果实品质的测定.docx

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果实品质的测定

17.2.3维生素C总量的测定

17.2.3.1方法原理

维生素C总量包括还原型Vc、脱氢型Vc和二酮古乐糖酸，将样品中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，进一步水解为二酮古乐糖酸。

二酮古乐糖酸与2,4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎。

其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。

17.2.3.2主要试剂

1.10g·L-1草酸，20g·L-1草酸；

2.酸处理活性炭：

取活性炭200g，加入1∶9HCl1000mL，煮沸后，抽气过滤，再用沸水1000mL煮沸过滤，重复用水洗至溶液中无Fe2+离子（用10g·L-1KSCN溶液试验无红色），放在100~120℃烘干。

3. 20g·L-1 2,4-二硝基苯肼溶液：

称取2,4-二硝基苯肼（分析纯）2.00g溶解于100mL4.5mol·L-1H2SO4中。

4. 4.5mol·L-1 H2SO4溶液：

量取浓H2SO4（分析纯）250mL，慢慢倒入750mL水中，边加边搅拌。

5. 100g·L-1硫脲溶液：

用500mL·L-1酒精溶液溶解5.00g硫脲（分析纯），使其最终体积为50mL。

6.H2SO4（9∶1）溶液：

量取浓硫酸90mL，慢慢倒入10mL水中。

7.标准Vc溶液：

称取维生素C（C6H8O5，分析纯）20mg溶解于10g·L-1草酸溶液中，移入100mL容量瓶中，并用10g·L-1草酸溶液定容。

吸取此溶液50mL，加入活性炭0.1g，摇1min，过滤。

吸取此溶液5mL于100mL容量瓶中，用10g·L-1草酸溶液稀释定容。

此Vc工作液为10μg·mL-1。

17.2.3.3操作步骤

1.样品处理：

称取适量样品（m）加等重量的20g·L-1草酸溶液，在组织捣碎机中打成浆状。

取浆状物20g用10g·L-1草酸溶液移入100mL容量瓶中，定容过滤。

2.样品中总Vc的测定：

取滤渡10mL，加入10g·L-1草酸10mL（总Vc约1~10μg·mL-1），加一勺活性炭。

摇1min，静置过滤。

各取滤液2mL于样品管和样品空白管中，各管加入1滴硫脲溶液（注1）。

于样品管中加入2,4-二硝基苯肼0.5mL，两管都加上盖子，置于37℃保温箱中保温3h。

然后取出样品管放入冰水中（终止反应）。

样品空白管取出后冷却至室温，然后加入2,4-二硝基苯肼0.5mL。

然后在样品管和样品空白管皆置于冰浴中，从滴定管中滴加9∶1硫酸溶液2mL于各管中，边滴边摇试管（防止溶液温度上升，溶液中糖炭化而转黑色）。

将各管从冰浴中取出，在室温下放置30min后（注2），立即在分光光度计540nm波长比色，读取吸收值，根据吸收值从标准曲线查出相应含量。

3.标准曲线的绘制：

吸取Vc标准工作液10，20，30，40，50mL稀释至50mL，即此系列含有2，4，6，8，10μg·mL-1的Vc标准溶液。

各取2mL于各标准管中，以下操作步骤同上样品测定。

以上述Vc浓度系列为横座标，以吸收值（A）为纵座标作标准曲线。

17.2.3.4结果计算

       Vc总量（mg·kg-1）=ρ×20×1000/1000=ρ×20

式中   ρ—从标准曲线查得的总抗坏血酸的含量（μg·mL-1）；

        20—样品稀释倍数[（2m/m）×（100/20）×（20/10）=20]；

        1000—分别代表1000g样品中总Vc的含量和将μg换算成mg。

17.2.3.5注释

注1.硫脲可防止Vc被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。

注2.加入H2SO4（9∶1）溶液后试管从冰水中取出，溶液颜色会继续变深，所以必须准确加入H2SO4后30min内比色。

还原糖和总糖测定

一、目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计

的使用。

二、原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

小麦面粉；精密pH试纸。

2．主要仪器

（1）具塞玻璃刻度试管：

20mL×11

（2）大离心管：

50mL×2

（3）烧杯：

100mL×1

（4）三角瓶：

100mL×1

（5）容量瓶：

100mL×3

（6）刻度吸管：

1mL×1；2mL×2；10mL×1

（7）恒温水浴锅

（8）沸水浴

（9）离心机

（10）扭力天平

（11）分光光度计

3．试剂

（1）1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

（3）碘-碘化钾溶液：

称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂：

称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。

（5）6MHCl和6MNaOH各100mL。

四、操作步骤

1．制作葡萄糖标准曲线

取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。

调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线

2．样品中还原糖和总糖的测定

（1）还原糖的提取

准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。

将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

（2）总糖的水解和提取

准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6MHCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。

待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。

将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。

（3）显色和比色

取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。

加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。

五、结果与计算：

计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

六、附注

1．离心时对称位置的离心管必须配平。

2．标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。

3．面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。

七、思考题

1．3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?

2．如何正确绘制和使用标准曲线?

参考答案

1．植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。

而没有还原性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

2．标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.5~2cm，标示出刻度和葡萄糖的毫克数；纵坐标轴距坐标纸左边1.5~2cm，标示刻度和光密度值；曲线为过原点的直线，测定点均匀分布在直线的两侧；标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中的物质含量。

对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线；测定数据不应记在标线上