分子水平与细胞水平对育种新技术.docx

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分子水平与细胞水平对育种新技术

猪分子育种新技术

摘要：

分子育种新技术对猪现代育种具有重要的作用。

本文主要从分子育种新技术对猪的育种展开综述。

关键词猪分子育种新技术

随着我国养猪产业化的兴起，对优良猪种的需求量逐年增加，而且也提出了更高的要求。

因此，必须集中人力、物力和财力，在原有的基础上，应用现代育种技术，包括生物技术、计算机技术、信息技术和系统工程技术等[1]，进行种猪的遗传改良，加快育种进展，提高选择效率，以不断满足猪种产业化的需求。

其中分子育种技术对猪的育种具有重要作用，因此本文主要从分子育种新技术对猪的育种展开综述。

1分子水平育种新技术

分子育种技术，就是将基因工程应用于育种工作中，通过分子水平的方法，从而培育出一定要求的新品种。

而猪分子育种方法主要是通过QTL与候选基因定位技术、标记辅助选择技术和导入育种目标基因的转基因与染色体技术等方法从群体或个体中筛选符合育种目标。

1.1QTL与候选基因定位技术

QTL与候选基因主要通过控制猪生长性状、胴体性状和繁殖性能等方面，控制猪的育种进展。

猪的产仔数、日增重、背膘厚和屠宰率等重要经济性状均为数量性状，受到多个微效基因控制，但在染色体上也存在对经济性状影响较大的染色体片段，即为QTL（QuantitativeTraitLoci，数量基因座）。

研究数量性状的关键是寻找、定位QTL，在此基础上确定主效基因（MajorGene）或QTN（QuantitativeTraitNucleotide）。

几乎在猪的所有染色体发现了影响生长性状、胴体性状和肉质性状的QTL[2-5]，也在好几条染色体发现了与繁殖性状相关的QTL。

但影响免疫反应和抗病力的QTL发现的很少[6]。

例如基因诊断盒技术，如恶性高温综合征（MHS或PSS），是猪应激或药物诱导性遗传缺陷,受常染色体单座位隐性基因（MHSn）控制，呈不完全隐性遗传。

利用基因定位技术，证实了PSS座位是位于第6号常染色体上的兰尼定受体基因突变造成。

兰尼定受体结构与功能的改变，导致猪应激时骨胳肌钙离子非正常释放而引起PSS的发生[7]。

同时影响育种的候选基因有很多，也主要通过影响生长性能，繁殖性能和胴体等。

例如影响繁殖性能主要候选基因是ESR、FSH、OPN、PRLR、RBP4、RARG、LHR、FSHR等基因。

利用Leptin基因进行单核苷酸多态性检测技术，发现其对产仔数的影响、利用FSH、ESR和PRLR基因相互间对繁殖性能的影响，发现多个基因聚合高于单个基因效应要好、还有研究者利用微阵列技术筛选对排卵差异表达基因，发现EarI多态位点与产仔数等的影响[8－10]。

而胴体候选基因主要影响包括胴体重、瘦肉率、膘厚、眼肌面积和肉质等指标[11－12]。

其中影响肉质除了终端的常规营养因素外，当前比较流行的是选种过程中：

氟烷敏感基因、RN基因、猪骨骼肌兰尼定受体（RYR1）基因等遗传基因的测定。

其中，氟烷敏感基因主要引起肉质下降，产生PSE肉[13]、而RN基因又称酸肉基因，是影响猪肉质加工性状RTN（Napoletechnologicalyield）的主效位点，主要存在于纯种汉普夏和有汉普夏血统的品系中[14-16]。

另外猪的生长性能的优劣直接影响了养猪的生产效率和经济效益，众多基因参与了猪的生长代谢、生长激素相关基因及其受体、生肌因子基因与猪的生长速度相关，瘦蛋白基因及其受体可能与脂肪积蓄相关。

此外脂肪酸结合蛋白基因、缩胆囊基因可能也与生长性状相关，在诸多可以作为候选基因的基因之中，IGF-2值得关注[17]，因为猪IGF2基因内含子3的3072位点来自父源A等位基因有助于后代猪群的体骼发育粗壮，并通过增加单个肌纤维面、眼肌面积和减少皮厚、背膘来影响猪整体肌肉含量和脂肪沉积等[18]。

1.2标记辅助选择技术

标记辅助选择是目前研究最多的方法，将分子生物技术和常规育种技术相结合，借助分子标记选择某一位点基因频率的过程。

随着猪基因组图谱的构建，人们对控制猪生产性能的基因了解逐步加深。

而各种分子标记的出现，使得人们可以将分子标记和多基因效应合并使用，即标记辅助选择（MAS）。

MAS可明显提高育种值的准确性和可靠性，尤其是对低遗传力和家系共同效应大的性状进行选择，其中有PCR技术、基因芯片技术、指纹技术、转基因标记技术和染色体标记技术等。

其中转基因标记与染色体标记技术与直接导入育种目标基因与染色体技术相似，在这一部分中不再讨论。

1.2.1PCR（DNA多聚酶链式反应）标记技术

PCR标记新技术是在原有PCR技术上，产生的多种新型分子标记，如扩增片断长度多态性（AFLP）、串联重复序列（VNTR）、单链构型多态性（PCR-SSCP）等。

单链构象多态性（singlestrandconformationpolymmorphism,SSCP）是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，根据短的单链DNA或RNA分子碱基序列不同形成的不同构象。

一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变，形成多态性[19]。

PCR-SSCP技术是PCR技术和SSCP技术的结合。

该技术是将PCR扩增产物经变性后，置于中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，空间构象不同的单链DNA会因其迁移率不同而得到分离[20]。

RAPD即随机扩增多态性DNA（RandomAm-plifiedPolymorphicDNA），是由Williams和Welsh在1990年各自独立发现的一种DNA多态检测技术[21－22]，主要可以检测任何（包括已知的和未知的）DNA位点上的多态性和突变[23]。

从而检测相应的遗传变异。

FQ-PCR技术是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，在PCR反应中加入非特异性的荧光染料或特异性荧光探针，根据荧光信号的增加和PCR产物的增加完全同步的原理，实现对目标物质量变的实时监测[24]。

扩增片段长度多态性（AFLP）技术是继RFLP、SSR、RAPD之后，近几年来发展最快的DNA分子技术，是由Zabean等1992年发明，并于1993年获得欧洲专利局专利。

AFLP为第三代分子标记，其原理是基于PCR技术选择性地扩增总基因组DNA的内切酶片段，在高分辨率的聚丙烯酞胺凝胶上电泳，产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图。

它在RFLP和RAPD的基础[发展起来的，是RFLP和RAPD的结合，但不是笼统的结合，它克服了二者各自的缺点，而集中了二者的长处，它既有RFLP的可靠性，也具有RAPD的方便性[25－28]。

另外还有基因打靶技术、转座子介导的转基因和慢病毒载体技术等，主要应用于系统发育研究、动植物物种鉴定、群体遗传分析、基因图谱构建、以及疾病诊断等诸多领域[29－31]。

1.2.2基因芯片技术

基因芯片（genechip）也叫DNA芯片（DNAchip）、DNA微阵列（DNAmicroarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotidear-ray），是指将大量的寡核苷酸片段或基因片段作为探针有规律地排列固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列。

样品DNA或RNA通过PCR扩增或体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后探针与标记的样品进行杂交，最后通过荧光检测系统对芯片进行扫描。

通过对杂交信号的强弱来实现对生物样品快速、并行、高效地检测序列及其他生物信息[33－35]。

1.2.3微卫星DNA指纹技术

微卫星DNA指纹技术被用作遗传标记的串联重复序列一种为小卫星序列，重复单位长度一般为11~70bp，另一种为微卫星序列,重复单位长度一般为2~6bp。

用小卫星或微卫星产生的杂交图谱象人的指纹一样具有个体特异性，故取名为DNA指纹图。

通过对微卫星序列的克隆、测序已分析筛选出基因组内的多数微卫星序列[36－37]。

。

如用DNA指纹图分析了3个品种猪，其品种内和品种间的遗传变异性。

这些均是应用微卫星位点的多态性及高突变率测定群体间的遗传相关性[38]。

1.3转基因技术

转基因技术（导入育种目标基因的转基因技术）主要有原核显微注射法、逆转录病毒载体法、胚胎干细胞介导法、精子介导法和原生殖细胞法等。

转基因动物技术是指将已知的外源基因移入动物细胞并整合到基因组中，从而使其得以表达技术，基因组中整合有外源基因的动物称为转基因动物。

转基因动物技术的应用，可以改造动物自身的基因组，从而推动动物育种进入一个更高层次的育种阶段。

导入育种目标基因的转基因技术育种，其主要目标是提高动物的遗传本质，运用该技术育种可以打破物种界限，突破亲缘关系的限制，培育出自然界和常规育种难以产生的具有特别优良性状的动物品种，能够有效提高畜禽生产率，并改善畜禽生产性能和品质，给物种改良或动物改造带来极大的机遇[32]。

例如在染色体里植入特异的产生RNA的基因如内源性逆转录病毒（Porcineendogenousretroviruses,PERV）基因等[39]，通过RNA干扰能特异抑制病毒基因表达，使之保持在静止或休眠状态，并能同时抑制多个基因而互不干扰。

此外，RNA干扰的序列识别的特异性可以精确到一个碱基，产生准确有效的封闭效果，从而培育出抗病毒感染猪群。

锌指核酸酶介导的敲除或转基因技术（zinc-fingernucleases,ZFNs），其目的是提高外源基因的高效定点整合：

由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。

DNA识别域是由一系列锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。

锌指核酸酶能识别特异的DNA序列，并在此特异位点产生一个DNA双链切口，而后细胞固有的DNA修复机制通过同源重组或非同源末端连接将切口修复，从而达到DNA靶向修饰的目的[40－41]。

1.4染色体技术

染色体技术（导入育种目标染色体的染色体技术）主要包括同源重组技术、染色体分析技术和导入技术等。

随着染色体技术的不断发展，畜禽的染色体研究被广泛地应用到遗传育种工作中，其具有的作用有：

染色体畸变可影响到家畜的生产性能，尤其是繁殖性能。

因此在选种时，对留种的家畜除进行系谱检查、外貌评定、生产力评定等项目外，还应进行细胞遗传学检查。

畜遗传性的不孕、不育和胚胎早期死亡都与染色体异常有关。

通过超显微切割染色体技术和染色体荧光原位杂交（FISH）等技术，提供染色体区带特异性的探针，结合DNA大片段技术和构建cDNA克隆库技术的应用，可以很方便地找出任一染色体区带中基因编码序列，分析这些序列与这些区带有关的表型，以此确定功能基因[42－45]。

例如染色体的同源重组技术，对细胞染色体基因组中某一特珠基因进行定向操作，以便借助转基因动物手段来精确研究基因结构与功能及表达调控的技术。

同源重组技术可用来定向改变细胞或者生物个体遗传信息，可以对生物体基因组进行基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状[46]。

例如用化学方法合成了该基因组所有的DNA片段，然后借助特定载体，将染色本导入到生物体内已经获得了成功[47－49]。

2总结

猪的育种工作是一个复杂的工程。

随着市场需求的变化，育种目标也将不断变化。

而育种目标的改变一定程度上会使育种技术发生改变。

因此在未来的猪育种不仅是技术（分子育种技术）的问题，而是多部门参加的、多种技术应用和育种学家实践经验的有机整合，因此在未来育种过程中，除了利用更实用，更经济，更准确等的分子育种技术外，还应注意各方面的有机统一。

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附录1