推荐下载关于灵芝代谢产物抗肿瘤作用的研究Word文件下载.docx
《推荐下载关于灵芝代谢产物抗肿瘤作用的研究Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《推荐下载关于灵芝代谢产物抗肿瘤作用的研究Word文件下载.docx（26页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
所以作为灵芝能获胜的法宝之一可能就是其代谢产物，而真菌代谢产物的开发早已被
证明是非常有价值的，比如历史上青霉素的发现就是例证，在这方面我国的发展步伐
却比较慢，灵芝代谢产物药理作用的开发也将丰富我国中药的用途。
对于灵芝代谢产
物的研究目前并不多而且主要集中在其中灵芝多糖的测定上[1]。
但灵芝的代谢产物是
否能够对肿瘤细胞有所作用?
为解决这个问题，我们进行了如下实验。
1材料与仪器
1.1试剂环磷酰胺（CTX）注射液由上海华联制药有限公司生产（生产批号为071002）。
TNF-ELISA试剂盒购于渤海生物公司。
肝功能检测试剂盒购于上海荣盛公司。
1.2含灵芝的代谢产物培养基取生长于斜面固体培养基上的灵芝菌泥（约1cm2）接种
于100ml液体培养基（含2%黄豆粉，2%蔗糖，0.075%的磷酸二氢钾，0.03%的硫酸
镁），25℃100r/min条件下培养5d，用滤纸过滤后得到含灵芝的代谢产物培养基。
将这
2
些培养基在-20℃条件下保存待用。
1.3抗血清制备使用李丽华等[2,3]报道的琥珀酸酐法将含灵芝的代谢产物培养基中所
有成分的羟基与小牛血清白蛋白（BSA）连接。
使用连接后的化合物免疫昆明小鼠，制备
抗血清。
经琼脂双向扩散法测定该抗血清的效价是1∶16。
1.4肿瘤细胞株S180购自河北医科大学动物中心。
1.5动物昆明小鼠（由河北医科大学动物中心提供）146只，体质量为18～22g，雌雄
各半。
1.6仪器微量加样器（SOCOREX,瑞士）;
电热恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公
司），离心机（国产）,Humalyzer2000型全自动生化仪，德国豪迈公司生产等。
2方法
2.1建立肿瘤模型选择6只昆明小鼠腹腔接种S180，接种5d后的小鼠，消毒腹部
皮肤，用无菌空针抽吸腹水放入无菌容器内，置冰块保存。
用0.4%台盼蓝染色后计数,
在倒置式显微镜下计数，计算存活率，,用Hank’s液稀释细胞悬液使活细胞数达到1
3
109个ml-1，随机选取120小鼠，每只小鼠左前腋皮下注射0.2ml（活细胞数达到1
109个ml-1）细胞悬液，另外20只小鼠不做任何处理作为正常组。
2.2动物分组将120只已经注射了S180的小鼠随机分为6组，每组动物各20只，
分为阴性对照组、腹腔注射含灵芝代谢产物培养基组（注射产物组）、环磷酰胺（CTX）
组、腹腔注射含灵芝代谢产物培养基加抗血清组（注射产物加血清组）、口服含灵芝代谢
产物培养基组（口服产物组）和抗血清组。
阴性对照组和正常组胃饲生理盐水0.2ml/（kg
d）;
环磷酰胺组腹腔注射环磷酰氨0.075g/（kgd）;
腹腔注射含灵芝代谢产物培养基组给予
腹腔注射灵芝代谢产物2ml/（kgd），抗血清组给予腹腔注射抗血清2ml/（kgd），腹腔注
射含灵芝代谢产物培养基加抗血清组给予腹腔注射灵芝代谢产物2ml/（kgd）同时腹腔注
射抗血清2ml/（kgd），口服含灵芝代谢产物培养基组给予口服含灵芝代谢产物培养基
2ml/（kgd）。
2.3动物处理以上各组在接瘤24h后开始给药,连续给药7d后，处死动物，取出肿
瘤和肝脏，用电子天平称出肿瘤质量。
同时取血放入肝素抗凝素管内分离血清备用。
2.4ELISA法测定各组血清TNF-水平应用TNF-ELISA试剂盒（购于渤海生物公司）
按说明书测定保存血清中的TNF-水平。
2.5使用全自动生化分析仪测定测量血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）。
4
2.6统计学方法均采用SPSS10.0软件，进行t检验。
3结果
3.1各组肿瘤质量如表1所示，阴性对照组与抗血清组肿瘤质量无差异（P0.05）;
注射
产物与血清组和环磷酰胺组无差异（P0.05）;
阴性对照组与所有组均有差异（P0.05）;
产物组与口服产物组有差异（P0.05），注射产物组与口服产物组有差异（P0.05）。
3.2各组血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）如表1所示，谷草转氨酶（AST）
的结果中只有正常组与其他组有差异（P0.05），其余各组间谷草转氨酶（AST）的结果均无
差异;
谷丙转氨酶（ALT）的结果中只有正常组与其他组有差异（P0.05），口服产物组、环
磷酰胺组与注射产物与血清组之间无差异（P0.05）;
环磷酰胺与注射产物组有差异（P
0.05），口服产物组与阴性对照组有差异（P0.05）。
3.3TNF-水平如表1所示，环磷酰胺组TNF-的水平与注射产物与血清组之间无差
异（P0.05），正常组、阴性对照组与血清组无差异（P0.05），环磷酰胺组与阴性对照组有
差异（P0.05）;
注射产物与血清组与阴性组有差异（P0.05）。
表1各组肿瘤质量、肝功能
和细胞因子水平（略）
5
4讨论
tips:
感谢大家的阅读，本文由我司收集整编。
仅供参阅！
关于瑞香狼毒药材中蛋白质部位的体外活性研究
薄彧坤，周燕，王伟，王玉华
【摘要】目的建立瑞香狼毒药材蛋白质部位体外活性研究的方法。
方法琼脂糖扩散
法测定总蛋白的抑菌活性;
MTT细胞培养法测定总蛋白及分离得到的6个分子量蛋白对
肝癌细胞生长的抑制作用及对正常细胞的毒性作用。
结果体外活性研究结果表明，总
蛋白没有抑菌活性但具有抗肿瘤活性和细胞毒性;
分离得到的6个分子量的蛋白中2、
3、4、6对肿瘤细胞有抑制作用，1、3、4对正常细胞有毒性作用。
结论实验方法可作
6
为瑞香狼毒药材中蛋白质生物活性研究的方法，为瑞香狼毒蛋白质部位的毒性蛋白及
活性蛋白的研究提供了方法依据。
【关键词】瑞香狼毒;
蛋白质;
体外活性
Abstract：
ObjectiveTosetupthemethodofdetectinginvitroactivityofproteinsitefrom
StellerachamaejasmeL.MethodsThemethodofagardiffusionwasusedantibacterialactivity
oftotalprotein;
MTTcellculturaltechniquewasadoptedtomeasurethecellactivityoftotal
proteinandthesixmolecularweightproteinsisolatedfromtotalprotein.ResultsThestudyof
invitroactivityindicatedthatthetotalproteinwaslackofantibacterialactivitybuthadthe
functionofanti-tumorandtheactivityoftoxicity;
theproteinsof2,3,4,6hadthefunctionof
anti-tumorandthe1,3,4havethetoxiceffecttonormalcells.ConclusionInthispaper,the
methodcanbeusedtostudythebiologicalammityoftheproteinofStellerachamaejasmeL.
Keywords：
StellerachamaejasmeL.;
Protein;
Invitroactivity
瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒StellerachamaejasmeL.的干燥根，又名断肠
草、红狼毒、火柴头花等[1]，它广泛分布在我国西北、西南、东北及河北等地。
瑞香
狼毒始载于《神农本草经》，历代本草均有记载;
其味苦、辛，性平、有毒，入肺、脾、
肝经，功能与主治为逐水祛痰、破积杀虫。
瑞香狼毒是蒙医药常用的药材，作为主成
分制成的蒙成药多用于治疗乳腺炎和腮腺炎。
瑞香狼毒毒性大，经炮制后才入药。
误
7
食或过量，会刺激口腔、咽喉，并可见恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头晕头痛、疲乏无
力，严重者会出现狂躁和痉挛[2]。
瑞香狼毒主要化学成分有香豆素、黄酮、二萜原酸
酯、木脂素类化合物、多糖等[3]。
近年来的研究显示[4，5]，瑞香狼毒具有抗肿瘤、
抗病毒、抗HIV病毒、抑菌、抗癫痫、抗惊厥等作用;
瑞香狼毒作为生物杀虫剂使用，
原理是利用其药材的毒性作用。
瑞香狼毒药材中毒性成分以及活性成分的研究对确定
瑞香狼毒的炮制方法，从而确保安全、合理的使用瑞香狼毒药材具有重要意义。
本文
就蛋白质部分的体外活
性进行了研究。
1.1材料
瑞香狼毒药材（经内蒙古食品药品检验所康双龙主任药师鉴定）;
细胞株（体外培养人肝
癌细胞株HepG-2，狗肾细胞株）;
MTT（德国simga公司）;
RPMl-l640（美国GIBCO公司，
批号：
60P8244）;
胎牛血清（FBSMdgenicsInc.，批号：
CCS0011-100）;
青霉素、链霉素
（华北制药股份公司）;
胰蛋白酶（上海化学试剂厂，批号：
82-04-12）;
MEM（美国）;
二甲基
亚砜（DMSO天津汇英化学试剂有限公司）;
碳酸氢钠（开原化学试剂厂）。
8
1.2仪器ThennoFomra型CO2培养箱（池本梨花工业株式会社）;
Clympus型倒置显微
镜（日本）;
DG3022A型酶标仪（国营华东电子管厂）;
FA1104型电子天平（上海精科天平）;
培
养瓶（日本）;
3072型96孔板（丹麦）;
3001型培养皿（美国）;
JJT-2型超净工作台（北京半导体
设备一厂）;
YXQG02型电热式蒸气消毒器（山东新华医疗器械股份有限公司）。
2方法与结果
2.1蛋白质的提取分离本实验通过水提、盐沉、透析的提取过程，SephadexG-150、
SephadexG-100、SephadexG-50凝胶柱多次分离过程，SDS-聚丙烯酰胺蛋白质电泳鉴
别过程，共得到6个分子量的蛋白质。
它们的分子量分别为：
14.4，35.0，28.0，
23.0，10.0，94.0kDa。
为了进一步确定瑞香狼毒的活性部位，本实验对瑞香狼毒中的
总蛋白及其分离得到的不同分子量的蛋白进行了体外活性研究。
2.2瑞香狼毒总蛋白的体外活性研究
2.2.1总蛋白的毒性实验[6]取对数生长期狗肾细胞，用胰蛋白酶消化后充分吹打成单
细胞悬液，计数后稀释成1104cll/ml（MEM培养基培养），接种于96孔培养板中，100
l/孔。
然后在实验孔中加入100l样品的培养基，每一浓度级别平行3孔。
对照组加入
等体积溶剂。
将96孔培养板置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养72h后，弃去
培养液，每孔加入新鲜配置的含0.20mgml-1MTT的无血清培养基20l，37℃下继续
培养4h后，除去上清液。
每孔加入150lDMSO溶解formazan沉淀，置微量震荡器上
9
振荡5min使其充分溶解。
在DG3022A型酶标仪上测定490nm处的A（吸收度）值。
结
果见表1。
表1瑞香狼毒中总蛋白质对正常细胞的毒性研究结果（略）
总蛋白的毒性研究和对肝癌细胞的研究使用的样品均为：
将总蛋白分别制成浓度为
0.49，1.02，2.09，4.11，6.06，8.07mg/ml的溶液，并分别编号为1，2，3，4，5，
6。
从表1可以看出，当蛋白溶液浓度增至4.11mgml-1时，A值低于空白溶液的A
值，出现细胞毒性作用，随着浓度的增大，对细胞生长的抑制率增大，毒性作用不断
加强。
2.2.2总蛋白对肿瘤细胞的活性实验[6]取对数生长期的肝癌细胞HepG-2，用胰蛋白
酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1104/ml，接种于96孔培养板中，
100l/孔。
加入100lRPMI-1640培养液，然后在实验孔中加入100l样品溶液，每一浓
度级别平行3孔。
同时设立空白对照，并用抗癌药物环磷酰胺（CPM）做阳性对照。
将
96孔培养板置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养96h后，弃去培养液，每孔加
入新鲜配置的含0.20mgml-1MTT的无血清培养基20l，37℃下继续培养4h后，除去
上清液。
每孔加入150lDMSO溶解formazan沉淀，置微量震荡器上振荡5min使其充
分溶解。
在DG3022A型酶标仪上测定490nm处的OD（吸收度）值。
瑞香狼毒总蛋白对
肝癌细胞生长抑制结果见表2。
表2瑞香狼毒中总蛋白质对肝癌细胞生长抑制率结果
（略）
10
从表2可以看出，总蛋白溶液从浓度为2.09mgml-1开始出现抑制肝癌细胞生长的
现象，并随浓度增加抑制肝癌细胞生长的强度越大。
2.2.3总蛋白的抑菌实验[7,8]
菌株的培养：
在无菌操作条件下，用接种环取金黄色葡萄球菌菌株一环，用划线法
接种在制作好的培养基中，然后用不同接种环分别以同样方法对铜绿假单胞菌进行接
种。
把各菌种置37℃恒温培养箱中培养24h，然后取出放入4℃冰箱中保存备用。
供试品溶液的制备：
精密称取瑞香狼毒总蛋白样品85.2mg，加入4ml蒸馏水溶解即
得。
有的文献报道[4，5]灵芝具
有对抗肿瘤的作用，这次实验结果显示，含灵芝代谢产物的培养液也具有抗肿瘤的作
用，在我们的实验结果中不论口服与腹腔注射含灵芝代谢产物的培养液肿瘤的质量均
缩小，其结果具有统计学差异。
但作为阳性组的环磷酰胺组其肿瘤的质量要小于口服
含灵芝代谢产物的培养液组，这说明可能经口服后存在首关消除，而肝功能的指标也
显示口服含灵芝代谢产物的培养液组的谷丙转氨酶要低于阴性对照组和正常组。
而在
11
培养液中到底是何种化学集团起到抗肿瘤作用呢?
我们根据刘文泰等人报道的琥珀酸酐
法用小牛血清白蛋白封闭了代谢产物中的羟基后，用它作为免疫原免疫老鼠产生对抗
除羟基外其他化学集团的抗血清，我们用这些抗血清封闭了含灵芝代谢产物的培养液
的其他化学集团，只保留了部分羟基，实验结果显示用抗血清封闭的含灵芝代谢产物
的培养液的抗肿瘤活性增强，这说明可能灵芝代谢产物中的羟基在对于抗肿瘤起了很
大作用。
而腹腔注射的作用强于口服的作用说明，这些代谢产物中的羟基可以被肝脏
清除。
我们的结果还显示同时含灵芝代谢产物的培养液与抗血清组与注射环磷酰胺组的小
鼠血清TNF-水平都很高。
而环磷酰胺对肿瘤细胞有直接的杀伤作用，而这些死亡的
肿瘤细胞可能刺激了小鼠血清TNF-水平的升高。
而同时含灵芝代谢产物的培养液与
抗血清组的TNF-水平也同样升高说明，这些灵芝代谢产物中可能有直接杀伤肿瘤细
胞的物质存在。
【参考文献】
[1]单卫华,张玲,时延增,等.灵芝菌发酵液制剂中灵芝多糖及总糖含量测定[J].时珍
国医国药,2000,11（9）：
797.
[2]李丽华，刘文泰.抗中药成分的特异性抗体在中药质量检测中的应用探讨[J].中国中
医基础理论杂志,2008，14（9）：
686.
12
[3]YamazakiM,SatoA,SaitoK,etal.MolecularphylogenybasedonRFLPandits
relationwithalkaloidpatternsinLupinusplants[J].BiolPharmBull,1993,16
（2）:
1182.
[4]刘高强，王晓玲.灵芝多糖的抗癌构效关系及其抗癌作用机制[J].菌物学
报,2006,25（3）：
430.
[5]吴珍珠.灵芝孢子抗肿瘤的作用机制[J].细胞与分子免疫学杂志,2006,22（6）：
836.
医药卫生栏目
13
升级会员 