转基因大豆检测实验设计.docx

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转基因大豆检测实验设计

转基因大豆的检测

实验设计

生物技术安全评估09

2012年5月

前言………………………………………………………………3.

实验一大豆样品的准备………………………………………4

实验二大豆DNA的提取和纯化………………………………4

实验三靶标基因的扩增………………………………………6

实验四反应产品检测…………………………………………10

实验五结果分析………………………………………………12

参考文献…………………………………………………………12

前言

随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（GeneticallyModifiedOrganism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。

抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundupreadysoybean）是在传统大豆株VarietyA5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。

它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。

因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。

基于核酸的检测技术主要有PCR方法和基于PCR原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR等

等。

普通PCR方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。

这些标准涉及的转基因作物有大豆（SN/T1195-2003）、玉米（SN/T1196-2003）、棉花（SN/T1199-2003）、油菜籽（SN/T1197-2003）、烟草（SN/T1200-2003）和马铃薯（SN/T1198-2003）。

目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。

随后在2004年又制定了转基因定性检测的国标（GB/T19495.4-2004），该国标中用的方法还是普通

PCR。

因此，普通PCR方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。

本实验以三种大豆为材料进行比较，通过对其DNA的提取和纯化，靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析，从而鉴定所检测大豆样品。

采用PCR检测转基因大豆的方法，主要是采用琼脂糖凝胶电泳法，首先检测CAMV-35S启动子进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘膦基因。

实验一大豆样品的准备

一样品来源：

（原始样品最小质量为：

11200克）

1、阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（IRMM-410R，Fluka公司）

2、进口转基因大豆样品

3、非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。

二样品加工过程：

1、构成原始样品（原始样品不得低于试验样品的4倍）

2、样品的初步处理（去皮、去壳、除水、除油等应记录初步处理前后样品的质量变化）

3、破碎和研磨

4、缩分

5、实验室样品的制备（实验室样品的最小质量不能小于原始样品最小质量的1/16）

6、存查样品和式样的制备

实验二大豆DNA的提取和纯化

（CTAB法）

一实验目的

掌握用CTAB法提取真核细胞总DNA的原理、步骤和注意事项。

二实验原理

1、CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中（>0.7mol/LNaCl）,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：

CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

2、CTAB提取缓冲液各成分的作用：

（1）Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏

（2）EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性

（3）NaCl提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中

（4）Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA

（5）主要作用物质就是氯仿，所以它占有的比例较大，而异戊醇的主要就是防止起泡泡。

三实验仪器和实验试剂

1.仪器：

水浴锅离心机EP管电泳仪研钵

2.试剂:

去离子水乙醇氯仿-异戊醇液氮

CTAB缓冲液：

CTAB20g/L，Tris-HCI0.1mol/L（pH8.0），EDTA0.02mol/L.

TE缓冲液：

lommol/LTris.，1mmol/I,EDTA，pH8.0）.

酶溶液：

5µg/µl.

材料：

阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（IRMM-410R，Fluka公司）、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。

四实验步骤（三种材料分别进行）

1、洗干净大豆叶片，用75%的酒精表面消毒3min,用去离子水冲洗3~4次

2.称取1g叶片放入灭过菌的研体中，加入液氮捣碎，迅速转入2ml离心管中。

3.加入600µlCTAB缓冲液，震荡均匀，65℃温育30min.

4.加入500ul酚：

三氯甲烷：

异戊醇（25:

24:

1），振荡均匀，12000r/min，离心15min。

5.吸取上清液，放入另一新管中，加入等体积的异丙醇，12000r/min，离心10min。

6.弃去上清液，加入70%乙醇溶液洗涤，12000r/min，离心1min。

7.弃去上清液，干燥，用50µlTE溶液溶解沉淀。

8.加入5µlRNA酶溶液，37℃温育30min。

9.加入400µl的CTAB溶液，振荡均匀。

10.加入250µl的三氯甲烷：

异戊醇，振荡均匀，12000r/min，离心15min。

11.吸取上清液，放入另一个新管中，加入200µl的异丙醇，12000r/min，离心10min。

12.弃去上清液，干燥，用50µlTE缓冲液溶解沉淀。

五实验结果

获取大豆的DNA。

六注意事项

1.研磨组织块用于DNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。

2.整个抽提过程，要尽量避免DNA酶的污染，全程配戴一次性手套，皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染DNA的抽提并成为DNA酶的来源。

培养良好的微生物实验操作习惯，预防微生物污染。

本实验亦可用试剂法。

（takara公司：

首页-产品分类目录 -DNAExtractionKitforGMODetection）

实验三靶标基因的扩增

一大豆内源基因lectin的检测

1、范围

本方法规定了大豆物种特异性单拷贝基因序列的常规检测程序。

本方法适用于评价从大豆加工产品中提取的DNA质量，并可判断是否有足量的DNA用于基因成分检测。

2、原理

通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为118bp的大豆Lectin基因片段。

3、检测下限

本方法能检测0.1ng的大豆DNA。

4、试剂

一般要求

按照GB/T19495.1—2004的要求执行。

水

10XPCR缓冲液（不含氯化镁）

氯化镁溶液：

25mmol/L.

dNTP溶液：

各2.5mmol/L.

引物：

A、正向引物

大豆Lectin基因（GeneBank®编号：

K00821）

5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3’

B、反向引物

大豆Lectin基因（GeneBank®编号：

K00821）

5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3’

Taq酶：

5IU/μL

5、仪器：

PCR仪、电泳仪

6、PCR扩增

PCR反应体系

本方法中中，PCR反应的总体积为25μL，反应体系见表A.1。

可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。

表（A?

）B.1PCR反应体系

试剂

终浓度

加样体积/μL

样品DNA

10ng~50ng

1

水

15.9

10xPCR缓冲液（不含氯化镁）

1x

2.5

氯化镁溶液（25mmol/L）

1.5mmol/L

1.5

dNTP溶液（10mmol/L）

0.8mmol/L

2

正向引物（5μmol/L）

0.2μmol/L

1

反向引物（5μmol/L）

0.2μmol/L

1

Taq酶（5IU/μL）

0.5IU

0.1

注：

如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5mmol/L.

PCR反应参数

PCR反应参数见表A.2。

使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整。

表B（A?

）.2PCR反应参数

预变性

10min，95°C

扩增

20s，95°C

40s，60°C

40s，72°C

循环数

40

最终延伸

3min，72°C

7、结果判断

如果PCR产物通过电泳确证，可表述样品DNA溶液中含有来源于大豆的可扩增的DNA。

二转基因大豆DNA（CaMV35S启动子）筛选检测方法

1、范围

本方法规定了CaMV35S启动子不同拷贝数的定性PCR检测方法。

本方法适用于转基因大豆CaMV35S启动子的筛选检测。

2、原理

通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为195bp的CaMV35S启动子基因片段。

3、检测下限

本方法未确定绝对检测下限。

相对检测下限可以检测含有0.1%（质量分数）转基因抗草甘磷大豆粉（IRMM-410）。

4、试剂

一般要求

按照GB/T19495.1—2004的要求执行。

水

10XPCR缓冲液（不含氯化镁）

氯化镁溶液：

25mmol/L.

dNTP溶液：

各2.5mmol/L.

引物：

A、正向引物

CaMV35S启动子（GeneBank®编号：

V00141）

5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’

B、反向引物

CaMV35S启动子（GeneBank®编号：

V00141）

5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’

Taq酶：

5IU/μL

限制性内切酶XmnI（=Asp700）

5、仪器：

PCR仪、电泳仪

6、PCR扩增

PCR反应体系

本方法中中，PCR反应的总体积为25μL，反应体系见表B.1。

可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。

表B.1PCR反应体系

试剂

终浓度

加样体积/μL

样品DNA

10ng~50ng

1

水

15.9

10xPCR缓冲液（不含氯化镁）

1x

2.5

氯化镁溶液（25mmol/L）

1.5mmol/L

1.5

dNTP溶液（10mmol/L）

0.8mmol/L

2

正向引物（5μmol/L）

0.2μmol/L

1

反向引物（5μmol/L）

0.2μmol/L

1

Taq酶（5IU/μL）

0.5IU

0.1

注：

如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5mmol/L.

PCR反应参数

PCR反应参数见表B.2。

使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整。

表B.2PCR反应参数

预变性

10min，95°C

扩增

20s，95°C

40s，54°C

40s，72°C

循环数

40

最终延伸

3min，72°C

7、结果判断

如果具备下列条件，就能确定检测到目标序列：

——PCR扩增产生195bp的DNA片段；

——经过序列分析，未知样品PCR扩增条带的DNA序列与阳性对照DNA序列一致；

——用限制性内切酶XmnI酶切PCR产物产生115bp和80bp两个片段；

三抗草甘膦除草剂基因的检测

1、范围

本方法规定了在原料中加工产品中检测转基因抗草甘膦除草剂（RoundupReadyTM）大豆的定性PCR方法。

本方法适用于对原料和加工产品中转基因成分检测，不适用与对基因堆积品种的转基因成分检测。

2、原理

通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为172bp的DNA片段，包括CaMV35S启动子和矮牵牛叶体运输肽部分序列。

3、检测下限

根据每个基因组中的结构基因是1个拷贝和每个基因组的大小为1.13X109bp的假设，PCR检测绝对下限为50ngDNA，相当于40个基因组。

4、试剂

一般要求

按照GB/T19495.1—2004的要求执行。

水

10XPCR缓冲液（不含氯化镁）

氯化镁溶液：

25mmol/L.

dNTP溶液：

各2.5mmol/L.

引物：

A、正向引物

CaMV35S启动子（GeneBank®编号：

V00141,J02048）

5’-TGATGTGATATCTCCACTGACG-3’

B、反向引物

矮牵牛叶绿体运输肽基因（GeneBank®编号：

M21084，J03227）

5’-TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT-3’

Taq酶：

5IU/μL

杂交探针

5’-GGGTCTTGCGAAGGATAGTG-3’

预杂交溶液

5xSSC，0.1%N-月桂酰肌氨酸（质量浓度），0.2%SDS（质量浓度），1%终止液。

杂交溶液

在2.5mL预杂交溶液中加入10pmol杂交探针。

杂交反应的温度为50摄氏度。

5、仪器：

PCR仪、电泳仪

6、PCR扩增

PCR反应体系

本方法中中，PCR反应的总体积为25μL，反应体系见表C.1。

可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。

表C.1PCR反应体系

试剂

终浓度

加样体积/μL

样品DNA

10ng~50ng

1

水

15.9

10xPCR缓冲液（不含氯化镁）

1x

2.5

氯化镁溶液（25mmol/L）

1.5mmol/L

1.5

dNTP溶液（10mmol/L）

0.8mmol/L

2

正向引物（5μmol/L）

0.2μmol/L

1

反向引物（5μmol/L）

0.2μmol/L

1

Taq酶（5IU/μL）

0.5IU

0.1

注：

如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5mmol/L.

PCR反应参数

PCR反应参数见表A.2。

使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整。

表C.2PCR反应参数

预变性

10min，95°C

扩增

20s，95°C

40s，60°C

40s，72°C

循环数

40

最终延伸

3min，72°C

7、结果判断

如果具备下列条件，就能确定检测到目标序列：

——PCR扩增产生172bp的DNA片段；

——杂交实验确证，DNA探针能够特异性杂交PCR产物；

——经过序列分析确证，未知样品PCR扩增条带的DNA序列与阳性序列一致；

根据以上反应条件分别进行以下操作：

1、对三种来源的大豆DNA，顺序为：

阳性转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记为：

1、2、3号和不加样品DNA的空白对照组标记为11号，进行CaMV35S启动子的PCR扩增；

2、对三种来源的大豆DNA，顺序为：

阳性转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记为：

4、5、6号和不加样品DNA的空白对照组标记为12号，进行抗草甘膦基因PCR扩增；

3、对三种来源的大豆DNA，顺序为：

阳性转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记为：

7、8、9号和不加样品DNA的空白对照组标记为13号，进行lectin基因PCR扩增。

准备好TaKaRaDNAMarker:

DL500.

本实验亦可用试剂法。

（Takara公司：

首页-产品分类目录 -PCRScreeningKitforGMSoybeanVer.2.0）

实验四反应产品检测

一实验目的

1、掌握琼脂糖电泳的基本技术。

2、了解琼脂糖凝胶电泳的原理。

二实验原理

琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。

因而就可依据DNA分子的大小使其分离。

该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。

溴化乙锭（EB）或EB替代物可与DNA分子形成EB-DNA复合物在紫外光照射下发射荧光，其荧光强度与DNA的含量成正比。

据此可粗略估计样品DNA浓度。

三、仪器与试剂

1、仪器：

电泳仪、微波炉

2、试剂：

凝胶回收试剂盒、TAEBuffer、电泳上样缓冲液、EB替代品

四实验步骤

1、取30mLTAE缓冲液加入三角瓶后，加0.3g琼脂糖，使琼脂糖含量为1%（质量体积比）

2、胶液的制备：

将上述混合物放入或电炉上加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。

加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。

待混合物冷却至50-60℃时，加入一定量的EB替代物

3、胶板的制备：

将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子。

然后将2中的混合物趁热倒入胶槽中，倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。

待胶完全凝固后拨出梳子（一般20min左右即可）。

然后将胶块轻轻取出，放到电泳槽中（注意摆放的方向，上样孔在负极端，因为DNA双螺旋的骨架是由磷酸残基和脱氧核糖组成，而磷酸带负电荷，使得DNA带负电），使TAE缓冲液浸没胶块

4、上样：

首先在第1和第11（14）泳道加入marker（即DL500）,然后根据实验三中三种不同的检测项目（即CaMV35S启动子、抗草甘膦基因、lectin基因的扩增）可分为三组，具体泳道标号为：

2、3、4；5、6、7；8、9、10.即每组三个泳道，泳道顺序统一为：

阳性转基因大豆样品、进口转基因大豆样品、非转基因大豆。

另分别在11、12、13泳道上样CaMV

35S启动子、抗草甘膦基因、Lectin基因检测组的空白对照。

所有样品（20μL）与5μL6×buffer混匀，小心加入样品槽中。

每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染。

注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿

5、跑电泳：

加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。

恒流，100mA，电泳至指示剂跑到胶的1/2处即可停止（一般大概需30min）

6、紫外灯下看电泳结果

五实验结果

观察紫外光下是否有电泳DNA条带的出现

六实验讨论

分析结果及其说明了什么

七注意事项

1、倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡，待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。

2、待胶完全凝固后拨出梳子，然后向槽内加入TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面时，因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

3、注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

4、煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶的1/3，否则易溢出。

实验五结果分析

把经过CTAB法提取纯化得到三种大豆细胞总DNA根据检测项目的不同可均分成三组，每组顺序统一为：

阳性转基因大豆样品、进口转基因大豆样品、非转基因大豆。

分别进行PCR扩增检测。

泳道1和泳道11（14）为加入的marker。

DL500DNAMarker为已含有1×LoadingBuffer的DNA溶液，可取5 μl直接电泳。

DL500DNAMarker由DNA片段500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp组成，共7条带。

每次取5 μl电泳时，每条带的DNA量约为50ng，其中200bp的DNA片段量约为150ng，显示亮带。

泳道2、3、4是三种大豆基于CaMV35S启动子（35S启动子大小为：

195bp）的检测，检测为阳性时，则结果应该是在marker200bp附近出现条带，由于泳道2和3（4?

）分别为转基因阳性大豆和普通非转基因大豆，因此泳道2在200bp附近出现条带而泳道4在相应位置不出现条带。

泳道3在200bp附近是否出现条带则直接证明进口转基因大豆样品是否含有CaMV35S启动子。

鉴于绝大部分转基因植物都含有CaMV35S启动子，若检测结果为阳性则说明检测的进口转基因大豆确为转基因，反之则为非转基因。

本组主要进行大豆样品的初步定性是否为转基因。

泳道5、6、7是三种大豆样品基于外源基因的检测，由于绝大部分转基因大豆都转入抗草甘膦基因，当待检测样品为阳性时，则在200bp和150bp之间（抗草甘膦基因大小为：

172bp）出现条带。

这一个项目的检测可以进一步确定该转基因大豆的品种。

由于泳道5是阳性转入抗草甘膦基因大豆，而泳道7为非转基因大豆，则泳道6相应位置是否出现条带可判断该进口转基因大豆是否为该品种转基因大豆。

泳道8、9、10是三种大豆样品基于大豆内源基因（lectin）的检测，当待基因检测为阳性时，则在100bp附近出现条带（lectin基因大小为：

118bp）。

检测此项目的原因是保证检测的三种样品为大豆品种，而非其他物种，这在进行转基因制品时尤其有用。

泳道11、12、13为空白对照组，理想情况下不出现条带。

条带的出现表明假阳性、假阴性，因实验操作过程不当出现污染，会影响实验结果的真实性、有效性。

参考文献：

[1]中华人民共和国国家标准GB/T19495.4-2004

[2]InternationalServicefortheAcquisitionofAgri-biotechApplications.GlobalGMcropareacontinuestogrowandexceeds50millionhectaresforfirsttimein2001[IP/TT].http:

//www.isaaa.org/press%20release/Global%20Area_Jan2002.htm

[3]BertoliniE,OlmosA,MartinezMC,etal.Single-stepmultiplexRT-PCRforsimultaneousandcolourimetricdetectionofsixRNAvirusesinolivetrees[J].JVirolMethods,2001,96

（1）:

33－41.

[4]贺艳,郑文杰,刘烜，赵卫东.转基因检测技术的研究进展[J].食品研究与开发,2009,30（3）：

170-172

[5]中华人民共和国国家标准：

大豆中转基因成分的定性PCR检测方法（SN/T1195-2003）