色谱柱的使用说明.docx
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色谱柱的使用说明
色谱柱的使用说明
液相色谱柱是昂贵的色谱耗材，是液相色谱仪的心脏，有着严格的生产标准和测试程序，为了充分发挥色谱柱的性能，最大程度延长色谱柱的使用寿命，请仔细阅读此部分。
色谱柱的身份确认：
为了保证每一支色谱柱的质量，月旭公司出品的每一支色谱柱都有唯一的身份编码，根据此编码，我公司可以将质量问题确定到个人，为了保障你的利益，收到色谱柱时，请完成以下程序：
1、仔细查看包装盒是否完好，与自己请购的色谱柱是否一致；
2、盒内是否有质量检验报告及检验人员签名；
3、色谱柱表面有无碰撞伤痕，柱两端保护色谱柱的塑料堵头是否完整；
4、色谱柱柱体是否贴有月旭公司色谱柱的身份标牌，并仔细对照包装盒与色谱柱标签上的型号和编号是否一致。
结构和安装：
结构：
月旭公司出品的高效液相色谱柱柱管材质均为316L不锈钢，两端结构完全一致，其结构如图一：
图一Ultimate
系列液相色谱柱结构
安装：
为了保证色谱柱使用时有最高柱效，连接管路尽量使用适合的细径管路，色谱柱进出口的连接必须非常适配，连接管端口部分必须平整，不能有毛刺和切口斜面等现象，各种连接管路请使用专业工具切割修整；
1、取出色谱柱，仔细查看柱身洗脱液流向箭头标识，用手旋下柱两端的塑料堵头，放好色谱柱，使洗脱液流向和柱身所示流向一致，如图二所示：
图二色谱柱的正确连接
2、用手将“连接管路的不锈钢或者其它材质的接头”旋入色谱柱两端，管路接头要和色谱柱接口连接紧密，确保零死体积连接，在色谱仪正常运行时没有漏液。
色谱柱的正确使用：
色谱柱是昂贵的色谱耗材，正确的使用和维护对保证色谱柱的正常使用和延长寿命至关重要。
1、色谱柱使用前注意事项：
1）、色谱柱内的存储液：
月旭公司色谱柱的存储液，如没有特殊说明均为质检报告中所述流动相，氨基（NH2）、氰基（CN）、硅胶柱（SiO2）均为正相条件–正己烷/异丙醇体系，反相柱（C1、C4、C8、C18、苯基Phenyl）均为甲醇/水体系，检测前，请用相互溶的试剂将其替换；
2）、新色谱柱的平衡：
新反相色谱柱：
用纯甲醇冲洗色谱柱30个柱体积，再更换成能与检测流动相互溶的流动相冲洗30个柱体积，最后用流动相稳定系统至基线平稳；
新的正相色谱柱：
用异丙醇0.5ml/min冲洗30个柱体积，再更换成检测流动相稳定系统至基线平稳；
2、色谱柱的使用方向：
月旭公司出品的高效液相色谱柱标签上的箭头方向为流动相流向，使用过程时也按此方向，避免双向混用，导致两端填料同时污染，不利于色谱柱的再生和维护；
3、流动相和样品保持洁净：
由于悬浮在样品或流动相中的细小颗粒会堵塞色谱柱两端的筛板，各种试剂尽量使用色谱纯级的，用量少的试剂纯度至少是分析纯，水最好是超纯水和全玻璃器皿双蒸水，使用前建议用0.45μm的滤膜过滤；样品溶液使用针筒过滤；
样品中的杂质是造成色谱柱污染、柱效下降的最主要原因之一，复杂样品可选样品预处理柱（SPE柱）进行样品处理，如果不方便处理，最好使用相匹配的保护柱，样品溶剂与流动相要相匹配，不能出现样品不互溶，极性相差太大等想象，否则会造成色谱峰形变差，鬼峰等现象，使用流动相溶解样品能有效的避免上述情况发生；
4、色谱柱允许使用的pH范围：
每款色谱柱都有自己特定允许使用的pH范围，请仔细对照你的色谱柱的使用pH范围（表一），在pH范围以外使用，会使硅胶基质溶解或键合相水解，对色谱柱造成不可恢复的损伤，如果在临界pH处使用，分析结束后立即用适合于色谱柱保存并与当前使用的流动相互溶的淋洗液置换掉。
表一UltimateTM系列色谱柱pH耐受范围
柱型号
XB-C1、C4、C8、C18
XB-Phenyl
XB-CN
AQ系列
LP系列
pH范围
1.5-10.0
1.5-10.0
1.5-9.0
1.5-10.0
1.0-9.0
5、PAH专用色谱柱使用注意事项：
PAH专用色谱柱是月旭公司针对欧盟76/769/EEC号环保指令专门设计开发的专用色谱柱，同时分离16种多环芳烃物质，是一类含有一个苯环以上的芳香化合物，为了保障色谱柱的分离能力，请尽量专柱专用，检测色谱条件如下：
色谱柱：
UltimateTMPAH，5μm，250mm×4.6mm
检测波长：
220nm
流速：
1.5ml/min
柱温：
室温
进样量：
10μl
流动相：
时间（min）
A：
水（由于%）
B：
乙腈（%）
0
60
40
20
0
100
33
0
100
34
60
40
备注：
色谱条件可以根据客户所选择的色谱柱规格调整，满足相关规定即可。
分析前，用流动相梯度洗脱程序的初始浓度，冲洗系统至基线平稳，运行一次完整的分析程序（即：
对标准溶液进样检测），待系统稳定后，再进行检测，如果较长时间未使用，可能需要多运行几次完整的分析程序，得到重现的色谱图后再进行检测，由于欧盟76/769/EEC号环保指令要求检测的都是机体复杂的样品，检测完全后按色谱柱的维护项下“4、避免强保留物质在色谱柱保留”多冲洗色谱柱，其它维护和再生同UltimateR系列的反相柱。
色谱柱的保存：
短时间保存：
间隔不超过四天，色谱柱按平时维护程序冲洗至基线平稳，反相色谱柱保存在不带有缓冲盐、离子对试剂的有机相/水溶液中，有机相不低于20%；正相色谱柱正相使用保存在纯正己烷中，反相使用保存在纯有机溶剂中；并将随柱的塑料堵头旋紧密封。
长期保存：
反相色谱柱保存在80%甲醇或80%乙腈水溶液中；正相色谱柱正相使用保存在纯正己烷中，反相使用时需将柱内存储液用异丙醇置换，最后用正己烷保存；最好将色谱柱从仪器上取下，并将随柱的塑料堵头旋紧密封。
色谱柱的维护：
1、柱压升高是每个色谱工作者都很头疼的问题，长时间使用造成柱压的缓慢升高通常是正常现象；短时间甚至是突然的柱压升高通常是异常升高，排除仪器的故障，确定是色谱柱自身原因，一般有以下几点：
1）柱头的过滤筛板污染（固体颗粒物堵塞、强保留物质累积）：
解决方法：
a、在柱前端加上在线过滤器或保护柱，用甲醇/水=20/801.0ml/min反向冲洗色谱柱180min；
b、在柱前端加上在线过滤器或保护柱，反向使用；
c、可将柱头打开，将色谱柱头中过滤筛板取出，在稀硝酸溶液内超声清洗20min，纯水超声清洗20min，最后用甲醇超声清洗20min，重新装入色谱柱；
2）柱头填料污染（固体颗粒物堵塞、强保留物质累积）：
解决方法：
a、用可以溶解污染物的溶剂较长时间（180min）反向冲洗色谱柱；
b、可将柱头打开，小心取出被污染的填料，用相同的填料重新装入修复；
3）pH使用不当造成的损伤：
解决方法：
pH使用不当造成固定相的缺失或塌陷，很难使色谱柱恢复，只能更换色谱柱。
2、使用保护柱和在线过滤器：
样品和流动相中不能完全过滤掉及泵磨损、密封圈和管路老化产生的固体颗粒物，进入到色谱柱中就会堵塞筛板，导致柱压升高，柱效下降，保护柱和在线过滤器上都有筛板，孔径与分析柱的孔径相同，能阻止颗粒物到达色谱柱，在分析故障中，柱压升高占很大比例，因此建议您在色谱柱前端加上在线过滤器或者保护柱；
3、缓冲盐的正确使用：
缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，其使用不当会析出，加快泵柱塞杆和密封圈，流通阀的磨损，堵塞色谱柱头筛板，填料基质上的微孔和颗粒间的间隙，使填料板结柱压升高，阻碍基质上键合相的碳链自由舒展，使色谱柱保留能力下降，柱效降低，缩短其使用寿命，缓冲盐析出后很难去除，因此正确的使用缓冲盐对延长色谱柱的使用寿命非常重要，具体方法如下：
“使用前过渡!
使用后冲洗!
”
1）、等度条件：
分析前后用过渡流动相冲洗柱体积不少于20-30个柱体积，或分析完成后用过渡流动相以0.2ml/min（根据柱规格调整）冲洗过夜；
2）、梯度条件：
分析前，用与初始流动相组成相同的流动相以分析流速冲洗色谱柱不少于20-30个柱体积，分析后，用该过渡流动相冲洗色谱柱不少于20-30个柱体积，且梯度尽量平缓，避免缓冲盐析出。
过渡流动相：
有机相和水相的比例和分析流动相中两相比例一致，或者水相比例高于分析流动相，绝对不含缓冲盐。
3）、缓冲盐析出：
具体补救方法见“色谱柱常见问题和解决方法-3、缓冲盐结晶析出解决方法”。
4、避免强保留物质在色谱柱保留：
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，是一个缓慢的过程，一段时间后会对样品成分产生额外的保留行为，引起峰变宽，拖尾，使柱效下降，保留时间变化，到一定程度时会导致柱压升高，对许多样品特别是复杂样品很难判断其是否含有强保留物质，因此要预防这一切的方式，坚持每天分析完成后用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上。
清洗方法：
1）、未使用缓冲盐，每天分析完成后用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上；
2）、使用缓冲盐，用上述方法去除缓冲盐后，用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱20个柱体积以上；
3）、补救方法：
水—乙腈—异丙醇（或氯仿）—乙腈—水，每一步需要冲洗不少于30个柱体积。
注意：
不要轻易打开柱头，因为柱头一旦打开，很难恢复到新柱的水平，因为柱头打开而造成的检测后果，客户自行负责。
色谱柱再生：
色谱柱作为液相色谱中的核心检测部件，会随着使用时间和进样次数的增加，出现异常的色谱现象，如果一根色谱柱的柱效太低或者柱压太高，通常认为该色谱柱使用寿命已到，为了延长色谱柱的使用寿命，除了完全按照每一款色谱柱的性能使用以外，适当的色谱柱再生是很有效的途径：
1、氰基（CN）色谱柱的维护和再生：
CN基柱属于中等极性的固定相，作反相色谱时操作和维护和C18柱完全相同，增加水相比例，可以促进样品的洗脱，但是CN属于短链的键合相，水相比例太高易使CN键水解，尤其在色谱柱pH耐受范围以外，极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用，需要按以下程序用15个柱体积溶液冲洗，如下：
95%水/5%乙腈—THF四氢呋喃—95%乙腈/5%水并保持95%乙腈/5%水继续冲洗，以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。
在pH耐受范围条件使用时，也比较伤柱子，要注意冲洗，可以参照上述方法，时间可适当减少。
柱子使用一定时间后，柱效下降，需要老化再生，再生时用15个柱体积的下列溶液冲洗：
95%水/5%乙腈—THF四氢呋喃—95%乙腈/5%水再走流动相即可；
CN柱用于正相时，当柱子使用一定时间后，柱效下降，可清洗一下恢复柱性能，再生时用10个柱体积的下列溶液冲洗：
氯仿—异丙醇—二氯甲烷再走流动相即可；
CN柱最理想的pH范围在pH2.0-5.0；
CN柱的保存，可用异丙醇或正己烷保存（保存溶剂中不能含水），两端封好，流动相改变时要注意过渡和两相之间的互溶。
2、反相柱的再生：
反相色谱柱是使用最普遍的色谱柱之一，除按照以上内容使用以外，必要的再生清洗可以有效的延长色谱柱的使用寿命，用下列每种溶剂20~30个柱体积冲洗：
100％甲醇–100％乙腈–75％乙腈/25％异丙醇–100％异丙醇–100％二氯甲烷–100％正己烷–100％异丙醇–100％甲醇
3、正相色谱柱的再生：
正相氨基柱的键合官能团氨丙基要比C18,C8柱的键合官能团易水解，所以其使用寿命稍短，特别是使用反相条件时，要严格控制PH值范围，PH值越低流动相中水的比例越高越易发生水解。
注意：
所有试剂都要严格脱水
用氨基柱检测酸性物质可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，一定程度上改变对某类的分析物保留性质或表现为柱效下降，再生建议是：
用5-10个的柱体积的含0.5-1.0％NH3的50-50乙腈-水溶液冲洗（冲洗后用不含碱的流动相洗去多余的氨），分析酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1％。
填料被样品中杂质累积污染，色谱柱表现行为柱压增高柱效降低等，
依次用：
甲醇–异丙醇–氯仿–正己烷–氯仿–异丙醇–甲醇冲柱子
（各以0.5ml/min的流速，20个柱体积），再换流动相
NH2柱用于反相条件时，NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用需要清洗一下，需要用10个柱体积溶液冲洗，也是正相条件下使用色谱柱的再生，如下：
95％水/5％乙腈–THF四氢呋喃–95％乙腈/5％水 并保持95％乙腈/5％水继续冲洗，以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。
反相使用氨基色谱柱的再生（每种淋洗液不少于30个柱体积）：
NaOH（pH9.0）–色谱纯水冲–平衡到流动相或者适合保存的溶液
其它正相柱（硅胶柱，Diol柱）的再生（每种淋洗液不少于20个柱体积）：
正己烷–异丙醇
正相柱除水：
含2.5%二甲氧基丙烷（dimethoxypropane）和2.5%冰醋酸的正己烷冲洗30个柱体积。
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