱、酶标仪
2、实验器材：
吸管、离心管、微量吸液管、微量移液器、96孔培养板
3、实验试剂：
MTT、含10%FCS的培养基、PBS、DMSO（二甲基亚砜）、胰酶
4、化疗药物：
顺铂（DDP）、足叶乙甙（VP-16）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、长春新碱（VCR）
5、细胞株：
HeLa（人宫颈癌细胞株）、HeP-2（人喉癌细胞株）、HCT/8（人结肠癌细胞株）、U251（人胶质瘤细胞株）
四、实验步骤
（一）化疗药物浓度配置
不同剂量组药物实验终浓度（μg/ml）
分组
血浆峰值
浓度倍数
DDP
5-Fu
VP-16
VCR
1
10
120
2000
600
8
2
1
12
200
60
0.8
3
0.1
1.2
20
6
0.08
4
0.01
0.12
2
0.6
0.008
使用的化疗药物浓度按照血浆峰值浓度（μg/ml）=50×（临床每日用量（mg/Kg）/5000）×2×103）计算，以10倍、1倍、0.1倍、0.01倍实验，四种药物具体用量见上表：
（二）步骤
1、细胞培养及加药
（1）将HeLa、HeP-2、HCT/8、U251消化，计数、以每孔1×105细胞数接种到96孔板，每孔培养基液体为200µl，每一张96孔板接种两种细胞。
（2）将4种化疗药物以四种浓度，10µl加入各个孔中，做5平行孔，剩余孔做对照组。
（3）将96孔板放入CO2培养箱，培养48小时。
2、药物杀伤效率的测定
（1）向培养48小时后的细胞孔内加入10µlMTT，37℃作用3小时。
（2）吸弃孔内液体，用PBS洗一次，加入200µlDMSO，室温作用5分钟，可以轻微震荡，使蓝色结晶全部溶解。
（3）在酶标仪492nm处测定吸光度值。
（4）计算细胞的杀伤敏感率：
敏感率（%）=（对照组OD492－药物组OD492）/对照组OD492×100%，超过50%为高度敏感。
[思考题]
在设计药物对细胞的杀伤实验中，应注意哪几点？
实验五细胞融合实验
一、实验目的
1、 掌握杂交瘤技术的原理和细胞融合的基本方法。
2、 了解筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的制备与鉴定。
二、实验原理
杂交瘤技术主要是由免疫动物，细胞融合，筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，其核心是细胞融合。
免疫动物及细胞融合：
为了获得单克隆抗体，首先需要用特定的抗原免疫纯系动物已获得分泌预定抗体的B淋巴细胞，将分泌预定抗体的B淋巴细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合成为杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞获得了双亲本细胞的特性，既有分泌抗体的能力，又有无限繁殖的能力。
通常采用聚乙二醇促融。
筛选杂交瘤细胞，在细胞融合的过程，除了形成杂交瘤细胞外，还可能存在B淋巴细胞和B淋巴细胞的融合，骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合及未融合的亲代细胞，脾脏细胞在体外培养10天左右会自行衰亡，对杂交瘤细胞的生长无影响，而未融合的骨髓瘤细胞或其自身融合物，由于生长快，会抑制杂交瘤细胞的生长。
因此必须进行选择培养，通常应用HAT培养基筛选杂交瘤细胞。
HAT培养基是在一般的培养基内添加了叶酸拮抗物－氨基喋呤，用以阻断嘌呤和嘧啶的内源性生物合成途径，并提供了核苷酸的前体－胸腺嘧啶核苷、次黄嘌呤等，供细胞外源性生物合成用。
细胞DNA合成有主要通路和旁路两条途径，当细胞DNA合成主要通路被氨基喋呤阻断时，细胞可利用旁路进行DNA的合成。
在杂交瘤技术中应用的骨髓瘤细胞是经过用嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤或6-巯基鸟嘌呤筛选而得到的遗传基因缺陷型细胞系，它们缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或胸腺嘧啶核苷激酶，无法利用补充的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷旁路合成DNA，从而导致骨髓瘤细胞死亡，杂交瘤细胞在染色体杂交后，经旁路合成DNA，使杂交瘤细胞得以繁殖生存。
克隆化培养：
生长繁殖的杂交瘤细胞并非每个都能分泌预定的抗体。
因此，必须利用免疫荧光检测技术，免疫酶测定技术等手段，筛选出稳定分泌预定抗体的杂交瘤细胞。
为了保证分泌抗体的单一性，还必须通过有限稀释法或软琼脂克隆培养法进行多克隆化培养，这样就可以用来大量制备单克隆抗体。
单克隆抗体的大量制备与鉴定：
制备单克隆抗体的方法有两种，一是动物体内诱生法，即将杂交瘤细胞接种于同系小鼠或裸鼠腹腔内，经一定的时间，动物腹腔内产生含单克隆抗体的腹水；另一类是体外培养法，如悬浮培养系统，即采用转瓶或发酵罐式的生物反应器以及中空纤维细胞和微囊化细胞培养系统。
三、实验材料
1、实验动物：
7-12周龄BALB/C小鼠。
2、实验细胞：
骨髓瘤细胞MOPC-21。
3、手术器械：
大钩镊、眼科剪。
4、实验器皿：
玻璃平皿、吸量管、50ml离心管、孔径45μm尼龙纱网、96孔培养板。
5、实验试剂：
碘棉、75%乙醇、HAT选择培养基、PEG1000溶液、无血清RPMI-1640培养基。
RPMI-1640培养液的配制：
按包装袋上的说明，用新鲜三次蒸馏水配制。
内含10%新生牛血清，2mmol/L左旋谷氨酰胺、100μg/ml青霉素钠、100U/ml（硫酸）链霉素，调pH=7.0～7.2，过滤除菌，分装，-20℃贮存备用。
HAT培养液的配制：
在含10%小牛血清的RPMI－1640中，加次黄嘌呤136
μg/ml，氨基喋呤0.19μg/ml，胸腺嘧啶3.88μg/ml，冷冻避光保存（氨基喋呤对光敏感）。
PEG1000溶液（50%）的配制：
取25mlPEG1000溶液加入25ml无小牛血清的RPMI－1640溶液，常温保存。
6．实验设备：
超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、台式离心机、电子分析天平、酸度计等。
四、实验步骤
1、骨髓瘤细胞的培养：
骨髓瘤细胞以悬浮或半贴壁形式生长，用吸管吹打使细胞分散，传代培养，通常是细胞处于对数生长期。
用于融合实验的骨髓瘤细胞还必须对HAT培养液敏感。
在融合实验前两周，细胞要培养在筛选建株时应用的碱基类似物致死剂8-鸟嘌呤培养基中。
融合前一天传代一次，接种浓度可为4×105~5×105/ml并换为常规培养液。
2、制备饲养层细胞（小鼠腹腔渗出细胞）：
为了使融合后的杂交瘤细胞获得最佳的生长条件以及增加杂交瘤的产量，常需制备饲养层。
BALB/C小鼠脱颈处死后，75％酒精浸泡5min，无菌暴露腹腔，腹腔内注射10mlRPMI-1640培养液，吸出腹腔渗出细胞调整浓度到1×105/ml，接种于96孔板，每孔100μl。
3、免疫脾细胞制备：
（1）免疫动物：
根据骨髓瘤细胞株的来源选择脾细胞的供体。
目前应用的最普遍的是BALB/C小鼠，免疫动物所用的抗原剂量取决于免疫原性。
细菌、病毒颗粒性抗原一般具有较强的免疫原性，用这类抗原免疫动物可不用佐剂，而可溶性抗原常需加佐剂，在小鼠颈背部皮下多点注射或腹腔注射，隔2~4周后，取同量的抗原加不完全佐剂追加免疫一次，再间隔4周，取同量的抗原不加佐剂经静脉或腹腔追加免疫。
（2）制备免疫脾细胞悬液：
BALB/C小鼠脱颈处死后，75％酒精浸泡5min，无菌暴露腹腔取脾，放入无血清RPMI-1640培养基进行研磨，尼龙纱网过滤，吸取脾细胞悬液进行离心（1500rpm，5min），弃上清，加少量培养液重悬细胞并计数，一般一个脾脏平均可得1×108个脾细胞。
4、细胞融合：
（1）融合前一天将PEG1000放入CO2培养箱中调整pH至7.2-7.4。
（2）将PEG1000和培养液置37℃水箱中温热。
（3）将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1：
5的比例（2×107个骨髓瘤细胞和
1×108个脾细胞混合），用小玻璃棒轻轻地混合无血清培养液中的细胞，避免用吸管强烈地吹吸以免损伤细胞，离心1500rpm，5min。
（4）弃掉所用的上清（PEG的浓度是严格的，若遗留上清液将影响PEG浓度），不要旋动或敲打试管，保持细胞团完整。
（5）将试管放在恒温干浴中，保持37℃温热，用1ml吸管慢慢地将37℃预温的50%PEG1000溶液0.8ml加至密集的细胞团中，用吸管尖端慢慢搅动，使PEG与细胞混合，但不要吹吸。
（6）试管仍放在干浴中，用吸管尖端继续缓缓搅动1分钟。
（7）在1分钟内加完1ml预温的培养液，试管仍放在干浴中以保持温度，重复一次此操作。
（8）于2分钟内加入10ml37℃预温的培养液。
（9）1500r/min离心10分钟。
（10）去除上清液，重新将细胞悬浮于培养液中，使最后浓度为1×106细胞/0.12ml（相当于5ml吸管的2滴）。
（11）用无菌的5ml吸管，将细胞悬液加于已在前一天接种了饲养细胞（每孔含1×104饲养细胞/0.1ml）的96孔培养板中，每孔2滴。
[思考题]
制备杂交瘤细胞的关键是什么？
实验六植物细胞培养基的种类及配制
一、实验目的
1、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。
2、掌握MS培养基的配制方法。
二、实验材料
1、实验设备：
高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净工作台。
2、实验器材：
电磁炉、烧杯、量筒、搅拌棒、吸量管、移样枪。
三、植物细胞培养基的种类
在100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中，研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方，但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演变而来的，其中应用最为广泛的仍为MS培养基。
植物组织培养基早期的建立，如White提出的根培养基和Gautheret提出的愈伤组织培养基，都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而来的。
以后所有的各种培养基又都是在White培养基和Gautheret培养基的基础上形成的。
各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。
常用培养基中根据无机盐的含量可以分为4类，分述于下：
1、高无机盐含量培养基：
高无机盐含量培养基中，钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生
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