生物化学检验实验.docx
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生物化学检验实验
临床生物化学实验
实验一实验室基础知识
一、现代化学试剂及玻璃器械的使用
实验目的：
l、了解化学试剂的等级和保管原则
2、掌握玻璃器械的规范使用
3、明确各玻璃器械的功用
实验材料：
不同等级的化学试剂量材量筒容量瓶吸管（移液管无分度两标线管有分度吸管微量吸管）吸球
实验步骤：
1、根据试剂瓶上的标志说明该试剂的等级及保管方法
2，玻璃量器的使用：
按照玻璃量器上的标示，分量入式及量出式量取一定量的液体5次以上，达到熟练使用，注意吸液时的刻度的读取及量液时角度。
二、恒重法校正移液管
实验目的；掌握恒重法校正玻璃量具
实验器材：
万分之一天平纯水移液管温度什移液瓶
实验原理：
Vt＝Wt/dt
实验步骤：
1、调整万分之一天平。
2、用被检的移液管取20ml水，注入已称量质量的移液瓶中。
3、称量总质量，得出水质量
4、用温度计测量水温，确定该温度下的水密度。
5、计算水体积。
6、计算称量误差，确定是否在允许范围之内。
实验二 无蛋白血滤液制备
实验目的：
掌握无蛋白血滤液制备的方法
一、钨酸法
实验原理：
钨酸钠与硫酸混合，生成钨酸，钨酸可以与血液中蛋白质结合生成蛋白质盐沉淀，经离心将蛋白质除掉。
实验试剂：
1、100g/L钨酸钠溶液：
称取钨酸钠100g，溶于水中加水至1000ml
2、1/3M硫酸：
取己标定的当量硫酸2份加水1份混合。
实验操作：
用吸管将全血缓慢放入蒸馏水中，每次加入试剂后充分混匀，静止10分钟后离心，取上清液备用．
注意事项：
1、抗凝血中草酸盐过剩时，蛋白质沉淀不完全，沉淀不能变为暗褐色，此时可滴加100g/L硫酸一滴，摇匀，至沉淀变为暗褐色再进行过滤。
2、除蛋白滤液不透明时，应将蛋白质沉淀及滤液倾回试管，按1所示方法加人硫酸，使蛋白质完全沉淀。
3、此滤液适于葡萄糖、肌酐、肌酸、尿酸等测定．
二、三氯醋酸法
实验原理：
血液中蛋白质能与三氧醋酸作用于生成不溶性的蛋白质盐沉淀，经离心将蛋白质除去，上清液为无蛋白血滤液．
实验试剂：
100g／L三氯醋酸溶液
实验操作：
取血清或血浆一份，三氯醋酸9份，加入血清或血浆中（边加边摇）．充分混匀后离心，取上法备用．
注意事项：
1、此法所得滤液量多，酸性较强，适于较强酸性溶解的物质定测定，如钙、磷等。
2、不适于碱性还原法血糖定量测定。
3、三氯醋酸易潮解，注意保存．
实验三 吸收曲线的制作和721波长的校正
实验目的：
l过硫酸铜和镨铷滤光片的吸收曲线的测绘，了解分光光度计波长度盘上标度的正确性．
2、掌握721分光光度计波长校正方法（镨铷滤光片法）及重复性检查．
实验原理：
镨铷滤光片在可见光区域最大吸收峰为529nm，利用这个特性校正721分光光度计．
实验器材：
721分光光度计镨铷滤光片坐标纸烧瓶吸管硫酸铜标准储存液血清总蛋白测定液
实验步骤：
一、校正
1、预热仪器
2、置波长580nm处，T ％调至最大，用一白纸条观察是否有光强均匀的光斑在吸收池处出现，调节光源灯泡使用其符合要求．
3、把灵敏度钮置于最低端，波长度盘置529nm处，反复调节透光度和100％直至稳定，将镨铷滤光片插入光路，仔细旋转波长度盘，找到T值最低点，此时波长应为529nm（λm）
4、计算波长误差：
Δλ＝λ－λm
5、校正：
调波长于529nm处，取出镨铷滤光片，调节T值至于100％处，再插入镨铷滤光片，打开盖板，调节波长校正螺丝，使值最低．波长校正步骤反复检查波长误差，直至符合要求。
二、重复性检查
1、用蒸馏水作空白将波长度盘固定在先690nm，调节透光度为100％．
2、连续测量五次硫酸铜标准液（31.35mol／L即 2000ug／ml），分别记录
透光度值。
3、计算：
Δl=lmax－lmin。
Lmax、lmin分别为透光度最大值和最小值，一般要求Δl小于0.5％
三、吸收曲线制作
1、连续测定五个不同浓度的蛋白标准液，记录其吸光度值．
2、分别以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制吸收曲线．
实验四 血清蛋白醋酸纤维素膜电泳
实验原理：
带电质在电场中向与其极性相反的方向流动的现象称为电泳．血清中各蛋白质都有不同的等电点，当将其置于比其等电点高的PH缓冲液中时，他们都将带负电荷在电场中向正极泳动．由于各蛋白质等电点及所带电荷量和分子量大小都有所不同，因而在电场中泳动速度不同，利用这个特点将血清中各种蛋白质分开．
实验仪器：
电泳仪电泳槽血清加样带分光光度计滤纸剪刀
实验材料：
醋酸纤维素膜规格2×8cm。
实验试剂：
l、巴比妥－巴比妥钠缓冲液（PH8.6＋ 0.1、离子强度0.06）：
称取巴比妥2.21g，巴比妥钠12.369于500ml蒸馏水中，加热溶解，待冷至室温后，再用蒸馏水补充至于1L。
2、氨基黑 10B染色液：
称取氨基10B 0.1g，溶于无水乙醇20ml中，使溶解。
另取磺基水杨酸2.5g，溶于74.5ml蒸馏水中，再将二液混合摇匀。
3、漂洗液：
甲醇45ml，冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，摇匀．
4、0.4M氢氧化钠溶液。
实验操作：
1、将缓冲液加入电泳槽内，调节两侧槽内的缓冲液，使其在同一水平面上。
2、醋纤膜的准备：
取在缓冲液中浸泡的醋纤膜一张，在毛面的一端（负极侧）1.5厘米处，用铅笔画一横线，作点样标记，编号后，将醋纤膜置于巴比妥－巴比妥钠缓冲液中浸泡，待充分浸透后取出（一般为二十分钟）夹于洁净滤纸中间，吸去多余的缓冲液。
3、将醋纤膜毛面向上贴于电泳槽的支架上拉直，用微量吸管吸取无溶血血清在横线处沿横线加3－5微升。
样品应与膜的边缘保持一定距离，以免电泳图谱中蛋白区带变形，待血清渗入膜后，反转醋纤膜，使光面上平直地贴于电泳槽的支架上，用双层滤纸或四层纱布将膜的两端与缓冲液连通，稍待片刻．
4、接通电源，注意醋纤膜上的正负极，切勿接错．电压90－150伏，电流0．4－0.6mA/cm宽（不同电泳仪所需电压、电流可能不同，应灵活掌握）；夏季通电45分钟，冬季通电60分钟，待电泳区带展开约25－35mm。
，即可关闭电源。
5、染色：
通电完毕，取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色5－10分钟（以白蛋白染透为止），然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。
6、定量：
将漂洗净的薄膜吸干，剪下各染色的蛋白区带放入相应的试管内，在白蛋白管内加 0.4M氢氧化钠溶液6ml（计算时吸光度乘2），其余各加3ml，振摇数次，置37度水箱20分钟，使其染料浸出、对于浸出的氨基黑10B，用分光光度计，在波长600－620nm读取各管吸光度，然后计算各自的含量（在醋纤膜的无蛋白区带部分，剪一条与白蛋白区带同宽度的膜条，作为空白对照）．
计算：
各组分蛋白％=Ax／At×100％
各组分蛋白g/L＝各组分蛋白百分数×血清总蛋白g/L
AX表各组分蛋白吸光度At表各组分蛋白吸光度总和
参考值：
失败原因：
1、电泳图谱不整齐：
点样不均，薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发，缓冲液变质：
电泳时薄膜放置不正确，使电流方向不平行．
2、蛋白组分分离不佳：
点样过多，电流过低，薄膜结构过分细密，透水性差，导电性差等．
3、染色后白蛋白中间着色浅：
由于染色时间不足或染色液陈旧所致：
若因蛋白含量高引起，可减少血清用量或延长染色时间，一般以延长2分钟为宜．若时间过长，球蛋白百分比上升，A/G值会下降．
4、薄膜透明不完全：
温度未达到90度以上将标本放入烘箱，透明液陈旧和浸泡时间不足等。
5、透明液上有气泡：
玻璃片上有油脂，使薄膜部分脱开或贴膜时滚动不佳．
实验五火焰光度分析
实验原理：
火焰光度分析法是一种发射光谱分析．样品中的钾钠原子受火焰的热能作用被激处于激发态，激发态原子不稳定，迅速回到基态，放出能量，发射出元素特有波长的辐射谱线，利用此原理可进行火焰光度分析．钾的火焰呈深红色波长为767nm。
，钠的火焰呈黄色波长为589nm。
实验试剂：
钾钠标准液
实验仪器：
火焰光度计（HG3型HG5型）
实验操作：
一、HG3型
1、开机：
（l）、接通电源，打开电源开关及压力开关．
（2）、当压力达到0.04MPa时打开煤气阀，同时按下点火开关点火，稳定10分钟后进行测定．
2、加样
3、测定
（1）、调零：
扭动电源开关旋到测定档，转动调零钮，以蒸馏水调零。
（2）、定标。
调零后，用钾或钠标准调到标准值位置．
（3）、测定：
吸入待测样品，测得值即为所测标本中钾或钠的含量。
4、关机：
先关闭煤气开关，然后再关闭电源开关。
二、HG5型
1、开机：
（l）接通电源，打开电源开关及压力开关．
（2）当压力达到0.08MPa时打开煤气阀，仪器自动点火，如未点着．15秒后，仪器会自动再次点火．调整火焰高度至8mm左右，稳定20分钟
2．加样：
以锂内标波为稀释被，对标本进行1：
200稀释即为测定液．
3、测定：
（1）以锂内标稀释液调零．
（2）以钾钠标准液进行定标．
（3）按下测定旋钮或进行测定．
实验六电化学分析（离子选择电极）
一、实验原理：
离子选择电极分析法是以测量电池的电动势为基础的定量 分析方法．将离子选择电极和一个参比电极连接起来，置于待测的电解质溶液中，就构成一个测量电池，此电池的电极电位与被测的离子浓度符合能斯特方程：
Φ＝Φ02.303RT／nF×Lgai。
离子选择电极由于锂钠等离子不同活度的作用而产生不同的电位，这种电位的变化由离子活度决定，与离子浓度成比列．
二、实验试剂。
厂家供给
三、实验操作：
1、开启仪器，冲洗管道．
2、用活化液活化电报．活化时间一般15－30分钟为．
3、仪器自动定标．
4、测定结果，由仪器内微处理计算器后，打印教值．
5、关机前，应冲洗电极和管道．
实验七酶学标准曲线的制作
一、实验目的：
掌握酶学标准曲线的制作、酶学固定时间法的测定及半自动化分析仪的使用。
二、实验原理：
L－丙氨酸＋α－酮戊二酸ALT丙酮酸＋L－谷氨酸
丙酮酸＋NADH＋H＋→L－乳酸＋NAD+
三、实验试剂仪器：
ALT／GPT试剂待测标准物半自动生化分析仪试管加样器
四、实验操作：
1、稀释试剂．
2、开机预温达37度．
3、选取测定程序．
4、测试：
五、实验结果：
把测得数据按ΔA/min—U/L作图，绘制标准曲线．
实验八酶活性测定（连续监测法）
一、实验目的：
掌握连续法和定酶的活性及半自动生化分析仪的使用
二、实验原理：
U/L＝K·ΔA/min。
三、实验操作：
1、诱导试剂．
2、开机预温达37度．
3、选取测定程序．
4、测试：
加入试剂准确计的30秒后测定读取吸光度．以后每隔30秒测定一次．
四、实验结果：
计算ΔA/min求出测定结果．
实验九溶血、黄疸对酶活性测定的影响
一、实验目的：
考察在干扰物质存在时，酶活性测定的准确性
二、实验原理：
L－丙氨酸＋α－酮戊二酸ALT丙酮酸＋L－谷氨酸
丙酮酸＋NADH＋H＋→L－乳酸＋NAD+
三、实验试剂仪器：
ALT／GPT试剂待测正常和溶血黄疸血清半自动生化分析仪 试管加样器
四、实验操作：
1、稀释试剂．
2、开机预温达37度．
3、选取测定程序．
4、测试：
5、结果分析：
实验十 核酸的提取与纯化
实验目的：
掌握核酸提取与纯化的方法，离心技术的合理使用．
一、DNA的提取
实验原理：
酚为有效的蛋白质变性剂，并且饱和的酚与水相有效的分开．因此，在含核酸的样品加入酚，可将样品中的蛋白质变性后形成沉淀层，位于水相与有机相的界画，从而达到纯化核酸的目的．但酚不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚层中含有10－15%的水,从而溶解一部分poly－（A）RNA。
将酚与氯仿联合使用即可克服这两方面的不足．氯仿除可使蛋白质变性外，还能加速水相与有机相的分层．在氯仿中加入少许异戊醇可减少油提生产生的泡沫．在酚－氯仿联合抽提核酸后，再加氯仿抽提一次；可除去样品中的痕量酚．
实验试剂：
l、饱和的熏蒸酚：
市售AR经酚须在182度用空气冷凝管进行重蒸馏，冷却后加入8一羟基喹啉，使其浓度达到1g／L，向液体酚中加入等体0.5mlTris－HCL缓冲液（PH8.0），置磁力搅拌15min，抽取上层（水层）液体再加入等体积0.lmol／LTris－HCL缓冲液（pH8.0），同样搅拌15min，分相完全后吸取上层液体，最后向酚层（下层）加入1／10体积的含2g/L巯基二醇的0.1mol/LTris－HCL缓冲进（pH8.0），分装后避光20度保存，至少可用一个月，
2、氧仿
3、异戊醇
4、氯仿／异戊醇混合液，比例为24：
1或9：
1
①8一羟基喹啉为黄色化合物，是一种抗氧化剂．又是酶的部分抑制剂和金属离子的弱结合剂．加入8一羟基喹啉使酚层呈黄色，又可作为识别的标记．
实验操作：
l、样品加入等体积和酚或酚／氯仿（1：
1）混合液．
2、上下颠倒很匀．
3、室温，12000转／分钟，离心5分钟．如蛋白质较多或分界不清时，可离心10分钟。
4、吸取上层（水层）移置另一新的离心管中．
5、加入等体积酚／氯仿／异戊酸（25：
24：
1）溶液．重复步骤2、3、4．
6、加入等体积氯仿／异戊酸（24：
1）溶液．重复步骤2、3、4。
7、乙醇沉淀核酸（见核酸的沉淀纯化）．
二、核酸的纯化（醋酸钠乙醇沉淀法）
实验原理：
核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，可以与许多1价、2价离子结合形成盐类，后者在有机溶剂中不溶解也不变性．在较低温度下形成沉淀．
实验试剂：
1、3mol／L醋酸钠缓冲液，pH5.2：
称取醋酸钠（NaAC·3H20）408.1g，由于800ml水中，用冰醋酸调节至pH5.2，加重蒸馏水至1000ml．分装后高压灭菌（以下称3mol/L醋酸钠缓冲液）．
2．无水乙醇及70％（V／V）乙醇．
实验操作：
1、将含核酸的溶液用移液器转至一新的Eppendorf离心管，同时测量合算溶液的体积．
2、加入1／10体积的3mol／L醋酸钠缓冲液。
使醋酸钠的终浓度为0.3mo1/L．
3、下颠倒混匀后，准确加入2倍体积（RNA为2.5倍体积）的预冷无水乙醇，颠倒混匀，置冰浴中15－30min或一20℃30min。
4、4℃12000r／min，离心15min．
5、手持Eppendorf成45度角，使核酸沉淀面向上，用微量移液器或连接真空泵的吸头不可接触沉淀物．
6、向管中加入预冷的70%乙醇至2／3体积．混匀漂洗，以除去残余的盐．
7、4℃12000r／min离心 2min，如步骤5吸取上清液．
8、不盖管盖置室温10－l5min或真空中2min，使乙醇挥发。
三、核酸浓度的测定（DNA）
实验原理：
构成核酸的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使核苷核和核酸在紫外线光具有特征性的吸收光谱，最大吸收峰为260nm。
窄光带紫外分光光度计，长260nm．，比色杯光径1cm，1个吸光度值（1A）相当于50ug/ml双螺DNA，40ug/m1单螺旋DNA或RNA），20ug/ml寡核苷酸
实验步骤：
1、取DNA溶液10ul，加双蒸馏水600ul（即稀释61倍）。
2、用双蒸馏水调零，测定260nm和280nm的吸光度值（A260、A280）．
3、DNA浓度（ug／ul）＝A260×50×61／1000
4、DNA纯度：
A260/A280的比值应大于1.7以上，若样品中含有蛋白质（吸收峰在280nm）等杂质时，比值下降，应重新纯化．
实验十一聚丙烯酰胺凝胶不连续圆盘电泳
一、实验原理：
利用各种载脂蛋白在一定pH下所带电荷数量及颗粒大小不同的差异，从而在电场中获得不同的迁移庇，达到分离测定的目的，
二、实验试剂：
1、凝胶储备液制备及工作混合液比例表
2、脱色剂：
乙醇1000ml，冰醋酸320ml加水至4000ml．
3、染色剂：
考马斯蓝0.46g，溶于400ml脱色剂中。
4、溴酚蓝水溶液：
溴酚蓝0.05g，水溶至100ml。
实验操作。
1、按上表所给的比例配制分离胶，3号试剂要最后加，之后快速混匀．立刻往已封底中的玻璃管中加入上述分离胶约至管长的2／3处，然后沿管壁轻轻加入一薄层水封闭空气．一般在20℃室温中约40分钟左右便形成凝胶．倾去水层，倒立在滤纸上将管内水分沥干，接着按上表已制浓缩胶，6号试剂最后加入，快速混匀，立刻加在分离胶之上距管口上缘8mm处，其上再轻轻加一薄层水，令其在日光灯照射下聚合，约20分钟左右即可聚合完毕，倾去水层．
2、将管底口封闭打开，将装柱完毕的玻璃管插入电泳槽孔中（分离胶在下面），周围不得漏水．
3、加样：
先将4号液稀释（取2ml4号液，加水至6m1）．取血清0.5m1，加4号液释液1.5ml，加7号3滴及溴酚蓝试剂3滴，混匀．检查凝胶管上下口是否已浸在缓冲液中，否则要进行调整．用微量加液器吸取上面已经准备好的样品30－35ul（约含血清7.5ul），沿管壁慢慢将加样器针头伸到上端胶面处．将样品缓缓加到胶面上（要成层不要分散开来）。
4、电泳：
上槽接负极，下槽接正极，盖上电泳槽盖，开启电泳仪开关调节输出电压。
使每管电流量为1－2mA，待溴酚蓝批示剂进入分离胶后，加大输出电压，使每管电流增至4－5mA，当溴酚蓝指示剂泳动到距管下次端0.5cm时停止电泳．
5、剥胶：
比电泳槽上取下胶管，用长针头注射器吸满水后，将针头紧贴管壁慢慢插入，且边插边旋转玻璃管，边将水注入，使凝胶与内管壁分离开，令其脱出，放入染色液中。
6、固定与染色：
让剥出的胶柱在染色液中染色30分钟，凝胶被国定，蛋白质染上蓝色，成若干个圆盘样区带。
脱去浮色：
将染色后的胶柱轻轻转入小试管中，加入脱色剂浸泡，并多换洗几次，直至背景清晰及区带清晰为止．
实验十二方法学评价（批内重复性试验）
一、实验目的：
考察实验方法的随机误差，评价该方法的精密度。
二、实验步骤：
1、在短时间内，对同一份样品按定的操作方法重复测定20次。
2、统计处理：
对所测定结果．按下式分别计算均值（X）、标准差（SD）、变异系数（CV）。
X＝∑X／n SD＝∑（X-X）2／n－1 CV＝SD／Y×100%
3、评价：
一般分析CV值小于50％，精密分析CV值小于2%
实验十三方法学评价（回收试验）
一、实验目的：
检测比例系统误差，以衡量分析方法的准确度．
二、实验步骤：
1、样品制备：
基础样品：
血清2.0ml＋蒸馏水0.1ml
低浓度回收样品：
血清2.0ml＋4mmol/L钙标准液0.1ml
高浓度回收样品：
血清2.0m1＋25mmo1/L钙标准液0.1m1
2、按下式分别计算加入浓度
加入浓度＝标准液浓度×标准液量/血清量＋标液量
3、分别测定各,样品管的浓度3次以上
4、计算。
分别计算样品回收浓度和回收率
5、回收浓度＝回收样品测得浓度－基础样品测得浓度
回收率＝回收浓度/加入浓度×100%
实验十四方法学评价（干扰试验）
一、实验目的：
考察该方法的恒定系统误差，以评价候选方法的准确度．
二、实验步骤：
1、样品制备：
基础样品：
血请1.8m1＋0.2ml
低浓度回收样品：
血清 1.8m1＋63umol/L肌酐标准液 0.2ml
高浓度回收作品：
血清 1.8m1＋414umol/L肌酐标准液 0.2ml
2、按下式分别计算加入浓度
加入浓度＝标准液浓度×标准液量／血清量＋标液量
3、分别计算各样品管的浓度
4、计算干扰值：
干扰值＝干扰样品测得浓度－干扰样品测得浓度
5、如何消除干扰（讨论）
实验十五 Levy－Jennings质控目的绘制
一、实验目的：
1、明确临床生物化学室内质量控制的意义。
2、掌握Levy－Jennings质控图的绘制及结果解释和失控原因的分析方法。
二、实验步骤：
l、OCV和RCV的计算：
分别在OCV和RCV的条件下，对同一批号的质控血清测定不少于20次，分别计算出均值、标准差、变异系数。
2、绘图：
（１）在纵坐标上标出X、X ＋2SD、X ＋3SD的标志，并将其具体数值标在左坐标尺上。
（２）用红笔画出X ＋2SD线，用蓝笔画出X ＋3SD线即成为一张OCV（或RCV的空图、其中每一小格代表SD／10，同时还应添齐图纸上方的各项：
实验项目、测定单位、血清来源和批号、起止日期、主要仪器及使用波长等．
（３）在图纸下方日期、同定值、操作者按原始计录添入相应内容。
日期一栏内，在OCV测定中，应改为检测批次（或序号）．未做测定的节假日，星期日在图上做空格处理。
（４）画出每个检测值所对应的图点：
在图上的横坐标为其日期，而纵坐标为测定值。
失控处理：
1、简单迅速回顾整个操作，分析最可能发生误差的步骤，核对计算是否正确。
若操作是手工的，要核对吸管是否用错，仪器功能是否正常，比色杯是否清洁等。
2、如上述无误，再将质控血清重复测定一次，看结果是否有改进，如有改进，说明误差很可能为操作错误所致．如加标本量、试剂量的错误，波长或滤光片选择错误等偶然误差所致．
3、如重做后结果仍不在允许范围，用一瓶新的质控血清重做。
观察结果能否更正。
4、如仍不能解决问题，用定值血清与质控血清同时测定。
如定值血清结果满意，说明原有一批质控血清己变质或污染．
5、如仍不能解决问题，应重新校正仪器，或者更换新的标准液以及重新配制试剂，然后重新操作查找原因。
实验十六改良Monica
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