HPLCDAD同时测定红花中4种亚精胺成分.docx

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HPLCDAD同时测定红花中4种亚精胺成分

HPLCDAD同时测定红花中4种亚精胺成分

　　[摘要]采用高效液相色谱（HPLC）的方法，以AgilentZorbaxEclipseXDBC18（46mm×250mm，5μm）为色谱分离柱，流动相为47%甲醇/水等度洗脱，洗脱流速为10mL?

min-1，柱温30℃，检测波长为270，280，290，300nm多波长检测的色谱条件同时测定红花中4种亚精胺成分N1，N5，N10（Z）tripcoumaroylspermidine

（1），N1，N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine

（2），N1（E）N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine（3），和N1，N5，N10（E）tripcoumaroylspermidine（4）的含量，进样体积为10μL。

各成分之间分离度良好，4种亚精胺成分的质量浓度分别在00021～00416（r=09995），00026～00512（r=09997），00027～00540（r=09998），00050～01004（r=09998）g?

L-1内与峰面积呈良好的线性关系，加样回收率为9861%～1009%，RSD为23%～30%。

表明所建立的方法快速简便、具有较好的重复性和稳定性，可用于红花中4种亚精胺成分的含量测定。

　　[关键词]红花；HPLC；亚精胺成分

　　Simultaneousdeterminationoffourcoumaroylspermidineconstituentsin

　　CarthamustinctoriusbyHPLCDAD

　　LIShifei，YUANMaoye，ZHANGLiwei*

　　（InstituteofMolecularScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

　　[Abstract]TheHPLCDADmethodwasestablishedtosimultaneouslydeterminethecontentsoffourcoumaroylspermidine[N1，N5，N10（Z）tripcoumaroylspermidine

（1），N1，N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine

（2），N1（E）N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine（3），andN1，N5，N10（E）tripcoumaroylspermidine（4）]inCarthamustinctoriusThemethodwasperformedonanEclipseXDBC18column（46mm×250mm，5μm）elutedwith47%methanolinanisocraticprogramTheflowratewas1mL?

min-1；theinjectionvolumewas10μL，andthecolumntemperaturewas30℃Thedetectivewavelengthwas270，280，290，and300nm，respectivelyFourcoumaroylspermidineconstituentsshowedagoodlinearityintherangeof0002100416（r=09995），0002600512（r=09997），0002700540（r=09998）g?

L-1，and0005001004（r=09998）g?

L-1，respectivelyTheaveragerecoveriesofthesefourcoumaroylspermidineconstituentswereintherangeof9861%1009%（RSD23%30%）.Inconclusion，themethodissimple，rapid，andsensitive，whichcouldbeusedasaquantitativedeterminationmethodforthefourcoumaroylspermidinecomponentsinCtinctorius

　　[Keywords]Carthamustinctorius；HPLC；coumaroylspermidineconstituents

　　doi：

10.4268/cjcmm20160819

　　红花是菊科红花属植物CarthamustinctoriusL的干燥管状花，全国各地都有分布，主要产自于新疆、河南、四川、浙江等省份。

红花在我国已经有2500年的药用历史，具有活血通经、降血压、散瘀止痛和降血脂等功效。

文献报道的从红花中分离得到的化学成分已经有250多种，包括黄酮类[1]、生物碱类[2]、聚炔类[3]、烷基二醇类[45]、有机酸类[67]、甾体类[8]、亚精胺类[9]等。

其中亚精胺类结构是指具有H2N（CH2）3NH（CH2）4NH2结构单元的多胺类化合物，这类成分显示出了广泛的生物活性，如抗HIV病毒[10]，抗肿瘤[11]，抗氧化[12]等。

2009年中国科学院上海生科院研究人员采用活性追踪的方法从红花分离得到了亚精胺类化合物N1，N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine，并采用细胞培养法，大鼠脑突触体5羟色胺（5HT）再摄取抑制方法以及体内实验法研究了该化合物抑制5HT再摄取的活性，结果表明亚精胺类化合物N1，N5（Z）N10（E）tripcoumaroylspermidine对5HT再摄取有很好的选择性抑制活性[13]。

之后，2013年中国科学院西北高原生物研究所研究人员采用高速逆流色谱技术对红花中的这类亚精胺成分进行了快速制备研究[14]。

可见，红花中的这类亚精胺成分应该在红花功效应该起到了重要作用，然而目前有关这类成分的分析和检测目前还未见报道，因此为了制定这类物质快速检测方法，也为了提高红花质量标准，需要建立一个可靠、准确的分析方法来对该类进行同时测定。

　　本研究建立了HPLCDAD同时测定红花种4种亚精胺成分，并对产自新疆、云南、河南的红花药材进行了4种亚精胺成分的含量测定，可为红花药材的质量控制提供科学依据。

　　1材料

　　Agilent1200系列HPLC仪，包括G1311A四元泵，G1322A脱气机，G1316A柱温箱，手动进样器，G1315DDAD检测器，HPRevB0302化学工作站，美国安捷伦公司；CHEETAHTM中压快速制备色谱；柱层析硅胶（100200目，青岛海洋化工厂）；SephadexLH20（瑞典GE公司）；岛津LC6AD型制备液相；VenusilXBPC18制备柱（212mm×250mm，5μm）；Bruker600MHzAVANCENMRSpectrometer（60013MHzprotonfrequency）；SB3200DTS超声波扫频清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；BSA124S型1/1万电子天平，德国sartorius公司。

　　实验中所用甲醇和乙腈均为色谱纯（美国FisherScientific公司），所用水均为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），所用试剂均为分析纯（天津北辰化学试剂厂）。

　　实验中所用红花均采自新疆，由山西华卫药业有限公司提供，所有样品经山西大学张立伟教授鉴定为菊科植物红花Ctinctorius的干燥管状花，样品含量测定中的云南和河南红花药材均采购于山西药店。

本实验中所用4种亚精胺成分均由实验室自制而成，其结构鉴定是通过与文献中的NMR数据进行比较得出，其纯度由HPLC测定，均>95%，见图1。

　　2方法与结果

　　21测定波长的选择

　　取各亚精胺类化合物对照品，甲醇溶解，进高效液相分析，DAD全波长扫描，根据各亚精胺类化合物的DAD全波长扫描的紫外图谱选取各亚精胺类化合物的最大吸收波长作为含量测定时的检测波长。

最后得出亚精胺类化合物1的最大吸收波长为270nm，亚精胺类化合物2的最大吸收波长为280nm，亚精胺类化合物3的最大吸收波长为290nm，亚精胺类化合物4的最大吸收波长为300nm，所以进行高效液相色谱分析时选取270，280，290，300nm多波长同时检测。

　　22液相色谱分析条件

　　Agilent1200型高效液相色谱仪，分析柱为AgilentC18色谱柱（46mm×250mm，5μm），流动相为47%甲醇水等度洗脱，洗脱流速为10mL?

min-1，柱温30℃，检测波长为270，280，290，300nm多波长检测，进样体积为10μL。

　　23对照品溶液的制备

　　混合对照品贮备液的配制：

分别精密称取亚精胺类化合物1（416mg），亚精胺类化合物2（512mg），亚精胺类化合物3（540mg），亚精胺类化合物4（1004mg），置于100mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到混合对照品溶液贮备液。

　　混合对照品溶液的配制：

用吸量管精密吸取对照品贮备液05，08，20，30，40，50mL分别置于10mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成不同浓度的混合对照品溶液，按照22项下的液相色谱分析条件进行高效液相色谱分析，混合对照品溶液的HPLC图谱见图2。

　　A混合对照品；B新疆红花；C云南红花；D河南红花。

　　图2亚精胺类化合物混合对照品和样品HPLC图谱（λ=290nm）

　　Fig2HPLCchromatogramsofmixedstandardandsamples（λ=290nm）

　　24供试品溶液的制备

　　精密称取红花药材粉末（过60目筛）10000g，置于100mL棕色的具塞锥形瓶中，精密加入15mL甲醇，称重，超声处理（超声频率40kHz，功率比91%，超声温度25℃）10min，放冷后再次称重，用甲醇补足失重，摇匀、过滤，取所得的红花供试品溶液过045μm微孔滤膜后按照22项下的高效液相色谱分析条件进行高效液相色谱分析。

　　25方法学考察

　　251线性关系、定量限和检测限精密量取上述混合对照品溶液适量，采用倍数稀释法进行稀释，得到6个不同质量浓度的系列对照溶液，按照上述色谱和质谱条件进行分析，并记录色谱峰面积，平行进样2次，以亚精胺类化合物的质量浓度（g?

L-1）为横坐标，以各亚精胺类化合物峰面积为纵坐标，绘制4个亚精胺类化合物的标准曲线，见表1。

结果4个亚精胺类待测组分的质量浓度和峰面积的相关系数（r）均大于09995，表明该方法的线性关系良好。

　　252精密度考察按照24项下方法制备红花供试品溶液，吸取同一个供试品溶液按照22项下的液相色谱分析条件进行高效液相色谱分析，连续进样6次，通过计算各亚精胺类化合物的保留时间以及峰面积的RSD。

结果显示4个亚精胺化合物保留时间的RSD分别为064%，060%，054%，064%；4个亚精胺化合物峰面积的RSD分别为30%，47%，40%，26%，说明方法的精密度良好，仪器较为稳定。

　　253稳定性考察按照24项下方法制备供试品溶液，按照22项下的液相色谱分析条件分别于红花供试品溶液制备后的0，2，4，6，12，24h进行高效液相色谱分析，通过计算各亚精胺类化合物的保留时间以及峰面积的RSD，进行方法的稳定性的考察。

结果显示4个亚精胺化合物保留时间的RSD分别为044%，060%，061%，047%；4个亚精胺化合物峰面积的RSD分别为33%，46%，42%，20%，结果表明红花供试品溶液在24h内稳定性良好。

　　254重复性考察取同一批红花药材粉末，按照24项下方法制备供试品溶液，重复制备6份，按照22项下的液相色谱分析条件进行高效液相色谱分析，通过计算各亚精胺类化合物的保留时间以及峰面积的RSD，进行方法的重复性的考察。

结果显示4个亚精胺化合物保留时间的RSD分别为031%，049%，064%，068%；4个亚精胺化合物峰面积的RSD分别为22%，46%，29%，21%，结果表明本方法的重复性良好。

　　255加样回收率试验精密称取已知各亚精胺类化合物含量的红花药材粉末05000g，平行9份，分别按照红花样品中各亚精胺类化合物含量的50%，100%，150%加入对照品溶液，每个浓度3份，按照24项下的方法制备供试品溶液，然后按照22项下的液相色谱分析条件进行进样分析，根据峰面积及各亚精胺类化合物的标准曲线，计算供试品溶液中4个亚精胺类化合物的含量，并计算各亚精胺类化合物的加样回收率以及其RSD，结果显示4个亚精胺化合物平均回收率分别为9861%，9968%，1009%，1001%；RSD分别为23%，25%，25%，30%，见表2。

　　26样品测定

　　精密称取红花药材（产自新疆、云南、河南）3份，按照24项下的方法制备供试品溶液，然后按照22项下的液相色谱分析条件进行进样分析，记录色谱峰面积，将4个亚精胺成分的峰面积代入相应的标准曲线方程中，并计算其质量分数，见表3，色谱图见图2。

实验结果表明不同产地的红花药材中4个亚精胺成分的含量存在一定差异，其中新疆红花中化合物4含量较高，将近是云南、河南产地的一倍，其他亚精胺差异成分不大。

　　3讨论

　　本实验根据4个亚精胺类化合物的DAD全波长扫描图谱，确定各亚精胺类化合物的最大吸收波长分别为270，280，290，300nm，所以进行高效液相色谱分析时选取270，280，290，300nm多波长同时检测。

在建立分离条件时考察了乙腈水，甲醇水等不同的洗脱系统，以及等度和梯度系统方式。

由于4个亚精胺类化合物极性相近，在梯度系统下无法到达分离效果，最终筛选出的甲醇水（47∶63）作为洗脱液时样品中的4个亚精胺类化合物有较好的分离，各个色谱峰的对称性良好。

　　为了得到红花中4个亚精胺类化合物较好的提取率，本实验超声提取及加热回流提取效果，2种方式提取率相近，由于超声提取相对方便快捷，因此选择超声提取法。

此外，本实验还对超声时间以及提取次数进行了考察，结果显示各亚精胺类化合物的峰面积并不随着超声时间的延长以及提取次数的

　　表3不同产地红花中亚精胺含量（n=3）

　　Table3ContentsofcoumaroylspermidinesinCarthamustinctoriusfromdifferentregions（n=3）mg?

g-1

　　产地化合物1化合物2化合物3化合物4

　　新疆0165±00500330±00240405±00351140±0068

　　云南0142±00340320±00380403±00610644±0026

　　河南0196±00200427±00260530±00330680±0027

　　增加而增大，即超声提取10min，提取一次后红花中的亚精胺类化合物已达到最大提取率，因此最终确定红花供试品溶液的制备方法为超声提取10min，提取1次。

　　亚精胺类化合物的分离已有多篇文献报道，且据文献报道亚精胺类化合物表现出了广泛的生物活性，但未有文献对亚精胺类化合物的含量测定进行研究，本实验首次建立了红花种亚精胺类化合物的高效液相色谱含量分析方法，该方法可同时测定了红花4个亚精胺类化合物的含量，方法学考察结果显示本文建立的4个亚精胺类化合物的高效液相色谱含量分析方法其精密度、重现性、稳定性以及准确度均良好，表明该方法准确、可靠，为以后亚精胺类化合物的含量测定研究提供了基础。

本文首次对产自新疆、云南、河南的红花进行了中亚精胺类化合物的含量测定，结果显示不同产地的红花药材中4个亚精胺成分的含量存在一定差异，其中新疆红花中化合物4含量较高，将近是云南、河南产地的1倍，其他亚精胺差异成分不大。

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　　[责任编辑丁广治]