生物分析检测技术.docx

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生物分析检测技术

生物分析检测技术

一、高速离心机原理：

离心机就是利用离心力使得需要分离的不同物料得到加速分离的机器。

其主要分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。

过滤式离心机的主要原理是通过高速运转的离心转鼓产生的离心力（配合适当的滤材），将固液混合液中的液相加速甩出转鼓，而将固相留在转鼓内，达到分离固体和液体的效果，或者俗称脱水的效果。

沉降式离心机的主要原理是通过转子高速旋转产生的强大的离心力，加快混合液中不同比重成分（固相或液相）的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。

高速冷冻离心机一般最大转速为10000～30000rpm，最大相对离心力为90000g左右，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消除高速旋转时转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0～40℃，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示使用方法：

一、离心机的准备：

在离心操作前必需首先准备好离心机。

备机包括：

1.机型的选择：

即根据具体的实验要求选择水平式离心机或斜角式离心机。

2.离心套筒的准备：

检查离心套筒内是否有橡皮缓冲胶垫，胶垫上若附着碎玻璃等杂物应清除。

3.离心机检查：

检查离心机安放是否平稳，转轴是否牢固，润滑是否良好，离心腔内有无异物，缸盖能否锁紧等。

二、电源的准备电源应选择与离心机使用说明书相吻合的电源，电原插座必须有地线以保证离心安全。

若实验室没有合适的电源，则应重新安装电源线，电源插座应靠近离心机以方便操作。

三、平衡附件的准备平衡附件包括：

1.天平：

普通离心机用1／1000的台秤进行离心平衡，台平上固定两个等重的烧杯，以备平衡之用。

2.离心管和配平管：

离心管用于装离心液，配平管用于装配乎液（注意：

配平管的长度一般不宜超过离心管的长度，以避免水平离心时被转轴打碎）。

3.烧杯与皮头吸管：

烧瓶用来盛配平液，皮头吸管用来吸配平液进行配平。

四、离心液的准备离心液应根据具体的实验要求进行准备。

五、试机在以上准备完成以后，应先让离心机进行空载运转，密切观察空载运转情况是否正常，在无异常时方可进行离心。

二、实验操作：

1．取离心管装上离心液放于一对重量相近的离心套筒的橡胶孔中，离心液面距离心管口至少应留2cm的距离，以免离心时离心液溅出。

2．调平称量天平，将置于离心机对称位置上的离心套筒、离心管及内盛物配平，相差不超过0.05克，将平衡好的离心套筒放于离心机支架对称位置的吊环中，上离心机缸盖，锁牢。

。

3．检查离心机是否安放平稳，电源开关及调速杆。

4．设置离心机的操作参数（速度、时间、温度）。

5．插上电源插头，打开电门开关。

6．按Start键，离心机运行。

离心完毕，将调速杆缓慢退回到零位，关掉电门，拔下电源插头，任离心机自停（切记：

不能用手助停，以免沉淀物泛起、损坏离心转轴、碰伤人的肢体）。

7．待离心机完全停止转动后，打开缸盖取出离心套筒及离心管。

8．清洁离心套筒、离心管及离心腔。

9.纪录离心机的使用情况。

注意事项：

1.离心前必需将放置于对称位置上的离心套筒、离心管及离心液进行精确平衡，重量差不超过0.05克。

对于高速和超速离心机，不仅要求重量平衡，而且要求配平液的密度与离心液的密度相等，以达到力矩平衡。

2.离心机安放要求水平、稳固，转轴上的支架要牢固，转轴润滑良好，吊栏应活动自如，保证离心机的正常运转。

3.离心管盛液不宜过满，避免腐蚀性液体溅出腐蚀离心机，同时造成离心不平衡。

4.离心开始前应检查转头是否拧紧。

放入离心套筒后应紧盖、锁牢，防止意外事故的发生。

离心完毕应关电门、拔掉电源插头任机自停，严禁用手助停，以免伤人损机，使沉淀泛起。

5.注意离心机的保养和四防。

离心机使用完毕，要及时清除离心机内水滴、污物及碎玻璃渣，擦净离心腔、转轴、吊环、套筒及机座。

经常做好离心机的防潮、防过冷、防过热、防腐蚀药品污染，延长使用寿命。

6.离心过程若发现异常情况应立即按Stop键，然后，再进行检查。

如听到碎玻璃渣声响，可能是试管被打碎，应重新更换试管。

若整个离心机座转动起来，则是严重不平衡所至。

若离心机不转动，则可能是保险丝烧断，应重新更换保险丝。

若发生机械或电机故障，应报告指导教师请专门维修人员检修。

生物学应用:

通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等的分离与纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器（如核蛋白体）或单个分子。

二、流式细胞仪原理：

参数测量原理流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。

测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。

液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。

散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。

未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。

经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。

散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：

①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。

这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。

一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。

侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。

侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。

当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。

光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：

①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。

自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。

在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。

一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：

①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

样品分选原理流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。

总的过程是：

由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。

一般液滴间距约距约数百m。

实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。

其中v是液流速度，d为喷孔直径。

由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。

使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。

充电电压一般选+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。

充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。

精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。

可根据具体要求予以适当调整。

（50）数据处理原理：

FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。

数据显示：

FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。

直方图是一维数据用作最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般XY平面描图仪给出的曲线。

根据选择放大器类型不同，坐标可以是线性标度或对数标度，用道数来表示,实质上是所测的荧光或散射光的强度。

坐标一般表示的是细胞的相对数。

图10-2给出的是直方图形式。

只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。

二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。

坐标和坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标植的细胞存在（图10-3）。

可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。

所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。

二维等高图类似于地图上的等高线表示法。

它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。

等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即等高。

曲线层次越高所代表的细胞数愈多。

一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。

图10-4给出了二维等高图的样式。

假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。

它把原二维图中的隐坐标细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察山峰和谷地的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。

列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。

可用ListMode中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。

例如，一调二就是在一维图上调出二维图来；二调一就是从二维图中调出一维图来。

图10-6给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。

上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了解和获得尽可能多的有用信息。

数据分析：

数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。

当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。

数学模型可以是一个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。

例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。

如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。

方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。

而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。

分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。

逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。

我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。

事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。

从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础。

逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。

考虑到FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。

对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。

顺便指出，进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到差结果曲线往往是适宜的。

因为数据分析往往和结果解释关系十分密切，也就是说和生物学背景相关，因此具体的分析法和原理将在后面结合实例再介绍。

使用方法：

1、调试和校准流式细胞仪在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。

调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。

激光强度：

除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。

液流速度：

可通过操作台数字显示监督，调节气体压力大小以获得稳定的液流速度。

测量区光路调节：

这是调试工作的关键。

需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。

一般可在用标准荧光微球等校准中完成。

流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。

因而FCM中的校准具有双重功能：

仪器的准直调整和定量标度。

标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好，且经济、容易获得。

常用标准荧光微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。

微球用树脂材料制作，或标有荧光素，或不标记荧光素。

所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下：

取3.8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血（抗凝剂：

鸡血=1：

4），经PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化24h，最后经PBS再清洗，贮4℃冰箱中备用。

需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。

2、仪器的操作和使用①打开电源，对系统进行预热；②打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；⑧将所需结果打印出来。

注意事项：

1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的暗适应以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；2）光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；3）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；5）特别强度每次测量都需要对照组。

生物学应用：

1.分析细胞表面标志2.分析细胞内抗原物质3.分析细胞受体4.分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量5.分析免疫细胞的功能[1]