基础生化 生物氧化.docx

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基础生化生物氧化

第五章生物氧化

第一节生物氧化概述

一、生物氧化的基本概念

机体内进行的脱氢，加氧等氧化反应总称为生物氧化，按照生理意义不同可分为两大类，一类主要是将代谢物或药物和毒物等通过氧化反应进行生物转化，这类反应不伴有ATP的生成；另一类是糖、脂肪和蛋白质等营养物质通过氧化反应进行分解，生成H2O和CO2，同时伴有ATP生物能的生成，这类反应进行过程中细胞要摄取O2，释放CO2故又形象地称之为细胞呼吸（cellularrespiration）。

代谢物在体内的氧化可以分为三个阶段，首行是糖、脂肪和蛋白质经过分解代谢生成乙酰辅酶A中的乙酰基；接着乙酰辅酶A进入三羧酸循环脱氢，生成CO2并使NAD+和FAD还原成NADH+H+、FADH2；第三阶段是NADH+H+和FADH2中的氢经呼吸链将电子传递给氧生成水，氧化过程中释放出来的能量用于ATP合成。

从广义来讲，上述三个阶段均为生物氧化，狭义地说只有第三个阶段才算是生物氧化，这是体内能量生成的主要阶段。

二、生物氧化的特点

体内大部分物质都可进行氧化反应，在生物体内进行的氧化反应与体外氧化反应有许多共同之处：

它们都遵循氧化反应的一般规律，常见的氧化方式有脱电子、脱氢和加氧等类型；最终氧化分解产物是CO2和H2O，同时释放能量。

但是生物氧化反应又有其特点：

1）体外氧化反应主要以热能形式释放能量；而生物氧化主要以生成ATP方式释放能量，为生物体所利用。

2）其最大区别在于：

体外氧化往往在高温，强酸，强碱或强氧化剂的催化下进行；而生物氧化是在恒温（37℃）和中性pH环境下进行，催化氧化反应的催化剂是酶。

三、生物氧化进行的部位

在真核细胞内，线粒体是生物氧化的主要场所；没有线粒体的原核细胞，呼吸链组分与合成ATP的酶分布在细胞质膜上。

四、生物氧化中CO2和H2O的生成

1、CO2的生成

糖、脂、蛋白质等有机物转变成含羧基的中间化合物，然后在酶催化下脱羧而生成CO2。

脱羧类型：

直接脱羧、氧化脱羧。

2、H2O的生成

代谢物在脱氢酶催化下脱下的氢由相应的氢载体（NAD+、NADP+、FAD、FMN等）所接受，再通过一系列递氢体或递电子体传递给氧而生成H2O。

五、生物氧化酶类

体内催化氧化反应的酶有许多种，按照其催化氧化反应方式不同可分为三大类。

（一）脱氢氧化酶类

这一类中依据其反应受氢体或氧化产物不同，又可以分为三种。

1.氧化酶类（oxidases）

氧化酶直接作用于底物，以氧作为受氢体或受电子体，生成产物是水。

氧化酶均为结合蛋白质，辅基常含有Cu2+，如细胞色素氧化酶、酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶等。

抗坏血酸氧化酶可催化下述反应：

2.需氧脱氢酶类（aerobicdehydrogenases）

需氧脱氢酶以FAD或FMN为辅基，以氧为直接受氢体，产物为H2O2或超氧离子（O2），某些色素如甲烯蓝（methyleneblue,MB）、铁氰化钾（［K3Fe（CN）6］、二氯酚靛酚可以作为这类酶的人工受氢体。

如D-氨基酸氧化酶（辅基FAD）、L-氨基酸氧化酶（辅基FMN）、黄嘌呤氧化酶（辅基FAD）、醛脱氢酶（辅基FAD）、单胺氧化酶（辅基FAD）、二胺氧化酶等。

粒细胞中NADH氧化酶和NADPH氧化酶也是需氧脱氢酶，它们催化下述反应：

超氧离子在超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）催化下生成H2O2与O2：

3.不需氧脱氢酶类（anaerobicdehydrogenases）

这是人体内主要的脱氢酶类，其直接受氢体不是O2，而只能是某些辅酶（NAD+、NADP+）或辅基（FAD、FMN），辅酶或辅基还原后又将氢原子传递至线粒体氧化呼吸链，最后将电子传给氧生成水，在此过程中释放出来的能量使ADP磷酸化生成ATP，如3-磷酸甘油醛脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素体系等。

（二）加氧酶类（oxygenases）

顾名思义，加氧酶催化加氧反应。

根据向底物分子中加入氧原子的数目，又可分为加单氧酶（monooxygenase）和加双氧酶（dioxygenase）。

1.加单氧酶　

又称为多功能氧化酶、混合功能氧化酶（mixedfunctionoxidase）、羟化酶（hydroxylase）。

加单氧酶催化O2分子中的一个原子加到底物分子上使之羟化，另一个氧原子被NADPH+H+提供的氢还原生成水，在此氧化过程中无高能磷酸化合物生成，反应如下：

加单氧酶实际上是含有黄素酶及细胞色素的酶体系，常常是由细胞色素P450、NADPH细胞色素P450还原酶、NADPH和磷脂组成的复合物。

细胞色素P450是一种以血色素为辅基的b族细胞色素，其中的Fe3+可被Na2S2O3等还原为Fe2+，还原型的细胞色素P450与CO结合后在450nm有最大吸收峰，故名细胞色素P450，它的作用类似于细胞色素aa3，能与氧直接反应，将电子传递给氧，因此也是一种终末氧化酶。

加单氧酶主要分布在肝、肾组织微粒体中，少数加单氧酶也存在于线粒体中，加单氧酶主要参与类固醇激素（性激素、肾上腺皮质激素）、胆汁酸盐、胆色素、活性维生素D的生成和某些药物、毒物的生物转化过程。

加单氧酶可受底物诱导，而且细胞色素P450基质特异性低，一种基质提高了加单氧酶的活性便可同时加快几种物质的代谢速度，这与体内的药物代谢关系十分密切，例如以苯巴比妥作诱导物，可以提高机体代谢胆红素、睾酮、氢化可地松、香豆素、洋地黄毒苷的速度，临床用药时应予考虑。

2.加双氧酶　

此酶催化O2分子中的两个原子分别加到底物分子中构成双键的两个碳原子上，如色氨酸吡咯酶（色氨酸加双氧酶）、胡萝卜素加双氧酶分别催化下述反应：

（三）过氧化氢酶和过氧化物酶

前已叙及需氧脱氢酶和超氧化物歧化酶催化的反应中有H2O2生成。

过氧化氢具有一定的生理作用，粒细胞和吞噬细胞中的H2O2可杀死吞噬的细菌，甲状腺上皮细胞和粒细胞中的H2O2可使I氧化生成I2，进而使蛋白质碘化，这与甲状腺素的生成和消灭细菌有关。

但是H2O2也可使巯基酶和蛋白质氧化失活，还能氧化生物膜磷脂分子中的多不饱和脂肪酸，损伤生物膜结构、影响生物膜的功能，此外H2O2还能破坏核酸和粘多糖。

人体某些组织如肝、肾、中性粒细胞及小肠粘膜上皮细胞中的过氧化物酶体内含有过氧化氢酶（触酶）和过氧化物酶，可利用或消除细胞内的H2O2和过氧化物，防止其含量过高而起保护作用。

1.过氧化氢酶（Catalase）

此酶催化两个H2O2分子的氧化还原反应，生成H2O并释放出O2。

过氧化氢酶的催化效率极高，每个酶分子在0℃每分钟可催化264万个过氧化氢分子分解，因此人体一般不会发生H2O2的蓄积中毒。

2.过氧化物酶（Peroxidase）

此酶催化H2O2或过氧化物直接氧化酚类或胺类物质。

R+H2O2——→RO+H2O或RH2+H2O2——→R+2H2O

某些组织的细胞中还有一种含硒（Se）的谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase），可催化下述反应：

H2O2+2G-SH——→2H2O+GSSG

ROOH+2G-SH——→ROH+GSSG+H2O

生成的GSSG又可在谷胱甘肽还原酶催化下由NADPH+H+供氢还原生成G-SH：

临床工作中判定粪便、消化液中是否有隐血时，就是利用血细胞中的过氧化物酶活性将愈创木酯或联苯胺氧化成蓝色化合物。

第二节电子传递和氧化呼吸链

呼吸链（respiratorychain）是由一系列的递氢体（hydrogentransfer）和递电子体（eletrontransfer）按一定的顺序排列所组成的连续反应体系，它将代谢物脱下的成对氢原子交给氧生成水，同时有ATP生成。

实际上呼吸链的作用代表着线粒体最基本的功能，呼吸链中的递氢体和递电子体就是能传递氢原子或电子的载体，由于氢原子可以看作是由H+和e组成的，所以递氢体也是递电子体，递氢体和递电子体的本质是酶、辅酶、辅基或辅因子。

真核生物电子传递链定位于线粒体内膜上；原核生物定位于质膜上。

一、呼吸链的递氢体和递电子体

构成呼吸链的递氢体和递电子体主要分为以下五类：

1.尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）或称辅酶I（CoI）。

为体内很多脱氢酶的辅酶，是连接作用物与呼吸链的重要环节，分子中除含尼克酰胺（维生素PP）外，还含有核糖、磷酸及一分子腺苷酸（AMP），其结构如下：

NAD+的主要功能是接受从代谢物上脱下的2H（2H++2e），然后传给另一传递体黄素蛋白。

在生理pH条件下，尼克酰胺中的氮（吡啶氮）为五价的氮，它能可逆地接受电子而成为三价氮，与氮对位的碳也较活泼，能可逆地加氢还原，故可将NAD+视为递氢体。

反应时，NAD+的尼克酰胺部分可接受一个氢原子及一个电子，尚有一个质子（H+）留在介质中。

此外，亦有不少脱氢酶的辅酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+），又称辅酶Ⅱ（CoⅡ），它与NAD+不同之处是在腺苷酸部分中核糖的2′位碳上羟基的氢被磷酸基取代而成（如下图）。

当此类酶催化代谢物脱氢后，其辅酶NADP+接受氢而被还原生成NADPH+H+，它须

经吡啶核苷酸转氢酶（pyridinenucleotidetranshydrogenase）作用将还原当量转移给NAD+，然后再经呼吸链传递，但NADPH+H+一般是为合成代谢或羟化反应提供氢。

2.黄素蛋白（flavoproteins）

黄素蛋白种类很多，其辅基有两种，一种为黄素单核苷酸（FMN），另一种为黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），两者均含核黄素（维生素B2），此外FMN尚含一分子磷酸，而FAD则比FMN多含一分子腺苷酸（AMP），其结构如下：

在FAD、FMN分子中的

咯嗪部分可以进行可逆的脱氢加氢反应（如下图）。

FAD或FMN与酶蛋白部分之间是通过非共价键相连，但结合牢固，因此氧化与还原（即电子的失与得）都在同一个酶蛋白上进行，故黄素核苷酸的氧化还原电位取决于和它们结合的蛋白质，所以有关的标准还原电位指的是特定的黄素蛋白，而不是游离的FMN或FAD；在电子转移反应中它们只是在黄素蛋白的活性中心部分，而其本身不能作为作用物或产物，这和NAD+不同，NAD+与酶蛋白结合疏松，当与某酶蛋白结合时可以从代谢物接受氢，而被还原为NADH，后者可以游离，再与另一种酶蛋白结合，释放氢后又被氧化为NAD+。

多数黄素蛋白参与呼吸链组成，与电子转移有关，如NADH脱氢酶（NADHdehydrogenase）以FMN为辅基，是呼吸链的组分之一，介于NADH与其它电子传递体之间；琥珀酸脱氢酶，线粒体内的甘油磷酸脱氢酶（glycerolphosphatedehydrogenase）的辅基为FAD，它们可直接从作用物转移还原当量H++ereducingequivalent）到呼吸链，此外脂肪酰CoA脱氢酶与琥珀酸脱氢酶相似，亦属于FAD为辅基的黄素蛋白类，也能将还原当量从作用物传递进入呼吸链，但中间尚需另一电子传递体称为电子转移黄素蛋白（electrontransferringflavoprotein,ETFP，辅基为FAD）参与才能完成。

3.铁硫蛋白（ironsulfurproteins,Fe-S）

又称铁硫中心，其特点是含铁原子。

铁是与无机硫原子或是蛋白质肽链上半胱氨酸残基的硫相结合，常见的铁硫蛋白有三种组合方式（a）单个铁原子与4个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。

（b）两个铁原子、两个无机硫原子组成（2Fe-2S），其中每个铁原子还各与两个半胱氨酸残基的巯基硫相结合。

（c）由4个铁原子与4个无机硫原子相连（4Fe-4S），铁与硫相间排列在一个正六面体的8个顶角端；此外4个铁原子还各与一个半胱氨酸残基上的巯基硫相连。

铁硫蛋白中的铁可以呈两价（还原型），也可呈三价（氧化型），由于铁的氧化、还原而达到传递电子作用。

在呼吸链中它多与黄素蛋白或细胞色素b结合存在。

4.泛醌（ubiquinone,UQ或Q）

亦称辅酶Q（coenzymeQ），为一脂溶性苯醌，带有一很长的侧链，是由多个异戊二烯（isoprene）单位构成的，不同来源的泛醌其异戊二烯单位的数目不同，在哺乳类动物组织中最多见的泛醌其侧链由10个异戊二烯单位组成。

泛醌接受一个电子和一个质子还原成半醌，再接受一个电子和质子则还原成二氢泛醌，后者又可脱去电子和质子而被氧化恢复为泛醌。

5.细胞色素体系

1926年Keilin首次使用分光镜观察昆虫飞翔肌振动时，发现有特殊的吸收光谱，因此把细胞内的吸光物质定名为细胞色素。

细胞色素是一类含有铁卟啉辅基的色蛋白，属于递电子体。

线粒体内膜中有细胞色素b、c1、c、aa3，肝、肾等组织的微粒体中有细胞色素P450。

细胞色素b、c1、c为红色细胞素，细胞色素aa3为绿色细胞素。

不同的细胞色素具有不同的吸收光谱，不但其酶蛋白结构不同，辅基的结构也有一些差异。

细胞色素c为一外周蛋白，位于线粒体内膜的外侧。

细胞色素C比较容易分离提纯，其结构已清楚。

哺乳动物的Cyt-c由104个氨基酸残基组成，并从进化的角度作了许多研究。

Cyt-c的辅基血红素（亚铁原卟啉）通过共价键（硫醚键）与酶蛋白相连（见下图），其余各种细胞色素中辅基与酶蛋白均通过非共价键结合。

细胞色素a和a3不易分开，统称为细胞色素aa3。

和细胞色素P450、b、c1、c不同，细胞色素aa3的辅基不是血红素，而是血红素A。

细胞色素aa3可将电子直接传递给氧，因此又称为细胞色素氧化酶。

铁卟啉辅基所含Fe2+可有Fe2+←→Fe3++e的互变，因此起到传递电子的作用。

铁原子可以和酶蛋白及卟啉环形成6个配位键。

细胞色素aa3和P450辅基中的铁原子只形成5个配位键，还能与氧再形成一个配位键，将电子直接传递给氧，也可与CO、氰化物、H2S或叠氮化合物形成一个配位键。

细胞色素aa3与氰化物结合就阻断了整个呼吸链的电子传递，引起氰化物中毒。

二、电子传递链的组成和电子传递顺序

在生物细胞中，接受代谢物上脱下的氢（或电子）的载体有三种——NAD+、NADP+和FAD+。

其中NADPH不进入呼吸链合成ATP，而是作为生物合成的还原剂；只有NADH和FADH2进入呼吸链。

所以呼吸链有两条：

NADH呼吸链——由NADH开始的呼吸链；

FADH2呼吸链——由FADH2开始的呼吸链。

呼吸链中的电子传递有着严格的方向和顺序，即电子从氧化还原电位较低的传递体依次通过氧化还原电位较高的传递体逐步流向氧分子。

1.NADH氧化呼吸链　

人体内大多数脱氢酶都以NAD+作辅酶，在脱氢酶催化下底物SH2脱下的氢交给NAD+生成NADH+H+，在NADH脱氢酶作用下，NADH+H+将两个氢原子传递给FMN生成FMNH2，再将氢传递至CoQ生成CoQH2，此时两个氢原子解离成2H++2e,2H+游离于介质中，2e经Cyt-b、c1、c、aa3传递，最后将2e传递给1/2O2，生成O2-,O2与介质中游离的2H+结合生成水，综合上述传递过程可用下图表示。

2.琥珀酸氧化呼吸链　

琥珀酸在琥珀酸脱氢酶作用下脱氢生成延胡索酸，FAD接受两个氢原子生成FADH2，然后再将氢传递给CoQ，生成CoQH2，此后的传递和NADH氧化呼吸链相同，整个传递过程可用下图表示。

三、胞浆中NADH的转移

体内很多物质氧化分解产生NADH，反应发生在线粒体内，则产生的NADH可直接通过呼吸链进行氧化磷酸化，但亦有不少反应是在线粒体外进行的，如3-磷酸甘油醛脱氢反应，乳酸脱氢反应及氨基酸联合脱氨基反应等等。

由于所产生的NADH存在于线粒体外，而真核细胞中，NADH不能自由通过线粒体内膜，因此，必须借助某些能自由通过线粒体内膜的物质才能被转入线粒体，这就是所谓穿梭机制，体内主要有两种穿梭机制。

1.苹果酸穿梭（malateaspartateshuttle）：

这种穿梭机制主要在肝、肾、心中发挥作用，其穿梭机制比较复杂，不仅需借助苹果酸、草酸乙酸的氧化还原，而且还要借助α酮酸与氨基酸之间的转换，才能使胞液中来的NADH的还原当量转移进入线粒体氧化，具体过程如下图：

当胞液中NADH浓度升高时，首先还原草酰乙酸成为苹果酸，此反应由苹果酸脱氢酶催化，胞液中增多的苹果酸可通过内膜上的二羧酸载体系统与线粒体内的α酮戊二酸交换；进入线粒体的苹果酸，经苹果酸脱氢酶催化又氧化生成草酰乙酸并释出NADH，还原当量从复合体I进入呼吸链经CoQ、复合体Ⅲ、Ⅳ传递，最后给氧，产生2.5ATP，与在线粒体内产生的NADH氧化相同。

与此同时线粒体内的α酮戊二酸由于与苹果酸交换而减少，需要补充，于是在转氨酶作用下由谷氨酸与草酰乙酸进行转氨基反应，生成α酮戊二酸和天冬氨酸，天冬氨酸借线粒体膜上的谷氨酸天冬氨酸载体转移系统与胞液的谷氨酸交换，从而补充了线粒体内谷氨酸由于转氨基作用而造成的损失，进入胞液的天冬氨酸再与胞液中α酮戊二酸进行转氨基，重新又产生草酰乙酸以补充最初的消耗，从而完成整个穿梭过程。

2.α—磷酸甘油穿梭（glycerolα-phosphateshuttle）

该穿梭机制主要在脑及骨骼肌中，它是借助于α-磷酸甘油与磷酸二羟丙酮之间的氧化还原转移还原当量，使线粒体外来自NADH的还原当量进入线粒体的呼吸链氧化，当胞液中NADH浓度升高时，胞液中的磷酸二羟丙酮首先被NADH还原成α磷酸甘油（3－磷酸甘油），反应由甘油磷酸脱氢酶（辅酶为NAD+）催化，生成的α磷酸甘油可再经位于线粒体内膜近外侧部的甘油磷酸脱氢酶催化氧化生成磷酸二羟丙酮。

线粒体与胞液中的甘油磷酸脱氢酶为同工酶，两者不同在于线粒体内的酶是以FAD为辅基的脱氢酶，而不是NADH+，FAD所接受的质子、电子可直接经泛醌、复合体Ⅲ、Ⅳ传递到氧，这样线粒体外的还原当量就被转运到线粒体氧化了，但通过这种穿梭机制果只能生成1.5分子ATP而不是2.5分子ATP。

第三节　ATP的生成、储存和利用

ATP为一游离核苷酸，由腺嘌呤、核糖与三分子磷酸构成（见下图），磷酸与磷酸间借磷酸酐键相连，当这种高能磷酸化合物水解时（磷酸酐键断裂）自由能变化（G）为30.5KJ/mol，而一般的磷酸酯水解时（磷酸酯键断裂）自由能的变化只有8至12KJ/mol，因此曾称此磷酸酐键为高能磷酸键，但实际上这样的名称是不够确切的，因为一种化合物水解时释放自由能的多少取决于该化合物整个分子的结构，以及反应的作用物自由能与产物自由能的差异，而不是由哪个特殊化学键的破坏所致，但为了叙述及解释问题方便，高能磷酸键的概念至今仍被生物化学界采用。

ATP是一高能磷酸化合物，当ATP水解时首先将其分子的一部分，如磷酸（Pi）或腺苷酸（AMP）转移给作用物，或与催化反应的酶形成共价结合的中间产物，以提高作用物或酶的自由能，最终被转移的AMP或Pi将被取代而放出，ATP多以这种通过磷酸基团等转移的方式，而非单独水解的方式，参加酶促反应提供能量，用以驱动需要加入自由能的吸能反应，ATP水解反应的总结如下：

ATP——→ADP+Pi

或ATP——→AMP+PPi（焦磷酸）

ATP几乎是生物组织细胞能够直接利用的唯一能源，在糖、脂类及蛋白质等物质氧化分解中释放出的能量，相当大的一部分能使ADP磷酸化成为ATP，从而把能量保存在ATP分子内。

一、ATP的生成方式

1.底物水平磷酸化（substratelevelphosphorylation）　

底物分子中的能量直接以高能键形式转移给ADP生成ATP，这个过程称为底物水平磷酸化，这一磷酸化过程在胞浆和线粒体中进行，包括有：

2.氧化磷酸化（oxidativephosphorylation）　

氧化和磷酸化是两个不同的概念。

氧化是底物脱氢或失电子的过程，而磷酸化是指ADP与Pi合成ATP的过程。

在结构完整的线粒体中氧化与磷酸化这两个过程是紧密地偶联在一起的，即氧化释放的能量用于ATP合成，这个过程就是氧化磷酸化，氧化是磷酸化的基础，而磷酸化是氧化的结果。

机体代谢过程中能量的主要来源是线粒体，既有氧化磷酸化，也有底物水平磷酸化，以前者为主要来源。

胞液中底物水平磷酸化也能获得部分能量，实际上这是酵解过程的能量来源。

对于酵解组织、红细胞和组织相对缺氧时的能量来源是十分重要的。

二、氧化磷酸化的作用机制

（一）P/0比　

当一对电子经呼吸链传给O2的过程中所产生的ATP的分子数。

即消耗的无机磷酸的磷原子数与消耗的分子氧的氧原子数之比。

（二）氧化磷酸化中ATP生成的结构基础

ATP是由位于线粒体内膜上的ATP合成酶催化ADP与Pi合成的。

ATP合成酶是一个大的膜蛋白质复合体，分子量在48000kD，是由两个主要组成（或称因子）构成，一是疏水的F0，另一是亲水的F1，又称F0F1复合体。

在电子显微镜下观察线粒体时，可见到线粒体内膜基质侧有许多球状颗粒突起，这就是ATP合成酶，其中球状的头与茎是F1部分，分子量为350—380kD，由α3、β3、γ、δ、ε等9种多肽亚基组成，β与α亚基上有ATP结合部位；γ亚基被认为具有控制质子通过的闸门作用；δ亚基是F1与膜相连所必需，其中中心部分为质子通路；ε亚基是酶的调节部分，F0是由3个大小不一的亚基组成，其中有一个亚基称为寡霉素敏感蛋白质（oligomycinsensitivityconferringprotein,OSCP），此外尚有一个蛋白质部分为分子量28kD的因子，F0主要构成质子通道（见下图）。

（三）氧化磷酸化的偶联机制

有关氧化磷酸化的偶联机理已经作了许多研究，目前氧化磷酸化的偶联机理还不完全清楚，50年代Slater及Lehninger提出了化学偶联学说，1964年Boear又提出了构象变化偶联学说，这两种学说的实验依据不多，支持这两种观点的人已经不多了。

目前多数人支持化学渗透学说（chemiosmotichypothesis），这是英国生化学家P.Mitchell于1961年提出的，当时没有引起人们的重视，1966年他根据逐步积累的实验证据和生物膜研究的进展，逐步地完善了这一学说。

氧化磷酸化的化学渗透学说的基本观点是：

1.线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放H+是偶联的，即呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的H+逆浓度梯度泵出线粒体内膜，这一过程的分子机理还不十分清楚（见下图）。

2.H+不能自由透过线粒体内膜，结果使得线粒体内膜外侧H+浓度增高，基质内H+浓度降低，在线粒体内膜两侧形成一个质子跨膜梯度，线粒体内膜外侧带正电荷，内膜内侧带负电荷，这就是跨膜电位△ψ。

由于线粒体内膜两侧H+浓度不同，内膜两侧还有一个pH梯度△pH，膜外侧pH较基质pH约低1.0单位，底物氧化过程中释放的自由能就储存于△ψ和△pH中，若以△P表示总的质子移动力，那么三者的关系可用下式表示：

△P=△ψ-59△pH

3.线粒体外的H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H+浓度梯度进入线粒体基质中，这相当于一个特异的质子通道，H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATP的合成，寡霉素能与OSCP结合，特异阻断这个H+通道，从而抑制ATP合成。

有关ATP合成的分子机制目前还不十分清楚。

4.解偶联剂的作用是促进H+被动扩散通过线粒体内膜，即增强线粒体内膜对H+的通透性，解偶联剂能消除线粒体内膜两侧的质子梯度，所以不能再合成ATP。

总之，化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H+的跨膜梯度。

每对H+通过复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ从线粒体