心脏与肝脏发育和再生的遗传调控研究Word文档下载推荐.doc
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1.6）利用手术切除技术鉴定出发育突变体在杂合子情况下心脏或肝脏再生也发生异常的突变体。
1.7）通过交配将casper突变基因（白化突变体）分别转入所获得的再生突变体品系以便可视化研究再生过程。
2）克隆心脏或肝脏发育和再生的关键调控因子、研究关键因子的遗传调控机制
2.1）利用分子标记探针对所获得的突变体进行分析，鉴定出性状明显且稳定遗传的突变体。
2.2）分别选择3-5个心脏或肝脏发育和再生异常的突变体，采用图位克隆方法克隆对应的突变基因。
2.3）通过构建双突变体研究不同关键基因调控心脏与肝脏发育和再生的相互关系。
2.4）建立rtTA/TRE系统，构建分别由热激启动子70（HSP70），liverfattyacidbindingprotein（lfabp）启动子（肝脏专一表达）或cardiacmyosinlightchain2（cmlc2）启动子（心脏专一表达）启动表达的不同关键基因的转基因鱼。
2.5）用上述技术在一个突变体的心脏或肝脏中表达另一个关键基因，以研究转基因表达的关键基因能否拯救（rescue）该突变体的再生能力。
2.6）通过多种手段研究克隆到的关键基因调控心脏与肝脏发育和再生的分子机理研究。
2.7）研究新获得的关键基因与已知的关键基因调控心脏与肝脏发育和再生的关系。
2.8）探讨上述斑马鱼心脏再生关键因子是否也能诱导小鼠心脏的再生。
3）建立新的突变体筛选体系，鉴定调控心脏、肝脏发育和再生相关的因子
3.1）温度敏感型发育与再生缺陷突变体的筛选：
高温（33-35oC）培养ENU处理群体的子三代，运用荧光显微镜活体观察正常温度条件下发育无异常，但在高温培养条件下心脏或肝脏发育异常的突变体；
在成体阶段手术部分切除突变体的心脏或肝脏，高温处理后筛选再生缺陷突变体。
3.2）发育与再生负调控因子的筛选：
构建诱导型启动子系统，建立转基因斑马鱼；
当诱导型启动子插入到负调控因子基因ATG上游时，可诱导发育与再生负调控因子的表达；
通过观察心脏或肝脏早期发育异常，筛选负调控因子表达异常的转基因斑鱼品系；
在成体阶段手术部分切除突变体的心脏或肝脏，在诱导条件下筛选再生缺陷突变体。
4）在中科院水生所建立制度化管理的“国家斑马鱼资源中心”
4.1）制定并执行“国家斑马鱼资源中心管理制度”。
4.2）制定并执行“国家斑马鱼资源中心服务纲要”。
4.3）制定并执行“中心”各类服务指南。
二、预期目标
在我们既有的工作基础上建立斑马鱼心脏与肝脏发育与再生的可视化研究体系，突破再生遗传调控研究的瓶颈。
利用这个体系通过各种手段鉴定出调控斑马鱼心脏和肝脏发育与再生的关键因子，从而揭示心脏和肝脏发育的遗传调控机制。
同时，针对为何斑马鱼心脏手术后可再生而小鼠的不能，而斑马鱼和小鼠的肝脏手术后均能再生这个生物学现象，找出在心脏和肝脏再生过程中分别起作用或在两类器官再生时均起作用的关键因子，同时比较它们在心脏和肝脏再生过程中调控机制的异同，其最终目的是探讨哺乳动物心脏再生的可能性及肝脏再生的分子调控机制。
本项目旨在心脏与肝脏发育和再生生物学研究领域取得原创性的突破，取得一批重要的、具有自主知识产权的研究成果，为将来应用再生医学手段治疗人类重大疾病提供理论基础。
通过本项目的实施，使我国的再生生物学领域研究达到或领先国际水平。
同时以本项目为纽带，促进多学科的紧密衔接和多院校的学术交流，培养一批具有国际一流水平的从事发育生物学和再生生物学研究的人才。
同时，我们将建立严格制度化管理的“国家斑马鱼资源中心”，使其成为集品系资源、基因资源及信息资源为一体的服务和交流平台，以服务于中国研究学者为主要宗旨，为大力促进我国斑马鱼研究的长期发展奠定基础。
1）选定可视化观察活体心脏或肝脏发育与再生过程的转基因报告鱼，在这些报告鱼的基础上通过ENU处理建立突变体库，筛选获得15-20个心脏或肝脏发育异常的突变体。
2）成功建立并熟练掌握斑马鱼心脏和肝脏手术部分切除后再生的技术，利用该技术鉴定出心脏或肝脏再生异常的突变体，克隆突变基因，鉴定3-5个调控心脏或肝脏发育与再生的关键基因。
3）鉴定同时参与心脏和肝脏再生的关键因子，揭示它们调控心脏和肝脏再生分子机制的异同。
4）揭示新获得的及已知的关键因子调控心脏与肝脏发育和再生的分子机制,并确定其中一些关键因子之间的相互作用关系。
5）验证上述关键因子在小鼠心脏再生过程中的作用。
6）成功建立筛选心脏或肝脏发育和再生相关的温敏突变体和负调控因子突变体的技术体系。
7）在国际主流杂志（IF>
3）上发表论文50篇左右，并争取在国际顶尖杂志上发表数篇论文，申请发明专利5项以上；
在发育生物学和再生生物学领域造就一支高水平的科研队伍，培养一批博士研究生（40-50人）和博士后研究人员（>
10人）。
8）建立制度化管理的“国家斑马鱼资源中心”，全心全意为斑马鱼研究群体服务。
收集、整理、鉴定和保存斑马鱼品系资源约500个、基因资源约30,000个（包括EST）及抗体资源等。
在签订相关协议的基础上，负责国际上斑马鱼种质资源的安全引进、整理、鉴定和保存。
负责“国家斑马鱼资源中心”数据库和网站的建设和维护。
建立国家斑马鱼养殖和遗传标准，特别重视建立斑马鱼养殖质量控制制度和疾病监测与控制平台。
在保护生物安全和尊重知识产权的前提下，向我国各科研机构、大专院校和科普基地等提供可利用的斑马鱼资源材料及相关信息。
负责向国内研究者提供斑马鱼研究相关的技术培训和技术服务。
三、研究方案
1、学术思想
众所周知，尽管心脏和肝脏再生研究一直是一个研究热点，可是由于受所用动物模式的限制，加之多数已知关键基因隐性纯合突变会导致胚胎期个体死亡，而再生研究往往是在成体中进行的，因此，至今国际上尚未建立采用突变体筛选途径来研究心脏和肝脏再生的系统研究计划，结果使得这方面研究的进展十分缓慢。
这方面知识的缺乏严重阻碍了再生医学手段在心脏或肝脏疾病治疗上的应用。
鉴于斑马鱼在发育和再生生物学研究方面的独特优势，本项目以斑马鱼为模式材料首先建立可视化活体筛选心脏或肝脏发育和再生常温突变体和温敏突变体的技术体系，然后通过图位克隆方法克隆突变基因并由此鉴定出新的调控心脏或肝脏发育和再生的关键因子。
接着通过遗传学、分子生物学、细胞生物学等多种方法揭示这些关键基因调控心脏与肝脏发育和再生的作用机制，进而揭示导致心脏和肝脏再生能力差异的分子机制，通过这些工作以期在心脏与肝脏再生生物学领域取得原创性的重大突破和开创性成果。
此外，建立制度化管理的“国家斑马鱼资源中心”将在战略上为我国斑马鱼研究的长期发展打下基础。
2、技术路线
3、创新点与特色1）建立可视化活体筛选心脏与肝脏再生突变体的技术体系，鉴定调控心脏和肝脏发育和再生的新的关键因子。
利用可显示心脏或肝脏的转基因报告鱼，将发育突变体筛选与再生技术结合，获得一批心脏或肝脏发育和再生缺陷的斑马鱼常温和温敏突变体，鉴定调控心脏和肝脏发育与再生的关键因子。
目前国际上尚无类似的再生突变体筛选工作的报道。
在此基础上，利用发育与再生研究的成熟方法，研究这些基因调控心脏与肝脏发育和再生的分子机制、揭示导致心脏和肝脏再生能力差异的根本原因。
因此，本项目所开展的研究有望取得重要的、具有自主知识产权的研究成果。
为加速斑马鱼研究成果的应用，我们将建立研究小鼠心脏再生的技术体系，这样的研究计划一方面有利于结合斑马鱼和小鼠的技术优势，有利于创新思维形成优势互补，另一方面能促使尽快地将斑马鱼研究的结果用于探索小鼠心脏再生的研究。
2）利用斑马鱼为模式动物，集中力量系统、全面地研究心脏和肝脏再生的遗传调控，将使我国在心脏与肝脏再生研究领域加速进入国际先进行列。
由于斑马鱼多数器官能再生，因此是研究器官再生的理想模式动物。
本研究团队的几个主要实验室长期从事斑马鱼心脏与肝脏的发育研究，在研究心脏和肝脏发育领域有丰富的经验，发表过高水平论文，在国际上具一定的地位。
加之研究团队已熟练掌握ENU及SB转座子介导的高效基因诱变方法，拥有用于转基因鱼构建的不同的启动子系统，且各实验室已熟练掌握斑马鱼转基因技术，因此是一个研究基础雄厚的高水平团队。
目前在国际上组织这样的团队集中力量来研究和比较心脏与肝脏再生也属罕见，因此本项目的成功实施将能使我国在再生生物学领域的研究跻身于国际先进行列。
3）建立新的发育和再生研究方法，获得新的心脏和肝脏可视化品系。
利用新的负调控因子筛选策略，鉴定调控心脏和肝脏发育与再生的关键因子；
利用增强子捕获技术，获得心脏、肝脏细胞特异表达荧光蛋白的品系，发现肝脏、心脏特异性表达的启动调控因子。
4）建立制度化管理的“国家斑马鱼资源中心”将为我国斑马鱼研究的长期发展打下基础。
“国家斑马鱼资源中心”实行理事会与水生所所长协作领导下的执行主任负责制；
“资源中心”平台在理事会的指导和监督下行使应尽的责任。
理事会行使经费预算审定、经费使用监督、服务记录审查等功能。
这样的管理方式有利于“资源中心”的长期健康发展。
理事会成员将由国内斑马鱼研究领域的资深科学家组成。
本项目将建成国家级的多学科和多研究机构共享的斑马鱼养殖平台和资源中心，并以资源共享为基础，达到促进合作交流，节约劳动成本、提高资源利用效率、提升学术交流氛围、促进科研效率的目的。
4、取得重大突破的可行性分析
1）优秀的研究队伍
本团队包括“国家千人计划”专家一名、“国家杰出青年基金”获得者一名、教育部长江特聘教授一名、中科院“百人计划”一名。
本项目首席科学家、课题负责人及学术骨干都已在分子遗传学和发育生物学研究领域工作多年，所领导或所工作的实验室在斑马鱼遗传突变群体的创建、心脏及肝脏发育遗传调控的研究方面有着雄厚的基础，在研究和管理方面积累了丰富的经验；
已在包括Nature，Science，GenesandDevelopment，Development等国际著名学术刊物上发表了数十篇与分子遗传学和发育生物学领域相关的论文，获得了国际公认的优秀成就，建立了良好的国际声誉，并与国内外著名大学的知名专家建立了良好的合作关系。
各课题组的研究方法相互交叉，可以相互借签，研究内容各有侧重，通过紧密合作、优势互补，势必大力促进心脏与肝脏发育和再生的遗传调控机制的研究。
2）实验设计合理
针对拟解决的关键问题，利用斑马鱼为模式动物，在现有的研究基础上，我们设计了独特和合理的研究课题、可操作的技术路线、可行的研究手段及可达到的研究目标，为系统全面地在分子水平上阐明心脏与肝脏发育和再生的机制制订了蓝图。
3）有良好的工作基础
通过筛选获得心脏和肝脏发育异常的突变体及成功克隆突变基因，我们前期的研究已经证明Scotchtape、Notch等在心脏发育中的关键作用，Mypt1介导的Bmp2信号通道、Def-p53-Δ113p53通道等在斑马鱼肝脏肝脏发育过程中起着重要作用。
我们近期的研究显示ROS/Duox和Notch在心脏再生、Def和p53在肝脏再生过程中起作用。
这些为本项目的成功实施打下了坚实的基础。
5、课题设置
课题1：
心脏发育和再生关键基因的鉴定及遗传调控研究
预期目标：
通过ENU诱变Tg（cmlc2:
kaede）转基因鱼和遗传突变体筛选，预期获得20-25个心脏发育突变体，从中鉴定3-5个心脏再生突变体，并图位克隆和系统分析3-4个心脏发育与再生相关基因。
发现1-2种调控过氧化氢及Notch信号通路的与心脏再生相关的因子。
与课题二合作，有望鉴定1-2种调控心脏和肝脏发育与再生共同遗传因子。
鉴定1-2种改善哺乳动物终末分化的心肌细胞再生的分子，为哺乳类动物心脏损伤后再生的诱导提供新的思路和方法。
本课题预期培养15名博士生和2-3名博士后科学家，发表IF>
3SCI论文15篇，其中包括1-2篇国际顶尖杂志论文，有重要应用前景国际专利1-2项。
主要研究内容：
本课题利用斑马鱼作为脊椎动物遗传模式动物的优势来寻找心脏发育和再生的关键基因。
我们已建立可视化心脏特异表达荧光蛋白转基因Tg（cmlc2:
kaede）斑马鱼，计划用于ENU诱导的心脏发育和再生突变体筛选。
另一方面将利用RNA原位杂交筛选参与心肌再生的候选基因。
最后我们打算在小鼠的心脏验证斑马鱼心脏再生的信号途径，探索哺乳动物心脏再生的可能性。
研究内容包括：
（1）分离心脏发育异常的斑马鱼突变体。
利用可视化心脏特异转基因斑马鱼Tg（cmlc2:
kaede）来筛选ENU心脏发育突变体，这类突变体属隐性突变体，纯合子一般不能发育到成体，但杂合子一般无明显表型。
（2）斑马鱼突变体表型分类。
将利用心肌标记基因（cmlc2,nkx2.5,tbx5,gata4等）、心内皮标记基因（fli1,flk1,tie1,ve-cadherin等、及心外皮标记基因（wt1,epicardin等）分析其在突变体中的时空表达图谱，从而将心脏突变体分为心脏前体细胞突变体、心脏腔室突变体、心脏瓣膜突变体等。
（3）鉴定心脏再生的斑马鱼突变体。
文献报道ENU诱导的Tbx5和Brg1心脏突变体杂合子能活到成体，但成鱼心脏有功能异常表型。
我们也发现在成鱼心脏再生的过程中，它们会在一定时间、在特定部位激活（未发表数据）。
所以我们预计ENU诱导的心脏发育突变体的杂合子有助于发现心脏再生的突变体，即杂合子突变体会影响损伤诱导的心肌再生。
我们计划从20个左右心脏发育突变体中鉴定心脏再生突变体。
（4）利用图位克隆技术分离和系统分析3-4个心脏发育和再生相关基因。
（5）利用心脏和肝脏发育及再生突变体资源，比较研究这两种重大器官发育及再生分子遗传机制的异同。
（6）获得过氧化氢荧光蛋白探针（Hyper）可视化心肌细胞特异表达的转基因斑马鱼。
运用激光共聚焦显微镜研究斑马鱼心脏手术损伤前后的活性氧信号，通过高分辨率的图像分析了解信号的动态变化过程；
通过原位杂交的方法，构建nox2和duox在心脏损伤再生过程中激活表达图谱。
将研究过氧化氢信号在心脏再生中的功能，利用Nox抑制剂DPI特异性阻断过氧化氢信号，进而分析过氧化氢信号在斑马鱼心肌再生、心肌细胞分裂、心脏纤维化等过程中的作用。
同时将建立可阻断过氧化氢信号的转基因鱼Tg（hsp70:
catalase-dsRed），从而进一步验证DPI阻断斑马鱼心肌再生的作用。
将转基因Tg（cmlc2:
hyper）斑马鱼交配到再生突变体，分析再生突变体与过氧化氢信号通路的关系。
（7）获得Notch信号报告系统（含有12×
RBPJ结合位点的转基因斑马鱼Tg（Tp1bglob:
hmgb1-mCherryjh11）。
无论哪种Notch受体激活，均可以激活该报告系统中mCherry的表达。
利用Tg[hsp70:
dn-MAML1eGFP]和Tg[hsp70:
dn-RBPJeGFP]，或Tg[hsp70:
NICDeGFP]转基因斑马鱼EGFP标记并改变Notch信号通路活性,从而研究再生过程中Notch信号通路与Mef2c+/BrdU+和Mef2c+/Cdc42+细胞形成的关系。
将新分离的ENU心脏再生突变体与可视化的Notch报告转基因鱼Tg（Tp1bglob:
hmgb1-mCherryjh11）交配,从而系统分析再生突变体与Notch信号通路在心脏再生中的机制。
（8）研究斑马鱼再生信号通路在小鼠心肌梗塞模型及一天新生鼠心脏再生模型中表达和功能。
最近有报道出生一天新生鼠心脏部分切除后可以完全再生，而成年鼠心脏再生潜能有限。
将比较研究从ENU突变体发现的心脏再生基因、Duox、Notch1b/Dll4等再生基因在新生鼠心脏再生过程中及小鼠心肌梗塞心脏的动态变化，从而比较它们在新生鼠、成年鼠及斑马鱼心脏再生机制的异同。
预期斑马鱼或新生鼠心脏再生基因可能在成年小鼠心肌梗塞心脏没有时空激活，我们将制备心脏特异性条件性表达Duox和Notch等转基因鼠，并利用转基因鼠制备心肌梗塞模型，同时用野生型小鼠作对照，以观察心脏修复时组织学和功能的差异。
如果心肌特异性Duox及Notch等信号通路参与心肌细胞再生过程，那么心脏特异性Duox或Notch的高表达能够改善小鼠心肌梗塞时受损局域的修复（如增加心肌细胞的再生，而不仅仅是纤维细胞的充填，从而改善心功能）。
由此，我们将利用上述转基因鼠进一步探讨小鼠心脏Duox及Notch等信号通路分子表达调控的机制。
经费比例：
20%
承担单位：
北京大学、复旦大学、浙江大学
课题负责人：
曹春梅
学术骨干：
熊敬维、钟涛、罗丽健、甄一松
课题2：
肝脏发育和再生关键基因的鉴定及遗传调控研究
预期从ENU诱变的Tg（lfabp:
RFP）转基因鱼突变群体里可筛选到20-30个肝脏发育突变体，并有可能从这些发育突变体中获得5-7个肝脏再生突变体。
利用图位克隆法我们将克隆3-4个肝脏发育与再生突变基因。
通过构建双突变体或在一个突变体中诱导表达另外一个基因揭示这些因子之间的相互作用关系。
此外，通过在再生突变体遗传背景中引入Bmp，Fgf启动子报告系统，以及上调或下调Bmp和Fgf信号表达系统，将能确定新鉴定的再生因子与这些信号因子之间的关系。
而在再生突变体遗传背景中诱导表达Prox1或Hhex将揭示新的及已知的关键因子在调控肝脏发育与再生时的互作关系。
与课题一合作，找到在心脏和肝脏再生时分别起作用的因子或找到1-2种同时调控心脏和肝脏发育与再生的遗传因子，初步揭示哺乳类动物心脏和肝脏再生能力差异的分子机制。
本课题预期培养20名博士生和4-5名博士后科学家，发表IF>
3SCI论文18篇，包括1-2篇国际顶尖杂志论文，有重要应用前景国际专利1-2项。
肝脏发育和再生是一个由多因子参与的精密调控过程。
本课题拟通过诱变Tg（fabp10:
RFP;
elastase:
GFP）报告鱼进行可视化筛选肝脏发育和再生突变体，以期获得2-3个调控肝脏发育和再生的新的关键因子。
此外，已有的证据表明，信号因子FGF、Bmp2和Wnt，蛋白因子Def和p53等在斑马鱼肝脏发育过程中起关键作用。
实验证据还显示，这些因子在肝脏再生过程中也可能起关键作用。
但目前对于这些因子的作用机制所知甚少。
我们将结合多种不同实验手段及构建不同类型的转基因斑马鱼模型来阐明这些已知的及新的关键因子之间的作用机制及相互作用关系。
（1）用化学诱变剂ENU诱变Tg（fabp10:
elastase:
GFP）雄鱼，获得诱变群体；
在Tg（fabp10:
GFP）转基因报告鱼中引进转座子SB系统，建立SB插入突变群体，并利用温度诱导SB系统再迁移，提高获得突变体的效率。
（2）在上述诱变群体子三代中通过荧光显微镜观察RFP红色荧光筛选肝脏发育异常的突变体鱼；
将获得的突变体与野生型AB回交以鉴定可遗传的突变体，同时回交也将纯化突变体的遗传背景。
（3）用不同分子标记探针进行原位杂交以确定变异性状出现的时间点，包括表达在早期内胚层细胞的基因foxa3及gata6、表达在早期肝前体细胞（hepatoblast）的基因prox1和hhex、表达在肝细胞中的基因lfabp等。
同时，我们也将用表达在肠道的基因ifabp、表达在外分泌胰腺的基因trypsin及表达在内分泌胰腺的基因insulin为探针在获得的突变体中进行原位杂交。
（4）根据分子标记探针表达的变化遴选出遗传性状明显且分离比为单基因控制的肝脏发育突变体15-20个。
获得这些突变体的杂合体成鱼，通过手术切除1/3腹侧肝叶，观察肝脏再生情况，鉴定出再生异常的突变体。
（5）将获得的肝脏发育和再生突变体[以Tg（fabp10:
GFP）为遗传背景]与casper鱼交配，在子代筛选含casper性状的再生突变体鱼。
所获得的杂交鱼可用于活体研究肝脏再生过程。
（6）突变基因克隆：
首先我们会利用已建立的220SSLP（simplesequencelengthpolymorphism）分子标记将候选突变基因定位在斑马鱼连锁群（染色体）,然后通过图位方法克隆突变基因。
（7）通过遗传交配构建双突变体以研究关键因子在调控肝脏发育和再生过程中的相互作用关系。
通过在一个突变体中表达另一个关键因子以研究两个关键因子之间作用的上下游关系。
（8）研究所获得的肝脏再生突变体是否也影响心脏再生，以期找到影响两类器官再生的共同调控因子。
（9）将突变体鱼分别与上调或下调表达Bmp、Wnt和Fgf的转基因鱼进行交配，以研究新获得的关键因子与这些信号通路的关系。
（10）分别克隆斑马鱼bmp2a、bmp2b及wnt2bb的启动子，并与荧光基因融合构建转基因鱼。
所获转基因鱼将用于研究肝脏手术部分切除再生时Bmp2a、Bmp2b及Wnt2bb表达激活情况以确定何类信号因子参与了再生过程。
同时这些转基因报告鱼加上可上调或下调表达Bmp或Wnt的转基因鱼将为研究Bmp2和Wnt控制内胚层细胞特化成肝细胞的分子机制打下基础。
（11）肝脏发育和再生依赖于细胞快速增殖，因此在再生过程中，机体需要控制那些抑制细胞周期或促进细胞死亡因子（如p53）的表达。
基于def突变体中肝脏异常发育是由于细胞周期受抑制而不是细胞凋亡的增加导致的，我们将通过生化及分子生物学手段来研究机体是如何通过Def来抑制p53的激活来决定细胞的命运，研究Def和p53在肝脏再生过程中是否起关键的作用。
（12）转录因子Prox1和Hhex在肝脏早期发育中其关键作用。
我们将构建在斑马鱼成鱼肝脏中可诱导表达Prox1或Hhex的转基因鱼用以研究它们在肝脏再生中的作用。
同时，这些转基因鱼将与上述获得的突变体鱼交配以研究Prox1或Hhex与
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