UPLC MSMS和HPLC MSMS操作规程.docx

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UPLCMSMS和HPLCMSMS操作规程

ABSCIEXTRIPLEQUADTM5500的PPG质量准确度校准

操作规程

一、前期准备

1、PPG稀释溶液的准备，对于5500系列采用的标准溶液：

正离子模式：

POSPPG2E-7M;负离子模式：

NEGPPG3E-5M

2、离子源的垂直旋钮调至“5位。

3、用质谱仪上的针泵式进样针吸取适量的PPG校准液，检查管路是否连接好。

二、操作步骤

1、双击“HardwareConfiguration”，激活“MSOnly”。

2、菜单栏切换到“Installation”项目。

3、双击“ManualTurning”，打开手动调谐界面。

4、点击“OpenFile”，选择相对应的采样方法（Q1PosPPGs.damQ3PosPPGs.damQ1NegPPGs.damQ3NegPPGs.damj），先正离子再负离子，先Q1调谐再Q3调谐，扫描速率依次为10、200、1000、2000Da/s,对应MCA分别为10、50、50、100。

5、点击“StartSyringePump'，再点击“Start”开始采集数据。

6、将会在界面上出现采集到的质谱图，右键点击右侧质谱图区域，

选择“OpenDate"。

7、点击工具栏中的“CalibrationFromSpectrum”。

8在弹出的菜单中选择合适的校验标准，在“Standarc”中选择对应的校准溶液，点击“Start”开始校准前的计算。

9、第一个图形代表的是此次校准与理论值的质量偏差，各点应位于

“士O.IDa”线内。

若某质量点超出了设定的范围，则应点击“UpdateMassCalibration”，更新那些偏离的质量点的电场参数，使之落到“士O.IDa”线内。

10、第二个图形代表的是PPG校准峰的半峰高宽度，各点应位于

“0.6~0.8‘范围内。

若某点质谱峰半峰宽超出标准范围，点击界面上

的“Advaneed”按钮，调节对应的“Offset”电压，使之合规。

质谱分辨率

质谱半峰宽（FHWM）

Offset值增加

提高

减小

Offset值降低

降低

增加

11、第三个图形代表的是此次校准与上次校准所有PPG校准点峰强

度变化的百分比。

14、待校准完成后，点击“Stop”停止进样，并灭活“MassOnly”。

三、结束工作

针泵吸取50%甲醇水溶液，对管路进行冲洗，2~3次即可

标准品质谱条件调谐（TuneandCalibrate）

操作规程

一、前期准备

1、检查离子源是否干净，将垂直旋钮跳到“5”位。

2、用50%甲醇水溶液（乙腈水溶液也可）配置20~50ng/mL的标准溶液（根据响应值调节浓度，将目标化合物母离子与周围离子响应值相差明显即可）。

V正离子化合物，可添加0.1%甲酸V负离子化合物，无需添加

二、操作步骤

1、创建project:

打开Analyst软件，在菜单栏中打开“Tools”，选择“project”下的“CreateProject',输入“Projectnamg'即可。

2、双击“HardwareConfiguration”，激活“MSOnly”，双击“ManualTuning”，打开调谐界面。

3、Q1Scan：

在当前界面设置扫描模式为“Q1MS（Q1）”，将扫描范围设为100~MW+30，扫描速率为200Da/s,Duration为5min,先点击“StartSyringePump,再点击“Start”，找到目标化合物母离子。

待扫描完成后，选择“Center/Width”，将目标母离子的m/z输入“Center

（Da）”中，“Width（Da）”设置为3,“Scanrate设置为10Da/s,选上“MCA',“Cycle”设置为20~50,点击“Acquire”采集数据并保存。

4、ProductionScan扫描模式为“ProductIon（MS2）”，在“Product

of”中输入母离子的m/z,将CE值修改为5eV,扫描范围为100~MW+30，扫描速率约200Da/s,Duration为5min,点击“Start开始扫描，以5eV为步长手动调节CE,找到合适的子离子（母离子的强度为基峰强度的1/3到1/4为宜），点击“Stop”选上“MCA，

“Cycles”设置为20~50,点击“Acquire”采集数据并保存二级质谱

图（若要获得柱状图需在AdvaneedMS中选择Centroid）。

5、优化化合物参数：

根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对，输入右侧框中，每对离子对建议分析时间为100ms（若化合物比较多减小时间），并输入ID。

点击“EditRamp…”，先后选择CE和DP，点击“Star进行优化，将优化好的CE和DP值添加到表格中。

6、保存质谱方法，灭活“MSOnly”。

三、结束工作

针泵吸取50%甲醇水溶液，对管路进行冲洗，2~3次即可。

ACQUITYUPLC串联质谱（UPLC-MS/MS）

操作规程

一、前期准备

1、检查线路是否连接完好。

2、最重要的是离子源的垂直旋钮调至“2”位。

3、将流动相准备好，过0.45微米的滤膜并超声脱气。

4、连接好进样采集触发线。

二、操作步骤

1、打开UPLC的SampleManage和BinarySolventManager电源，待其自检完成后，打开质谱分析软件，左下角双击“ACQUITYConsole”,点击“Control”，分别进行“PrimeA/Bsolvents...”和I“Primesealwash，用A、B流动相冲洗5min。

2、激活“UPLCMS”。

3、安装并用甲醇或乙腈活化新的色谱柱，一般活化30min即可。

4、点击Analyst软件菜单栏中的“Script”，选择“MergeMRM”合并所需测的多种目标分析物的MRM通道（也可双击“BuildAcquisitionMethod”建立方法手动输入），并存储一个新的采样离子通道的质谱方法文件。

5、双击“BuildAcquisitionMethod”，将同步模式选为“LcSync”，

打开文件选择需要的质谱方法。

点击“EditParameters',设置“CUR”:

35;“IS”：

+5500（正离子），-4500（负离子）；“TEM”：

550C;“GS1”:

50;“GS2”：

50;每一个的MRM的驻留时间（DwellTime）要进行

优化，尽可能使“TotalSeanTime”控制在最窄峰的峰宽的1/12;

Duration”与UPLC的样品运行时间设为一致，保存此质谱方法。

6、双击左侧栏“ACQUITYMethodEditor”，通过“File”打开刚保存

的质谱方法。

选择进样方式、进样针的强洗和弱洗、色谱柱温度及样品室温度、流动相组成与梯度程序及运行时间（与质谱分析时间一致），保存此方法。

7、双击左侧栏“BuildAcquisitionBatch”建立处理批次，选择上述

保存的方法，添加批次（SET1可修改为日期），添加样品，设置样品名称、甁号（48vial2mLholder）及“Datefile”，保存此批次。

&提交（submit）此样品序列，点击工具栏中“Equilibrate”按钮，观察压力变化，待Delta”小于50时，点击工具栏中“Ready”，准

备进样，在“ViewQueue”界面下可查看所提交的序列，准确无误后，点击“startsample’开始进样。

三、结束工作

1、重新建立一个分析批次，选择Penicillin项目下的

“UPLC_MS_FLUSH”方法，放置空白样品（水）于样品盘中，提交并运行，对液相及质谱仪进行冲洗。

2、待机器冲洗完毕后，灭活“UPLCMS”系统，关闭质谱软件，关

闭UPLC电源。

WatersAllianceHPLCe2695串联质谱（HPLC-MS/MS）

操作规程

一、前期准备

1、检查线路是否连接完好。

2、离子源垂直旋钮调至“2位。

3、将流动相准备好，过0.45微米的滤膜并超声脱气。

4、连接好进样采集触发线。

二、操作步骤

1、打开WatersHPLCe2695的SeparationsModule主机电源，待自检完成后（屏幕显示Idle），在控制屏点击Menu/Status”，选择“DirectFunction”进入冲洗选项界面，分别进行“DryPrime”、“WetPrime”及“PurgeInjector”，排除管道内的气泡。

2、安装并活化新的色谱柱，一般活化30min即可。

3、打开桌面“Empower”软件，输入用户名（system）及密码（manage）。

点击“配置系统”，在配置管理器界面打开“系统”，将“alliance_MS”改为在线模式。

左栏点击“项目”添加新项目并保存。

4、在软件初始界面，点击“运行样品”，选择所需项目及色谱系统。

5、通过菜单栏“编辑”选择“仪器方法”，新建液相方法，设置流动相组分、洗脱程序、柱温及样品室温度，保存当前的仪器方法。

6、通过菜单栏“编辑”选择“新建方法组”，使用向导模式创建新方法组，选择上述方法，点击“完成”。

7、在主界面上编辑样品运行序列，选择所需的“方法组/报告方法”，输入“进样体积”、“样品名称”及“运行时间”。

8将控制质谱电脑上的Analyst软件打开，激活“HPLC（2695）_MS”。

9、点击Analyst软件菜单栏中的“Script”，选择“MergeMRM”合并所需测的多种目标分析物的MRM通道，并存储一个新的采样离子通道的质谱方法文件（也可双击“BuildAcquisitionMethod”建立方法手动输入）。

10、双击“BuildAcquisitionMethod”，将同步模式选为“LcSync”，打开文件选择需要的质谱方法。

点击“EditParameter”设置“CUR”：

35;“IS”：

+5500（正离子），-4500（负离子）；“TEM”：

550C;“GS1”：

50;“GS2”：

50;每一个的MRM的驻留时间（DwellTime）要进行优化，尽可能使“TotalScanTime”控制在最窄峰的峰宽的1/12;

Duration”与HPLC的样品运行时间设为一致，保存此质谱方法。

11、编辑出与液相相同顺序的样品运行序列。

12、在Waterse2695主机SeparationsModule界面上输入仪器方法的初始流动相比例进行平衡色谱柱，监测系统压力，待Delta值降至50以下即可。

13、在质谱控制电脑上，点击“Submit”进行样品提交，再点击“Startsample”，待右下角四级杆图谱变为“Wait”状态，在液相端电脑上点击运行样品即可进行分析。

三、结束工作

1、在Empower操作界面，添加一个空白样品（水）,设置进样数为1,

“方法组/报告方法”为“HPLCMSFLUSH”。

2、在Analyst软件界面上，打开编辑一个空白样品（水），选择Penicillin项目下的“HPLCMSFLUSH”方法，并提交运行样品，同样在Empower软件中点击运行，完成冲洗工作。

3、待冲洗完毕后，灭活“HPLC（2695）_MS”，关闭软件。

4、关闭HPLC的电源。

WatersAllianceHPLCe2695

操作规程

一、前期准备

1、检查线路是否连接完好。

2、将流动相准备好，过0.45微米的滤膜并超声脱气。

二、操作步骤

1、打开WatersHPLCe2695主机的SeparationsModule主机电源，待自检完成后（屏幕显示Idle），在控制屏点击Menu/Status”选择

“DirectFunction”进入冲洗选项界面，分别进行“DryPrime”“WetPrime”及“PurgeInjector”排除管道内的气泡。

2、安装并活化新的色谱柱，一般活化30min即可。

3、打开桌面“Empower”软件，输入用户名（system）及密码（manager）。

点击“配置系统”，在配置管理器界面打开“系统”，将

“alliance_PDA/ELSD/DAD…”改为在线模式。

左栏点击“项目”添加新项目并保存。

4、在软件初始界面，点击“运行样品”，选择所需项目及色谱系统。

5、通过菜单栏“编辑”选择“仪器方法”，新建液相方法，设置流动相组分、洗脱程序、柱温、样品室温度及检测器参数，保存当前的仪器方法。

6、通过菜单栏“编辑”选择“新建方法组”，使用向导模式创建新方法组，选择上述方法，点击“完成”。

7、在主界面上编辑样品运行序列，选择所需的“方法组/报告方法”，输入“进样体积”、“样品名称”及“运行时间”。

8在Waterse2695主机的SeparationsModule界面上输入仪器方法的初始流动相比例进行平衡色谱柱，监测系统压力，待Delta值降至

50以下即可。

打开检测器电源待其自检完成，若出现连接失败，右

击监测器窗口点击重设，打开检测器灯。

9、点击工具栏中“运行”，进样分析。

三、结束工作

1、在Empower操作界面，添加一个空白样品（水），设置进样数为1，

“方法组/报告方法”为“HPLCMSFLUSH”，点击工具栏“运行”，进行冲洗。

此外，所有管路最终都要用有机试剂进行灌注清洗。

2、待冲洗完毕后，将检测器灯关闭，再关闭检测器电源，关闭HPLC的电源。

ACQUITYUPLC操作规程

一、前期准备

1、检查线路是否连接完好。

2、将流动相准备好，过0.45微米的滤膜并超声脱气。

二、操作步骤

1、打开桌面“Empower”软件，输入用户名（system）及密码（manager）。

点击“配置系统”，在配置管理器界面打开“系统”，将

“alliance_PDA/ELSD/DAD…”改为在线模式，其他为离线模式。

左栏点击“项目”添加新项目并保存。

2、点击“运行样品”打开操作页面，左下角启动ACQUTYUPLC控制台，点击菜单栏“控制”中“启动系统”对整个管路进行灌注清洗，排除管道内的气泡。

3、安装并活化新的色谱柱，一般活化30min即可。

4、通过菜单栏“编辑”选择“仪器方法”，新建液相方法，设置流动相组分、洗脱程序、柱温、样品室温度及检测器参数，保存当前的仪器方法。

5、通过菜单栏“编辑”选择“新建方法组”，使用向导模式创建新方法组，选择上述方法，点击“完成”。

6、在主界面上编辑样品运行序列，选择所需的“方法组/报告方法”，输入“进样体积”、“样品名称”及“运行时间”。

7、在二元溶剂管理器界面上输入仪器方法的初始流动相比例进行平衡色谱柱，监测系统压力，待Delta值降至50以下即可。

打开检测器电源待其自检完成，打开检测器灯，待其稳定。

&点击工具栏中“运行”，进样分析。

三、结束工作

1、先用20%甲醇水溶液冲洗管路30min,再用纯甲醇冲洗30min

此外，所有管路最终都要用有机试剂进行灌注清洗。

2、待冲洗完毕后，将检测器灯关闭，再关闭检测器电源，关闭HPLC的电源。

3、打开桌面“Empower”软件，点击“配置系统”，在配置管理器界面打开“系统”，将“UPLC”改为在线模式，其他为离线模式，以方便UPLC-MS/MS的使用。