生物化学实验基本知识docWord文件下载.docx
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层析系统分为两个相：
固定相和流动相。
由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得以分离。
此法首先用于有色物质的分离，故又称色层析法。
层析法是近代生物化学最常用的分析法之一，此法可以分离性质极为相似、而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有多种类型，根据所用两组分不同分为以下几类：
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等；
根据操作方式不同分为：
柱层析、薄层层析和纸层析等。
（一）吸附层析法：
吸附层析法（absorptionchromatography）是混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。
吸附层析根据操作方式的不同，分为柱层析与薄层层析两种。
1、柱层析法：
柱层析法是用一根玻璃管柱，下端铺垫棉花或玻璃棉，管内加吸附剂粉末，用一种溶剂润湿后，即成为吸附柱，如图1中的
（1）。
然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，如图1中的
（2）。
假如样品内含两种成分A和B，则二者被吸附在柱上端，形成色圈，如图1中的（3）。
样品溶液全部溶入吸附柱中之后，接着就加入合适的溶剂洗脱，如图6-0-1中的（4）。
A与B就随着溶剂的向下流动而移动。
最后分离情况如图1中的（5）所示。
图6-0-1二元混合物的柱层析示意图
在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。
例如，被吸附后的A粒子被溶解（解吸作用）随溶剂下移，但遇到新的吸附剂，又将A粒子吸附，随后，新溶剂又使A粒子溶解下移。
由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与吸附力不完全相同，A与B移动的速率也不同，经一定时间，如此反复地溶解与吸附，而形成两个环带，每一环带是一种纯物质。
如A与B有颜色可看到色层；
如样品无色，可用其它方法使之显色，为进一步鉴定，可将吸附柱从管中顶出来，用刀将各色层切开，然后分别洗脱，现在多采用溶剂洗脱法，即连续加入溶剂，连续分段收集洗脱剂，直到各成分顺序全部从柱中洗出为止。
最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。
硅胶的吸附能力和含水量关系极大，硅胶吸水后，吸附能力下降，常用于分离非极性的和极性不强的有机物，如甘油脂、磷脂、胆固醇等。
2、薄层层析法：
薄层层析法是吸附剂在玻璃板上均匀地铺成薄层，把要分析的样品点加到薄层上，然后用适当的溶剂展开，而达到分离、鉴定的目的。
其优点是：
设备简单，操作容易；
层析展开时间短，分离时几乎不受温度的影响；
可采用腐蚀性的显色剂，且可以在高温下显色；
分离效率高。
薄板的制备：
所用玻璃板表面必须光滑、清洁。
根据制薄板的方法不同薄板可以分为软板和硬板两种。
软板即不加粘合剂，将吸附剂干粉直接均匀铺在玻板上；
制作简单方便，但是易被吹散。
硬板即用粘合剂如水或其他液体，将吸附剂调成糊状再铺板，经干燥后才能使用；
制备虽然较繁琐，但易于保存。
具体制备方法如下：
（1）软板：
选用一根直径约为1~1.2cm的玻璃管，根据薄层的厚度在玻璃管两端缠几圈胶布，胶布的厚度按需要的薄层厚度而定。
常用的厚度约为0.4~1mm左右。
把干的吸附剂倒到玻璃板上，玻板的一端固定，防止推玻璃管时玻板移动，然后将玻璃管压在玻板上，把吸附剂由一端推向另一端，即成薄板。
要求：
光滑、平整、厚度均匀。
（2）硬板：
将适当调好的吸附剂倒在两块3mm玻板中间所夹的一块2mm厚度的玻板上，然后用一块边缘光滑的玻片把吸附剂刮向一边，即成厚度一定的薄板。
下面介绍氧化铝和硅胶硬板的制备方法。
氧化铝硬板：
称取氧化铝G25g（G表示石膏，这种氧化铝中含5%锻石膏），加水25ml，在烧杯中调成糊状，铺层，先在空气中干燥，后置于200~220℃烘箱中烤4小时即可使用。
硅胶硬板：
称取硅胶G30g，加水60~90ml，在烧杯中调成均匀糊状，立即铺层，室温内干燥后置烘箱中烘干。
此外，也可用淀粉或羧甲基纤维素钠（CMC）作粘合剂制板。
薄层层析的操作步骤是：
点样、展开、显色。
（二）分配层析：
分配层析是利用混合物在二种或二种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法。
如用带水的材料（载体）作为液相（固定相），加入与水不相混合或仅部分混合的溶剂（流动相），则混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开，形成色层。
载体在分配层析中只起负担固定相的作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，如淀粉、纤维素粉、滤纸等。
固定相除水外，还有稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液。
流动相则采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。
纸层析是最广泛应用的一种分配层析。
纸层析法以滤纸为载体，滤纸上吸附着水（约含20%—22%）是经常用的固定相，此类有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。
把欲分离的物质加在纸的一端，使流动溶剂经此移动，这样就在两相间发生分配现象。
由于物质分配系数的不同，就逐渐在纸上集中于不同的部位。
在固定相中分配趋势较大的成份，随流动相移动的速度就慢；
反之，在流动相分配趋势较小的成分，移动速度就快。
物质在纸上移动的速度可以用Rf表示：
色斑中心至原点中心的距离
Rf=──────────────
溶剂前缘至原点中心的距离
物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也恒定，因此，可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。
纸层析法按操作方法分成两类，即：
垂直型和水平型。
垂直型是将滤纸条悬起，使流动相向上或向下扩散；
水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。
垂直型使用较广，按分配物质的多寡，将滤纸截成长条，在某一端距边缘2~4cm处点样，待干后，将点样端边缘与溶液接触，在密盖的玻璃缸内进行展开
见图6-0-1
图6-0-2垂直纸层析
上述方法只用一种溶剂系统进行一次展开，称为单向层析。
如果样品成分较多，而且彼此的Rf值相近，单向层析分离效果不佳，可用双向层析法，即在长方形或方形滤纸的一角点样，卷成圆筒形，先用第一种溶剂系统展开，展开完毕吹干后转90º
，再放于另一种溶剂系统中，向另一方向进行第二次展开，如此各成分分离较为清晰。
见图6-0-3
图6-0-3
（三）离子交换层析：
离子交换层析法（ionexchangechromatographyIEC）是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的，这种柱层析称为离子交换层析。
离子交换剂是通过化学反应将带电荷基团引入惰性支持物上而形成。
离子交换作用是指一溶剂中某一种离子与一固体中的另一种具有相同电荷的离子进行相互位置的调换。
由于各种离子所带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有所差别。
因此，在洗脱过程中，各种离子由固体柱上先、后下来的顺序不同，从而可达到分离的目的。
这种离子交换是定量完成的，因此测定溶液中由固体上交换下来的离子量，可知样品中原有离子的含量，也可将吸附在交换剂上的样品的成分用另一洗脱液洗脱下来，进行定量测定。
离子交换层析主要用于蛋白质、多肽的分离。
核酸也是强极性分子，用离子交换层析也能得到很好的分离效果。
离子交换剂种类很多，根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂；
根据惰性支持物不同，又有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶等种类。
目前大多采用的离子交换剂是合成离子交换剂，即离子交换树脂，其分为两大类：
分子中具有酸性基团，能交换阳离子的称为阳离子交换树脂；
分子中具有碱性基团，能交换阴离子的称为阴离子交换树脂。
按其解离性的大小，又可分为强弱两种：
磺酸基（－SO3H）
强酸性
阳离子交换树脂酚羟基（－OH）
弱酸性羧基（－COOH）
强碱性季胺基（－NR4）
阴离子交换树脂伯胺基（－NH2）
弱碱性仲胺基（－NHR）
叔胺基（－NR2）
交换反应举例如下：
R-SO3－H++M+X－
R-SO3－M＋+X－H+
R4≡N＋OH－+H＋X－
R4≡N＋X-+H＋OH-
离子交换树脂的交换容量与其结构有关，这直接关系到合成过程。
离子交换树脂主要是根据有机化学反应（如硝化、磺化、氯甲基化和胺化等）及高分子合成反应（如聚合及缩合）的基本原理进行合成的。
离子交换剂的母体聚合物有苯乙烯、酚醛及丙烯酸等。
常见的聚苯乙烯树脂由苯乙烯聚合，再加入二乙稀交联：
（方程式1）插入附件1
在这个母体上引进功能基就得到各种离子交换树脂，如制备强酸性阳离子树脂时，即将母体加以磺化：
（方程式2）插入附件2
制备强碱性阴离子交换树脂时，先将母体甲基化后，再加以胺化，即得：
（方程式3）插入附件3
这里，树脂中二乙烯苯的含量决定了树脂的交联度大小，应尽量选用交联度高些，而且有较高的交换容量的树脂。
树脂交换容量的单位为毫克当量/克（干树脂）或者毫克当量/毫升（湿树脂）。
测定树脂的交换容量方法：
阳离子交换树脂：
首先，用氢氧化钠溶液通过已转型为氢型的树脂，将H+替换出来，其反应式：
R－SO3H+NaCl
R－SO3Na+HCl
再用酸碱滴定法测定流出液中盐酸的当量数，即可计算交换容量，即：
HCl+NaOH→NaCl+H2O
而测定阴离子交换树脂交换容量的反应则为：
R4NOH+NaCl
R4NCl+NaOH
NaOH+HCl→NaCl+H2O
离子交换纤维素是30年来广泛用于分离纯化蛋白质的离子交换剂。
目前常用的离子交换纤维素列于下表：
（表1）目前常用的离子交换纤维素
离子交换剂
游离基团
结构
阴离子交换剂
强碱性
TEAE
GE
QAE-Sephadex
弱碱性
DEAE
PAB
中等碱性
AE
ECTEOLA
DBD
BND
PEL
三乙基氨基乙基
胍基乙基
二乙基（2-羟丙基）季胺
二乙基氨基乙基
对氨基苯甲基
氨基乙基
三乙醇胺经甘油和多聚甘油链偶联于纤维素的混合基团（混合胺类）
苯甲基化的DEAE纤维素
苯甲基化萘酰化的DEAE纤维素
聚乙烯亚胺吸附于纤维素或较弱磷酰化的纤维素
-OCH2CH2N（C2H5）3
NH
-OCH2CH2NHC---NH2
-C2H4N+（C2H5）2
CH2CHCH3
OH
-OCH2CH2N（C2H5）2
-OCH2CH2NH2
阳离子交换剂
CM
中等酸性
P
强酸性
SE
SP-Sephadex
羧甲基
磷酸
磺酸乙基
磺酸丙基
-OCH2COOH
O
-O--P—OH
-OCH2CH2--S—OH
-OC3H6--S—OH
常用离子交换树脂某些物理化学性质表
（表2）插入附件4---1、2、3
各类常用离子交换树脂型号对照表
（表3）插入附件5
离子交换介质在纯化步骤中的选择
（表4）插入附件6
离子交换层析介质的技术数据
（表5）插入附件7—1、2
（四）凝胶层析（分子筛层析）
凝胶层析（gelfiltration）又称分子筛层析、排阻层析或凝胶渗透色谱，主要是根据混合物中各种分子的分子量不同，通过固定相凝胶时，分子的扩散速度各异，使大小不同的分子得到分离和纯化。
它不仅用于大分子物质的分离，也可用于分子量测定以及蛋白质样品除盐等。
所谓凝胶是一类具有三维空间多孔性的网状结构物质。
在洗脱过程中，分子量最大的物质由于不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙而最先流出；
分子量最小的物质因能钻入网孔而受阻滞，流速缓慢，而最后流出；
分子量介于最大和最小之间的物质，流出的顺序在最大分子量物质之后，而在最小分子量物质之前。
所以，各组分的洗脱顺序与其分子量成正比。
（图6-0-4）插入附件8
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，是含有大量液体的柔软而富于弹性的物质。
吸水量大于7.5g/g的凝胶称软胶，吸水量小于7.5g/g的凝胶称为硬胶。
根据凝胶物质的来源可分为天然凝胶和人工合成凝胶两类。
１、天然凝胶：
主要是一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。
淀粉凝胶应用较早，但因其理化性质不够稳定，洗脱时的阻力较大，洗脱时间长等缺点影响了它的应用。
琼脂来源于一种海藻，是由D-半乳糖和L-半乳糖所组成的多聚糖。
它能分离分子量较高的物质。
其缺点是带有大量的电荷（主要是磺酸基，其次为羧基），层析时常需用较高离子强度的洗脱液，使洗脱物含有一定量盐分，而影响产品的纯度。
琼脂糖凝胶（sepharose）应用较多，它又称生物凝胶Ａ（biogel—A），由琼脂糖溶液冷却后，
通过分子间氢键，自发凝集成束，形成稳定的珠状凝胶。
稳定性较差，工作pH值范围在4~9之间，40℃以上易老化，不能高压和冰冻，其机械强度取决于琼脂糖的含量。
它有2B、4B、6B三个级别，含琼脂糖的浓度分别为2%、4%、6%。
Sepharose结构开放，排阻极限比Sephadex大，分离范围广泛，适用于DNA大片段分离。
各种型号琼脂糖凝胶的的性质及生产厂商见下表。
（表6）琼脂糖凝胶的技术数据
名称、型号
凝胶内琼脂糖%含量（W/W）
排阻的下限（Mr）
分级分离的范围（Mr）
生产厂商
Sagavac10
Sagavac8
Sagavac6
Sagavac4
Sagavac2
10
8
6
4
2
2.5×
105
7×
2×
106
15×
150×
1×
104∽2.5×
104∽7×
5×
104∽2×
105∽15×
107
SeravacLaboratories,Maidenhead,England
Bio-GelA-0.5M
Bio-GelA-1.5M
Bio-GelA-5M
Bio-GelA-15M
Bio-GelA-50M
Bio-GelA-150M
1
0.5×
1.5×
50×
<
4×
104∽15×
1×
106∽15×
Bio-PadLaboratories,California,U.S.A
2、人工合成的凝胶：
常用的有葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。
葡聚糖凝胶又称交联葡聚糖凝胶，英文名称为Dextrak，商品名称为Sephadex，由许多右旋葡萄糖单位通过1,6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷（CH2-CH-CH2CL，又称氯醇）交联而形成多孔网状结构高分子化合物。
其基本结
构如图：
（图5）插入附件9
在合成凝胶时，调节葡聚糖和交联剂的配比，可以获得具有不同大小网眼的葡聚糖凝胶。
G表示交联度，G越大，网孔结构越紧密，吸水性差，膨胀也小，适用于分离小分子物质；
G越小，网孔结构疏松，吸水量大，适用分离大分子物质。
商品凝胶的型号采用“吸水量”的10倍数字表示，例如，每g凝胶吸水量为2.5g即定为G—25型。
各种型号葡聚糖凝胶的性质见下表。
（表7）各种型号葡聚糖凝胶的性质
型号
分离范围（分子量）
吸水量
g/g干凝胶
膨胀体积
ml/g干凝胶
浸泡时间（小时）
蛋白质
多糖
20--250
90--1000
G--10
G—15
G—25
G—50
G—75
G—100
G—150
G—200
700
1500
1000∽5000
1500∽3000
3000∽70000
4000∽150000
5000∽400000
5000∽800000
100∽5000
500∽10000
1000∽50000
1000∽100000
1000∽150000
1000∽200000
1.0±
.01
1.5±
0.2
2.5±
5.0±
0.3
7.5±
0.5
10±
1.0
15±
1.5
20±
2.0
2∽3
2.5∽3.5
4∽6
9∽11
12∽15
15∽20
20∽30
30∽40
3
24
72
5
由上表可见，Sephadex—G值越大，吸水量越大，分离范围（分子量）越大
聚丙烯酰胺凝胶其商品名为生物凝胶P（Bio-GelP），是用丙稀酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（N，Nˊ—methylenebisacrylamide，简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
其结构式如下：
（方程式4）
张龙翔P90
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：
（1）化学聚合：
催化剂多采用过硫酸铵（ammoniumpersulfare，AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N，N，Nˊ，Nˊ—四甲基乙二胺（N，N，Nˊ，Nˊ—tetramethylethylenediamine，TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile,DMPN）。
在叔胺的催化下，由过硫酸胺形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。
因为叔胺要处于自由碱状态下才有效，所以在低pH时，常会延迟聚合作用。
分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用，一些金属也能抑制聚合。
冷却可以使聚合速度变慢，通常控制这些因素使聚合在一小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
（2）光聚合：
通常用核黄素作催化剂，不一定加TEMED即能聚合，但加入则可加速聚合。
光聚合通常需要有痕量氧存在，核黄素经光解形成无色基，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用，但过量的氧会阻止链长的增加，应该避免过量的氧存在。
光聚合通常用日光灯或普通钨丝灯泡作光源，直接日光或室内强散射光也可以。
用核黄素进行光聚合的优点是：
①核黄素的用量很低（1mg/100ml）；
②通过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔凝胶较适合。
化学聚合的凝胶孔径较小，因而采用过硫酸胺—TEMED催化系统制备小孔凝胶（分离胶），而且各次制备的重复性好。
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系：
凝胶浓度与被分离物的分子量大小的关系，大至范围如表：
（表8）Mr范围与凝胶浓度的关系
Mr的范围
适用的凝胶浓度%
蛋白质
<
104
1∽4×
4×
104∽1×
1∽5×
>
10∽15
5∽10
2∽5
核酸
104∽105
105∽2×
2∽2.6
聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性、透明、相对的化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
（表9）聚丙烯酰胺凝胶的技术数据
分级分离的范围
（Mr）
膨胀后的床体积
所需最少时间
（室温，小时）
Bio-gel-P-2
Bio-gel-P-4
Bio-gel-P-6
Bio-gel-P-10
Bio-gel-P-30
Bio-gel-P-60
Bio-gel-P-100
Bio-gel-P-150
Bio-gel-P-200
Bio-gel-P-300
1600
3600
4600
10000
30000
60000
100000
150000
200000
300000
200—2000
500---4000
1000---5000
5000---17000
20000---50000
30000---70000
40000---100000
50000---150000
80000---300000
100000---400000
3.8
5.8
8.8
12.4
14.9
19.0
24.0
34.0
40.0
2---4
10---12
48
下面几张表列出凝胶层析介质的一些性能指标，供读者参考。
表10各种凝胶所允许的最大操作压
凝胶
建议的最大静水压（cmH2O）**
Seohadex
G-10
G-15
G-25
G
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