苏教新选修1 《分子生物学技术》学案.docx

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苏教新选修1《分子生物学技术》学案

第43讲　生物化学与分子生物学技术实践

[考纲要求]　1.蛋白质的提取和分离。

2.PCR技术的基本操作和应用。

3.从生物材料中提取某些特定的成分。

考点一　蛋白质的分离与纯化技术[重要程度：

★☆☆☆☆]

1．纯化原理

蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度、所带电荷的多少、吸附性质等方面存在差异。

2．纯化方法

（1）薄膜透析法

①原理：

蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。

②目的：

去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸等。

③常用的半透膜：

肠衣、玻璃纸。

④步骤：

将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析液中即可。

（2）离心沉降法

①原理：

在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，从而被分离。

②目的：

使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质彼此分离。

（3）电泳

①概念：

带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。

②原理：

不同的物质所带电荷不同，颗粒的大小、形状不同，因此，在电场中的泳动速度不同。

③影响泳动的因素：

带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的pH等因素。

④泳动特点：

带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。

⑤支持物：

滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。

1．薄膜透析法

（1）过程：

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。

（2）图示：

2．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

（1）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳流程

（2）结果及其分析

①结果

②结果分析

从电泳图谱示意图中可以看出：

a.血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：

γ球蛋白>α1球蛋白>α2球蛋白>β球蛋白；

由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带有负电荷，且四种球蛋白的电量大小依次为：

α1球蛋白>α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。

1．仔细观察下图，所带负电荷少的球蛋白是（　　）

A．α1球蛋白B．α2球蛋白

C．β球蛋白D．γ球蛋白

答案　D

解析　对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且γ球蛋白距点样处最近，所以γ球蛋白所带负电荷最少。

2．关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是（　　）

A．分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来

B．抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂

C．蛋白质的粗提取物离心可除去一些小分子杂质

D．蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物

答案　C

解析　对抽提得到的粗提取物离心可除去固体杂质。

考点二　从生物材料中提取某些特定成分[重要程度：

★☆☆☆☆]

1．植物芳香油的基本知识

（1）来源：

芳香油是植物在代谢中的产物。

（2）特点：

具有很强的挥发性，易溶于有机溶剂。

（3）应用：

玫瑰精油是制作高级香水的主要成分，能使人产生愉悦感；橘皮芳香油的主要成分是柠檬烯，具诱人的橘香味，是生产食用香精、化妆品香精和医药香精的优质原料。

2．橘皮精油的提取流程与关键

石灰水浸泡→漂洗→压榨→过滤→静置→再次过滤→橘皮精油

（1）橘皮的处理：

干燥后一定要用石灰水浸透，时间至少10h以上。

（2）压榨液的处理：

可以先用普通布袋过滤除去固体物和残渣，然后离心进一步除去质量较小的残留固体物，再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮精油分离出来。

植物芳香油提取方法的比较

提取方法

水蒸气蒸馏法

压榨法

萃取法

实验原理

利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来

通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油

使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂获得芳香油

方法步骤

①水蒸气蒸馏

①石灰水浸泡、漂洗

①粉碎、干燥

②分离油层

②压榨、过滤、静置

②萃取、过滤

③除水过滤

③再次过滤

③浓缩

适用范围

适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油

适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取

适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中

优点

简单易行，便于分离

生产成本低，易保持原料原有的结构和功能

出油率高，易分离

局限性

水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题

分离较为困难，出油率相对较低

使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量

易错警示　

（1）植物芳香油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、压榨法、萃取法。

水蒸气蒸馏是植物芳香油提取的常用方法，但会导致原料焦糊或有效成分水解等，若植物有效成分易水解，则不宜采用此法。

玫瑰精油、橘皮精油、胡萝卜素的提取分别采用水蒸气蒸馏法、压榨法、萃取法。

（2）水蒸气蒸馏可用明火加热，萃取过程应该避免明火加热，采取水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接用明火加热容易引起燃烧、爆炸。

（3）用于萃取的有机溶剂必须事先精制，除去杂质，否则会影响芳香油的质量。

（4）在用水蒸气蒸馏法制取玫瑰精油时，玫瑰乳浊液提纯过程中油水混合物中要加入氯化钠的目的是增大盐水的密度，有利于玫瑰精油与水的分层。

加入无水Na2SO4的目的是吸收精油中残留的水分。

（5）橘皮精油的提取过程中，橘皮洗净晾干后，要浸泡在pH大于12、质量分数为7%～8%的石灰水中16～24h，其目的是防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。

1．请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题：

（1）植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、________和________。

（2）芳香油溶解性的特点是难溶于________，易溶于________，因此可用________作为提取剂来提取芳香油。

（3）橘子果实含有芳香油，通常可用________作为材料提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材料，理由是______________________________________________________

________________________。

（4）对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物获得乳状液可采用的方法是________。

（5）得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的________层，原因是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

加入氯化钠的作用是________________________________________________________

______________________________。

（6）从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，其作用是________________。

答案　

（1）蒸馏法　萃取法　

（2）水　有机溶剂　有机溶剂（3）橘子皮　芳香油含量较高　（4）过滤　（5）上　油层的密度比水层小　增加水层密度，使油和水分层　（6）吸收芳香油中残留的水分

解析　植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、蒸馏法和萃取法。

一般采用新鲜的橘子皮来提取芳香油，因为新鲜的橘子皮芳香油含量较高。

除去液体中的固体常用的方法是过滤。

芳香油密度比水小，且不溶于水，会浮在液体的表面。

加入氯化钠会增加水层密度，使油和水分层。

无水硫酸钠可以吸收芳香油中残留的水分。

考点三　PCR技术[重要程度：

★★☆☆☆]

1．PCR原理

DNA热变性原理，即：

2．条件：

模板、原料、酶、ATP。

3．场所：

体外PCR扩增仪。

4．方向：

DNA复制的具体过程涉及DNA双链的方向。

DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（—OH）末端称为3′端，两个磷酸基团的末端称为5′端。

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。

当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端

延伸。

5．过程

（1）变性：

当温度上升到94_℃以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：

（2）退火：

温度下降到40～60_℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

（3）延伸：

温度上升到72_℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

PCR技术和DNA复制的比较

DNA复制

PCR技术

场所

细胞核内

生物体外

原理

碱基互补配对

碱基互补配对

酶

DNA聚合酶、解旋酶

耐热的DNA聚合酶（Taq酶）

条件

模板、ATP、引物链（RNA）、常温

模板、ATP、引物链（DNA及RNA片段）、温度变化（94℃→40～60℃→72℃左右）

原料

四种脱氧核苷酸

四种脱氧核苷酸

特点

形成的是整个DNA分子，一个细胞周期只复制一次

短时间内形成大量目的基因DNA片段，呈指数增长——2n

1．多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题：

（1）DNA的两条链是反向平行的，通常将________________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的_____开始延伸DNA链。

（2）PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。

到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离得到______________

___________________________，它的发现和应用解决了上述问题。

要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫______________。

（3）PCR的每次循环可以分为__________________三步。

假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有____个这样的DNA片段。

（4）请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。

（5）简述PCR技术的主要应用。

________________________________________________________________________。

答案　

（1）磷酸基团　3′端　

（2）耐高温的TaqDNA聚合酶　选择培养基　（3）变性、退火和延伸　32

（4）如图所示

（5）遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定（要求3项以上）

解析　

（1）DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3′羟基上，与DNA母链结合的引物就提供这个羟基。

（2）因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。

用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。

（3）DNA复制时两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25＝32个。

（4）新合成的DNA链带有引物，而最初的模板DNA的两条链不带有引物。

（5）PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。

高考模拟　提能训练

高考题组

1．（2011·广东卷，5）以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（　　）

A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂

B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少

C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测

D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢

答案　D

解析　生理盐水为猪体细胞的等渗溶液，所以在洗涤红细胞时，使用生理盐水可维持细胞的正常形态，A项正确；由于哺乳动物的成熟红细胞中缺少细胞核和各种细胞器，所以提纯时杂蛋白相对较少，B项正确；如果凝胶色谱柱装填得很成功，分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出，所以血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测，C项正确；当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，后洗脱出来，D项错误。

2．（2011·海南卷，30）许多植物含有天然香料，如薄荷叶中含有薄荷油。

现用薄荷叶提取薄荷油。

回答问题：

（1）薄荷油是挥发性物质，提取薄荷油时应选用______（鲜、干）薄荷叶作原料，其原因是

________________________________________________________________________。

（2）用萃取法提取薄荷油时，采用的溶剂是____________，原理是__________________

______________________________________。

（3）用水蒸气蒸馏法提取薄荷油时，在油水混合物中加入氯化钠的作用是_____________

_________________________________________________________。

常用于分离油层和水层的器皿是__________。

分离出的油层中加入无水硫酸钠的作用是__________________，除去固体硫酸钠的常用方法是__________。

答案　

（1）鲜　鲜叶比干叶的薄荷油含量高

（2）有机溶剂　薄荷油易溶于有机溶剂，而不溶于水

（3）增加水层的密度，有利于油层和水层的分离　分液漏斗　除去少量的水　过滤

解析　

（1）薄荷油挥发性强，薄荷叶在干燥过程中，薄荷油因挥发含量降低。

（2）因薄荷油易溶于石油醚、酒精等有机溶剂，故用萃取法提取薄荷油时，采用的溶剂为有机溶剂。

（3）向通过水蒸气蒸馏得到的油水混合物中加入NaCl后，增加水的密度，就会出现油水分层现象。

常用分液漏斗将水、油分离。

向分离出的油层中加无水Na2SO4的作用是除去少量的水，用过滤的方法除去薄荷油中的Na2SO4。

3．（2013·山东卷，34）胡萝卜素是一种常用的食用色素，可分别从胡萝卜或产胡萝卜素的微生物菌体中提取获得，流程如下：

（1）筛选产胡萝卜素的酵母菌R时，可选用____________________或平板划线法接种。

采用平板划线法接种时需先灼烧接种环，其目的是________________________________。

（2）培养酵母菌R时，培养基中的蔗糖和硝酸盐可分别为酵母菌R的生长提供__________和______________。

（3）从胡萝卜中提取胡萝卜素时，干燥过程应控制好温度和________________以防止胡萝

卜素的分解；萃取过程中宜采用_______________方式加热以防止温度过高；萃取液浓

缩前需进行过滤，其目的是________________________________________________。

（4）纸层析法可用于鉴定所提取的胡萝卜素。

鉴定过程中需用胡萝卜素标准品作为____

__________。

答案　

（1）涂抹平板法　杀灭接种环上的微生物

（2）碳源　氮源　（3）干燥时间　水浴加热　滤去萃取后的不溶物　（4）（实验）对照

解析　

（1）接种微生物的方法主要是涂抹平板法和平板划线法，接种过程为了避免其他杂菌的污染，要做无菌操作，所以接种前需对接种环进行灭菌。

（2）蔗糖主要提供碳源，当然也可以作为能源物质，硝酸盐含氮元素，可提供氮源。

（3）温度过高、干燥时间过长会导致胡萝卜素分解；由于萃取剂往往有挥发性，直接加热时挥发出来的有机溶剂遇明火易爆炸；萃取后需将原料中不溶于萃取剂的成分滤去。

（4）提取出来的胡萝卜素往往不是纯的，用胡萝卜素标准品主要起一个对照的作用。

模拟题组

4．血清蛋白电泳时通常用pH为8.6的缓冲液，此时各种蛋白质带有的电荷为（　　）

A．清蛋白带正电荷，其他球蛋白带负电荷

B．清蛋白带负电荷，其他球蛋白带正电荷

C．清蛋白与其他球蛋白均带负电荷

D．清蛋白与其他球蛋白均带正电荷

答案　C

解析　pH为8.6的缓冲液既能维持血清蛋白的生物活性，又能使血清中各种蛋白质带同一种电荷—负电荷，这样在负极端点样，它们都向正极移动，根据移动速度不同达到分离目的。

5．在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。

据图回答相关问题：

a链5′－G－G……T－C－3′　　5′－G－G－OH（引物Ⅰ）

b链3′－C－C……A－G－5′　　________（引物Ⅱ）

　　　　　　94℃↓

5′－G－G……T－C－3′　3′－C－C……A－G－5′

　　　　　40～60℃↓

　　　　　　　　　　　5′－G－G－OH

5′－G－G……T－C－3′　3′－C－C……A－G－5′

　　　　　　72℃↓

1在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。

2在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。

3若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是　　　　　　　；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为　　　　。

4PCR反应过程的前提条件是　　　　　　，PCR技术利用DNA的　　　

　　　　　原理解决了这个问题。

5在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是　　　　　。

答案　15′—G—A—OH

　HO—A—G—5′

5′—G—G……T—C—3′

23′—C—C……A—G—5′　5′—G—G……T—C—3′

5′—G—G……T—C—3′　3′—C—C……A—G—5′

3每个DNA分子各有一条链含32P标记　1/2n

4DNA解旋　热变性　5蛋白酶

解析　1DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，所以引物就提供了3′端，子链延伸方向5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′—G—A—OH，复性结果为：

HO—A—G—5′

5′—G—G……T—C—3′

2经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。

3由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n×2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/2n·2＝1/2n。

4DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。

因此，首先要解旋，使两条母链碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对的原则把相应的核苷酸一个个地连接起来。

DNA分子在80～100℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，双能重新结合形成双链。

5本题考查了DNA中杂质蛋白质的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。

1．有关透析的叙述中，错误的是（　　）

A．用于透析的薄膜要具有选择透过性

B．透析膜一般是由硝酸纤维素制成的

C．透析能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内

D．透析可用于更换样品的缓冲液

答案　A

解析　透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的，它没有生物活性，故不具有选择透过性（活的生物膜才具有选择透过性）。

透析袋能使小分子物质自由进出，而将大分子保留在袋内。

透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓

冲液。

2．多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

PCR过程一般经历30多次下述循环：

94℃条件下使模板DNA变性、解链→40～60℃条件下退火（引物与DNA模板链结合）→72℃条件下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。

下列有关PCR过程的叙述，不正确的是（　　）

A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现

B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的

C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、4种核糖核苷酸

D．PCR与细胞内DNA复制相比，其所需要酶的最适温度较高

答案　C

解析　PCR一般要经历30多次循环，每次循环可以分为变性、退火和延伸三步。

从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。

DNA变性94℃左右：

双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

退火（40～60℃）：

系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸（70～75℃）：

在TaqDNA聚合酶（在72℃左右活性最高）的作用下，以dNTP（三磷酸脱氧核糖核苷酸的缩写）为原料，从引物的5′端向3′端延伸，合成与模板链互补的DNA链。

3．如图是用已除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确的是（　　）

A．首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较大的杂质

B．图乙装置的试管收集到的液体中最先得到的是相对分子质量较大的蛋白质

C．用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出

液，每管收集5mL，连续收集

D．图丙装置可用于电泳法分离提纯血红蛋白的操作中

答案　A

解析　用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质，图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程，蛋白质的相对分子质量较大被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。

4．下列是与芳香油提取相关的问题，请回答：

（1）玫瑰精油适合用水蒸气蒸馏法提取，其理由是玫瑰精油具有__________________

___________________________的性质。

蒸馏时收集的蒸馏液________（是、不是）纯的玫瑰精油，__________________________________。

（2）当蒸馏瓶中的水和原料量一定时，蒸馏过程中，影响精油提取量的主要因素有蒸馏时间和________。

当原料量等其他条件一定时，提取量随蒸馏时间的变化趋势是__________

________________________________________________________________________。

（3）如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会________，原因是________________

____________________________________。

（4）密封不严的瓶装玫瑰精油保存时最好存放在温度________的地方，目的是_________

_________________。

（5）某植物花中精油的相对含量随